实时荧光定量PCR数据分析及常见问题分析

二、常见问题分析
PCR抑制物
黑色素 多糖类 血红蛋白 尿素 其他 乙醇 蛋白酶K 胍盐 苯酚
二、常见问题分析
血液中PCR抑制物的作用机制及对策
抑制物 肝素 作用原理 对策 可结合于DNA和RNA上； 肝素酶或氯化锂 对反转录酶和聚合酶有抑制作用。 1）DNA-琼浆糖凝胶珠的相互混 合； 含有铁，释放铁离子至PCR混合物， 2）加入0.6%（wt/vol）的BSA 干扰DNA合成。 （牛血清白蛋白）； 3）NaOH处理。 含有铁，释放铁离子至PCR混合物， 同上 干扰DNA合成。 与单链DNA相互作用 与DNA、RNA结合，后续的提取过 程中不能被去除； 抑制聚合酶活性。 同上
二、常见问题分析
引物和模板比例
二、常见问题分析
是否可以调整引物和模板的比例？
• YES。 • 低引物浓度会导致高Ct值（灵敏度低）。 • 所以对于低浓度的样本，反应体系中引物的浓度却不能太 低。
二、常见问题分析
如何判断他们是否存在扩增？
• 首先看对数图谱，和同一反应中的其它曲线相比，这些曲 线的形状不相同。
ROX校准：参比荧光（ABI7500）
二、常见问题分析
ROX设置
• ABI7500仪器软件自动进行ROX校准。 • ROX校准为可选步骤，如果使用的PCR试剂没有添加ROX参 比荧光，或者ROX添加浓度不适合，请将ROX校准关闭 （None）。
二、常见问题分析
4、“可疑的” 扩增曲线（以ABI7500为例）
• 点击右键，选择Baseline Threshold
二、常见问题分析
手动设置基线
• 将Baseline End设置为“扩增信号出现的前一个循环” • 即，原始为26，将其设置为20，点击OK
二、常见问题分析
手动设置基线
• 设置完成后问题曲线恢复正常
二、常见问题分析
3、重复性
1个样本4个复孔重复性好
二、常见问题分析
如何判断他们是否存在扩增？
• 同时这些曲线源自文库有明显的指数增长期。
二、常见问题分析
如何判断他们是否存在扩增？
• 最后看线性图谱。 • 曲线一直没有上升的趋势，提示不存在扩增。
二、常见问题分析
如何判断他们是否存在扩增？
• 案例： 先看对数图谱 右侧的曲线形状和扩增曲线很相似，但曲线不光滑。
一、数据分析
基线
一、数据分析
基线
一、数据分析
基线
一、数据分析
基线
一、数据分析
阈值线
一、数据分析
阈值线
二、常见问题分析
1、PCR扩增抑制（以Bio-CFX96为例）
扩增曲线荧光强度大小及Ct值大小可提示存在抑制。
H07存在扩增抑制；解决方法：将样本稀释后进行扩增。 （抑制物的影响可通过稀释样本消除）
二、常见问题分析
加样误差（操作？移液器？） 没有将试剂和样本充分混匀
• 有时候在制备PCR反应混合液时（包括Goldstar/PCR Mix反 应液、引物探针、样本、水），在分装入反应板（管）前 没有充分混匀。 • 结果加入到每个孔中的试剂成分就有所不同。
• 解决方法： • 在分装反应混合液前，要将其充分混匀（振荡、吹打）离 心。 • 同时上机之前，要将PCR反应板（管）离心，使所有液体 都在反应管底部。
• 由于PCR扩增形成的真正的扩增曲线通常很容易确认。 • 有特征的形状：首先有背景信号（基线期），然后是三个 增长阶段（指数增长期、线性增长期和平台期）
二、常见问题分析
指数增长期内扩增曲线具有高度重复性
二、常见问题分析
是什么原因造成平台期很低呢？
• 可能是目标样本的浓度太低。 • 通常如果模板的起始浓度太低，反应体系中会形成大量的 引物二聚体。 • 大量引物二聚体的形成使得引物很快消耗完，从而造成扩 增曲线的平台期很低。
二、常见问题分析
低拷贝的样本→泊松分布
• 泊松分布：是一种统计与概率学里常见到的离散机率分布 （discrete probability distribution）。
• 在30ul中有9个模板，每个反应管均匀的分配到3个模板的 几率有多高？如果30ul中有9000个模板呢，又会怎么样？
二、常见问题分析
二、常见问题分析
总结
• • 对PCR原理的了解是基础，一切从原理出发。 常见问题归类： 抑制物：稀释样本消除抑制 重复性差：基线/阈值设置、加样/混匀、泊松分布、参比 荧光 • 可疑的扩增：综合各种图谱分析
血红蛋白
乳铁蛋白
免疫球蛋白 IgG
亚铁血红素
加BSA，结合亚铁血红素
二、常见问题分析
检查样本质量
• 用分光光度计测量样本260/280比值 • DNA纯度：OD260/OD280=1.8 • RNA纯度：OD260/OD280=2.0
二、常见问题分析
2、自动基线有问题
二、常见问题分析
手动设置基线
二、常见问题分析
3、重复性
1个样本4个复孔重复性差
二、常见问题分析
造成重复性差的原因
• • • • • 基线、阈值的设置 加样误差（操作？移液器？） 没有将试剂和样本充分混匀 低拷贝的样本→泊松分布 没有使用ROX校准（ABI7500）
二、常见问题分析
基线、阈值的设置
• 根据曲线的具体情况进行设置： 阈值：大部分曲线荧光强度/20 基线：开始→2/3（根据仪器和试剂） 结束→扩增信号出现的前一个循环 • 如果基线、阈值设置无问题，则是其它原因造成重复性差。
二、常见问题分析
如何判断他们是否存在扩增？
• 案例： 再看下线性图谱，可以看到曲线有一定的上升。
二、常见问题分析
如何判断他们是否存在扩增？
• 案例： • 分析： • 形成这类曲线的原因可能是模板可能是模板的质量差 （PCR抑制物；模板浓度低），也有可能是引物探针有问 题。 • 试剂原因： • 如果使用的试剂背景信号太强，荧光的增长将会很小，导 致扩增曲线的指数增长期会变得很短，或者没有。 • 荧光信号差的试剂也会有同样的问题。
实时荧光定量PCR 数据分析及常见问题分析
一、数据分析
定量PCR扩增曲线的各种概念
一、数据分析
什么是基线
• 基线是扩增曲线的水平部分。
一、数据分析
基线扣除
一、数据分析
什么是阈值
• 阈值是一个荧光强度值，穿过阈值与X轴平行的直线称为 阈值线。
一、数据分析
什么是Ct值
• Ct值是阈值线与扩增曲线的交点对应在X轴上的值。