铜绿假单胞菌检测(滤膜法)

铜绿假单胞菌的检验流程

铜绿假单胞菌的检验流程
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的检验流程可以包括以下步骤：
1. 样品采集：从疑似感染源（如伤口、尿液、呼吸道分泌物等）采集样品。

确保采集过程无菌，并采用适当的采样器具和技术。

2. 培养基选择：选择适合于铜绿假单胞菌生长的培养基，如血琼脂、MacConkey琼脂等。

根据需要，还可以选择特殊的培养基，如铜绿假单胞菌选择性培养基。

3. 培养：将采集的样品在选择的培养基上进行斑点接种、刷涂或点菌法接种。

根据不同的培养基和环境条件，培养时间一般为24-48小时。

4. 形态观察：观察培养基上的菌落形态特征。

铜绿假单胞菌的菌落通常呈绿色或蓝绿色，具有金属光泽。

5. 鉴定测试：进行铜绿假单胞菌的鉴定测试，以确认菌株的身份。

常见的鉴定测试包括：
•革兰氏染色：观察菌株的革兰氏染色特征。

•氧化/还原测试：进行氧化/还原测试，如氧化酮酸试验等。

•水解反应：检测菌株的葡萄糖、麦芽糖等的水解反应。

•生化试验：进行生化试验，如氧化酶试验、产芽孢试验等。

6. 进一步确认：根据鉴定测试的结果，可以进行进一步的确认。

例如，可以使用API系统或分子生物学方法（如PCR）进行确认。

请注意，以上是一般的检验流程，具体的步骤和方法可能会因实验室的设备、方法选择和要求而有所不同。

在进行任何检验之前，建议遵循实验室的操作规范和相应的检验标准。

1/ 1。

铜绿假单胞菌检测标准

铜绿假单胞菌检测标准铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种革兰氏阴性杆菌，常见于自然环境中，也是一种常见的医院感染病原体。

