第二章 菌种生产

一级菌种制作技术 —菌种分离
（三）菌种分离的设备 1．接种箱：操作规程 2．净化工作台：操作规程 3．接种室：操作规程 （四）菌种分离的方法 食用菌的分离方法很多，常用的有组织 分离法、孢子分离法和基内菌丝分离法三 种。
一级菌种制作技术 —菌种分离
（四）菌种分离的方法 1．组织分离法 ． （1）概念 将食用菌的部分组织移接到斜面培养基上获得纯培养的方法。 （2）特点： ① 属于无性繁殖，能保持原有菌株的优良种性，是获得纯 菌种的常用方法，且简单易行。 ② 适用于大型肉质子实体，适用于孢子不易萌发的菌类。 ③ 若种菇感染病毒，不易脱毒。 （3）操作过程（以伞菌类为例） 种菇选择—种菇消毒—切取组织块—移接组织块至斜面 中央—培养（25℃左右）
一级菌种制作技术 —出菇鉴定（试验）
概念：是菌种投入生产前必须做的结实 性鉴定试验。 目的：进一步确定菌种，以避免菌种选 育不当而造成不可估量的损失。 内容：包括生产性状、商品性状、遗传 性状三个方面。
一级菌种制作技术 —扩大培养（转管）
一级菌种的扩大培养是在试管间进行的，因此又叫转管。 转管原因：从外地购进或分离获得的母种数量有限，不能满足生产的需要 时，要对初次获得的母种进行扩大繁殖，以增加母种数量。 转管数量：一支母种可接15～20支试管斜面，扩大的数量根据实际情况而 定。 注意事项：母种的扩大繁殖不可无限制地移代，移代过多菌种生活力减弱， 从而影响大面积栽培的生产效益。 操作过程： (1) 左手拿两支试管，一支为经灭菌的斜面，另一支为已长好的菌种。 右手拿接种钩(已在火焰上灼烧灭菌又冷却)，并同时用右手轻轻拔下两支试 管的棉塞或试管帽。 (2) 将试管口通过火焰数次，并稍转动，以防环境中的微生物落入。 (3) 首先将接种钩伸入有菌试管，连同培养基钩取直径为3～5mm的菌 丝块，取出接种钩，迅速伸入另一灭菌斜面上并将菌丝块放在斜面的中央。 (4) 烧试管口，塞好棉塞或盖好试管帽，如用胶塞，则不要烧试管口。 将接种钩烧一下，插到酒精瓶中。
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一级菌种制作技术 —菌种的纯化
2．污染物的排除 在菌种分离后，细菌、霉菌的污染时有发生，必须加 以排除。 一般来讲，被杂菌污染的菌株不再使用。但有时由于 菌种紧缺，并且污染物不多，也可用灭菌滤纸浸在1％的 多菌灵溶液中，然后取出覆盖于霉菌的生长点上，以防止 分生孢子的扩散，然后用接种铲切取一小块远离杂菌的健 壮菌丝移至新的斜面培养基上培养。如果是细菌污染，细 菌的菌落比较局限，并不会出现细胞飞扬现象，因此，可 以先用接种铲将细菌菌落连同培养基一起取出来，再从无 菌部位取菌丝块转管一次，同样可以获得纯菌种。
一级菌种制作技术 —菌种的纯化
一级菌种的纯化：是指对分离获得的菌种进行 再提纯，成为生产所需要的菌种的方法。 1．菌丝的再提纯 再提纯时，可选用菌落生长速度较为一致的菌 丝体作为再提纯对象，用消毒的接种铲切取菌丝的 前端部分（连同培养基一起），转移到新的培养基 上培养。如果菌丝生长稀疏，也可采用单根菌丝分 离法。经过几次的切割移植，逐渐挑选生长良好的 无杂菌菌株，从而获得纯菌种。
消毒灭菌设备：小型高压灭菌锅（母种生产） 消毒灭菌设备：小型高压灭菌锅（母种生产）； 立式高压灭菌锅（原种生产） 立式高压灭菌锅（原种生产）；卧式高压灭菌锅 栽培种生产） 常压灭菌锅（栽培种生产） （栽培种生产）；常压灭菌锅（栽培种生产）。 用于培养基灭菌，无菌水制作等。 用于培养基灭菌，无菌水制作等。
接种设备 接种箱，超净工作台 接种工具：接种铲、接种锄、接种钩
培养设备 恒温培养箱；生化培养箱 培养室
菌种制作技术
母种制作技术 培养基：常用PDA培养基，有特殊需要时，可用 玉米水，麦麸水，或在PDA中加入1%-3%的蛋白胨。 制种过程 培养基的配制 分装 培养基灭菌 转管扩大 培养 母种
母种常用培养基配方 1 ． PDA 培 养 基 配 方 ： 马 铃 薯 （ 去 皮 ） 200g ； 蔗 糖 20g；琼脂18～20g；自来水1000ml；此培养基适合绝大 多数可栽培种类，不同的种类菌丝长势不同。生产上常 用。 2.玉米水培养基：玉米水1000ml，蛋白胨3%；蔗糖20g； 磷酸二氢钾0.5%，硫酸镁0.5%；琼脂18～20g。
一级菌种制作技术 —复习思考题
1．什么是一级菌种？简述一级菌种制作的工艺 流程。 2．一级菌种培养基常用的配方是什么？简述其 制作过程 3．名词解释：消毒、灭菌、提纯。 4．如何对一级菌种培养基进行灭菌？如何检验 其灭菌效果？ 5．什么是菌种分离？菌种分离有哪几种方法？ 6．简述组织分离法的操作过程。 返回 7．为什么要进行出菇试验？ 8．什么叫转管？为什么要转管？ 9．什么是无菌操作？怎样才能做到无菌操作？
第二章 食（药）用菌制种技术
用菌资源：可利用的大型的可食用或药用的真菌， 食（药）用菌资源：可利用的大型的可食用或药用的真菌，绝大多 数是担子菌，少部分是子囊菌，如块菌，羊肚菌，虫草； 数是担子菌，少部分是子囊菌，如块菌，羊肚菌，虫草； 用真菌菌种：是指人工培养的以保藏、试验、栽培为目的， 食（药）用真菌菌种：是指人工培养的以保藏、试验、栽培为目的， 遗传性状相对稳定的食（药用）菌的繁殖材料， 遗传性状相对稳定的食（药用）菌的繁殖材料，这种繁殖 材料可以是孢子或菌丝。 材料可以是孢子或菌丝。科研和生产中的菌种大多数是真 菌的菌丝体。 菌的菌丝体。 食用菌菌株： 人工培养后保存的某种食（ 用菌的纯后代 用菌的纯后代， 食用菌菌株 ： 人工培养后保存的某种食 （ 药 )用菌的纯后代， 主要 用于品种的选育，遗传特性研究等。 用于品种的选育，遗传特性研究等。 食用菌品种：多个菌株经过筛选、杂交、诱变等过程， 食用菌品种：多个菌株经过筛选、杂交、诱变等过程，具有优良性 可用于栽培的食用菌菌株。 状，可用于栽培的食用菌菌株。
一级菌种制作技术 —菌种分离
（四）菌种分离的方法 2．孢子分离法 （1）概念 利用子实体产生的成熟有性孢子分离培养获得纯菌种的 方法。 （2）特点 ① 属于有性繁殖，后代易发生变异，可用此法培育新 品种。 ② 分离过程较复杂，适用于胶质菌类和小型伞菌。 （3）操作过程 孢子的采集 孢子的分离 孢子的萌发
一级菌种制作技术 —菌种分离
（一）菌种分离的概念 菌种分离：用无菌操作的方法将所需要的食用菌 从混杂的微生物群体中单独分离出来的过程。 通过菌种分离得到的纯菌丝体即为一级菌种。 （二）菌种分离的关键 严格按无菌操作规程进行 无菌操作：任何一个操作过程都要注意避免把其 它任何无关的菌体带入到培养基中。注意二点： 1．严格树立无菌观念；2．严格遵循无菌操作规程。
食（药）用品种来源：
资源的收 集
资 源 采 集
品种 人工分离
菌株 保藏 菌种活化
育种 品种
栽培
菌种生产
菌种生产类型及生产流程 菌种类型
食用菌菌种常用三级扩大培养的方式来生产 食用菌菌种 常用三级扩大培养的方式来生产， 所以通常把菌 常用 三级扩大培养的方式来生产， 种分为一级菌种、二级菌种和三级菌种。 种分为一级菌种、二级菌种和三级菌种。 一级菌种（母种） 分离培养，筛选， 一级菌种（母种）：分离培养，筛选，选育后具有优良性状的纯 菌丝体，常在试管斜面上培养，也称为试管种或母种。 菌丝体，常在试管斜面上培养，也称为试管种或母种。 二级菌种（原种） 由母种扩大培养的菌种， 二级菌种（原种）：由母种扩大培养的菌种，原种常采用麦粒或 玉米粒生产。 玉米粒生产。 三级菌种（栽培种） 由原种扩大培养而来， 三级菌种（栽培种）：由原种扩大培养而来，三级种的生产需要 根据具体的栽培对象选择营养适当，成本低廉的材料生产； 根据具体的栽培对象选择营养适当，成本低廉的材料生产；
二、三级菌种制作技术 —二、三级菌种培养基的配制
（一）二、三级菌种培养基配制原则 1．选择适宜的营养物质。 2．营养物质间配制的比例要恰当。 3．选择经济实用、来源广泛的原料。 4．适宜的pH值和含水量。
二、三级菌种制作技术 —二、三级菌种培养基的配制
（二）培养基常用的配方 1．木屑培养基：阔叶树木屑78%，麸皮(或米 糠)20%，蔗糖1%，石膏粉1%。这是常见的木屑培养 基配方。适于制作香菇、平菇、黑木耳、金针菇、 滑菇、灵芝、猴头菇等多种木腐型菌种。 2．棉籽壳培养基：棉籽壳78%，麸皮(或米糠) 20%，蔗糖1%，石膏粉1%。适用于制作金针菇、 平菇、凤尾菇、草菇、银耳、黑木耳、猴头菇等菌 种。
二、三级菌种制作技术 —二、三级菌种培养基的配制
（三）培养基配制的具体方法及步骤 1．称料 先称主料，再称辅料 2．拌料 3．调节pH值 4．分装培养料 5. 清洁（洗或擦）瓶、袋外壁。 6．封口
二、三级菌种制作技术 —二、三级菌种的接 种
1．灭菌方法及要求 高 压 蒸 汽 灭 菌 ： 压 力 1.5kg/cm3 ， 温 度 126 ～ 128℃，时间1～1.5h（谷粒和经过堆制发酵的粪草培 养基应达到2～2.5h）。 常压蒸汽灭菌：100℃，保持10～12h（攻头，控 中间，保尾） 2．灭菌效果检验 随机取几瓶（袋）置于25～30℃温度下空白培养 4～6天，会出现以下情况：全部感杂、少数感杂、全 部没有杂菌。 3、高压蒸汽灭菌锅的使用方法 基本与手提式高压灭菌锅相同。
一级菌种制作技术 —菌种的培养、保藏 菌种的培养、 菌种的培养
继代低温保藏法 食用菌在适宜的温度范围内，温度越高菌丝的代谢能力越强，菌种越 容易衰老。低温保藏就是将培养好的菌株放在冰箱中低温保藏，降低其代 谢强度，延长菌种的生活力。同时也防止空气中的杂菌污染。 继代低温保藏的方法：冰箱中低温保藏(一般要求温度在4～6℃)。菌 继代低温保藏的方法 株用塑料纸包扎，2～3个月转管一次，选用营养丰富的培养基。 注意事项: ① 定期检查。如果发现保藏的菌种被污染应立即重新分离纯化。 ② 制种或转管时要贴好标签，以防搞乱。 ③ 对不耐低温的菌种，如草菇在5℃时菌丝会死亡，应置于10～15℃ 下保藏。 继代低温保藏的缺点:保藏时间较短，经常转管会造成误差和污染， 继代低温保藏的缺点 遗传性状也容易在每次转管的过程中发生变异。
菌种的一般生产流程
保藏菌种 引进菌种 菌种活化 检查
母种生产
栽培种生产
原种生产
母种转管 扩大培养
菌种生产设备、 菌种生产设备、器材 设备 制种设备 原料处理设备：切片粉碎机（木材，秸秆粉碎） 原料处理设备：切片粉碎机（木材，秸秆粉碎）、 过筛机、拌料机、 过筛机、拌料机、装瓶或装袋机
菌种生产器具 试管、三角瓶、培养皿、漏斗、烧杯、酒精 灯、菌种瓶、折角菌种袋，棉花、无棉盖体，天 平、杆秤、磅秤、量杯、量筒等。
一级菌种制作技术 —菌种的培养、保 菌种的培养、
藏
（一)培养 培养条件：25℃左右、干净、干燥、黑暗、通风 培养设备：电热恒温培养箱 （二）保藏 1．菌种保藏的目的：菌种由于传代次数过多，培养时间过长，或因不利的 外界环境条件的影响，常常会导致菌种衰退，丧失其优良性状。因此，在 一定的时间范围内要使菌种的生活力、纯度和优良性状稳定地保存下来， 就必须采用相应的措施，做好菌种保藏工作。 2．菌种保藏（概念）：是创造一个特定环境条件，降低菌种的代谢活动， 使其处于休眠状态，在一定的保藏时间内保持原有的优良性状，防止菌种 退化，降低菌种的衰亡速度，防止杂菌污染，而当使用时，提供合适的条 件，能重新恢复正常生长繁殖。 3．菌种保藏的原理：是采用干燥、低温、冷冻或减少氧气供给等方法，降 低菌种的代谢强度，终止其繁殖，并保证原来菌种的纯度。 4．传统的保藏方法：有继代培养低温保藏法，矿油保藏法，冷冻干燥保藏 法，液态氨超低温保藏法等。
一级菌种制作技术 —菌种分离
（四）菌种分离的方法 基内菌丝分离法(基质分离法) 3．基内菌丝分离法(基质分离法) 概念：从生长子实体的培养基中分离菌丝获得纯培养的方法。 特点：易感染杂菌。 基内菌丝分离法一般只在下列情况下采用： ① 子实体已腐烂，但又必须保留该种菌种。 ② 有些子实体小而薄，用组织分离法和孢子分离法较困难。 ③ 还有一些菌类如银耳菌丝，只有与香灰菌丝生长在一起 才能产生子实体，如果要同时得到这两种菌丝的混合种，也 只能采用基内菌丝分离法进行分离。