铜绿假单胞菌感染通常发生在免疫系统功能低下的患者身上，尤其是那些长期接受抗生素治疗或使用人工气道的患者。

因此，对于铜绿假单胞菌的检测标准至关重要。

一、样本采集。

铜绿假单胞菌的检测需要采集合适的样本，一般来说，可以采集患者的呼吸道分泌物、血液、尿液、伤口分泌物等样本进行检测。

在采集样本时，需要严格遵守无菌操作规范，避免外界细菌的污染。

二、培养方法。

对于铜绿假单胞菌的培养，通常采用琼脂培养基，如普通营养琼脂、大肠杆菌选择性琼脂等。

将样本均匀涂布于琼脂培养基表面后，进行孵育，一般在37摄氏度条件下孵育24-48小时，观察是否有铜绿色的细菌克隆形成。

三、生化鉴定。

铜绿假单胞菌的生化鉴定是确认其种属的重要方法。

常用的生化鉴定方法包括氧化酶试验、葡萄糖氧化酶试验、葡萄糖酸盐琼脂培养基培养等。

这些方法可以帮助我们确认铜绿假单胞菌的特异性生化代谢特点，从而进行准确鉴定。

四、药敏试验。

铜绿假单胞菌对抗生素的耐药性较强，因此药敏试验是至关重要的。

通过对铜绿假单胞菌对不同抗生素的敏感性进行测试，可以为临床治疗提供重要参考。

常用的药敏试验方法包括纸片扩散法、微量稀释法等。

五、分子生物学检测。

近年来，分子生物学检测方法在铜绿假单胞菌检测中得到了广泛应用。

通过PCR扩增、基因测序等技术，可以快速、准确地鉴定出铜绿假单胞菌，并对其耐药基因进行检测，为临床治疗提供更为精准的信息。

总结。

铜绿假单胞菌的检测标准涉及到样本采集、培养方法、生化鉴定、药敏试验和分子生物学检测等多个方面，每个环节都至关重要。

只有严格按照标准操作，才能确保检测结果的准确性，为临床治疗提供可靠的依据。

希望本文所述内容能够对相关人员有所帮助，谢谢阅读。

食品中铜绿假单胞菌检测.课件(1).ppt

• 铜绿假单胞菌的菌体形态
无芽孢，无夹膜，革兰氏染色后为红色，革兰阴性杆菌，有单鞭毛或丛鞭毛，运动活泼。菌体的大小为0.5～1µm×1.5～ 3.0µm，菌体笔直或弯曲。
三、铜绿假单胞菌的检测
（一）检测方法（滤膜法）（二）检测原理（三）试剂和设备（四）检测步骤（五）报告
（一）铜绿假单胞菌检测方法（滤膜法）
课堂测验
❖ 1. GB19298-2014《包装饮用水》的微生物指标中，增加了的检测，删除了的检测。
❖ A.菌落总数 B. 大肠菌群 C. 铜绿假单胞菌 D.霉菌
❖ 2. 铜绿假单胞菌可引起局部化脓性炎症，也可引
起
。
❖ A.中耳炎 B.角膜炎 C.胃肠炎 D.以上都是
❖ 3.下列
不是铜绿假单胞菌的检测试剂。
国内污染情况：
-瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率1.2％～ 23.6％； -瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率11.6％。
➢ 国外污染情况：
-Richards等在104件检品中的4件分离到铜绿假单胞菌； -Rosenberg报告德国1.2％～10.2％的瓶装矿泉水检出铜绿假单胞菌。
一、检测背景
（4）产氨试验
未加入钠氏试剂
深黄色到砖红色
阳性
阴性
加入钠氏试剂
6.计数
• 计数滤膜上产绿脓色素的菌落以获得铜绿假单胞菌的数量。
• 在紫外灯下产生荧光且在乙酰胺肉汤中产氨的所有菌落证实为铜绿假单胞菌，并进行计数。
•将氧化酶反应阳性、乙酰胺肉汤产氨、金氏B培养基上显荧光的红褐色菌落进行计数。
5. 确证性试验
➢ （1）营养琼脂纯化 ➢ （2）氧化酶试验 ➢ （3）金氏B培养 ➢ （4）产氨试验

包装饮用水中铜绿假单胞菌检测

227科研与教育2020年第3期包装饮用水中铜绿假单胞菌检测钟杰（深圳市计量质量检测研究院，广东深圳 518000）摘　要：随着现代生活水平的提高，饮用水安全问题越来越受到关注。

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种极具危害性的致病菌，检测其在饮用水中是否符合规定，对提高包装饮用水品质、普及健康用水理念有很大帮助。

检测方法参考新标准《食品安全国家标准包装饮用水生产卫生规范》（GB 19304—2018）中的铜绿假单胞菌滤膜-过滤法，并将检测出铜绿假单胞菌的水质通过PCR法扩增进行验证实验。

分析实验条件对结果的影响，并将结果与标准规定比对，判断抽取包装饮用水的质量，为消费者生产商提供可靠数据，为相关质量卫生部门加强监督管理提供依据。

关键词：包装饮用水；铜绿假单胞菌；滤膜-过滤法；PCR法中图分类号：R123.1 文献标志码：A 文章编号：2096-3092（2020）03-0227-02随着生活水平的提高，包装饮用水已在人们的日常生活中得到普及。

矿泉水方便易携带且口感好，桶装水便于家庭饮用且健康、安全，这些改变了人们长期以来的饮水习惯。

近年曝光的包装饮用水企业，很多是因为不合乎标准，微生物（铜绿假单胞菌）超标引起水质污染。

造成包装饮用水中铜绿假单胞菌超标的主要原因为水源遭受铜绿假单胞菌污染或生产过程中卫生控制不严格没有及时杀灭病菌，这对抵抗力较弱的人群存在较大健康风险。

因此，及时检测避免其带来经济损失是非常重要的。

为了进一步了解广东省包装饮用水的卫生状况，现随机从市面抽检包装饮用天然矿泉水和饮用纯净水进行检测。

机选取在2017年55批、2018年90批和220批。

1.2 菌株菌体有1～3根鞭毛，运动活泼。

/CN琼脂，乙酰胺肉试剂：萘啶酮酸（CN琼脂配套试剂），甘油，钠氏试剂（乙酰胺肉汤配套试剂），氧化酶试纸。

1.4 评价标准包装饮用矿泉水和饮用纯净水测定方法和标准参考新发行的标准《食品安全国家标准包装饮用水生产卫生规范》（GB 19304—2018）进行。

铜绿假单的检验流程及验证步骤

铜绿假单的检验流程及验证步骤宝子！今天咱们来唠唠铜绿假单的检验流程和验证步骤哈。

一、检验流程。

1. 样本采集。

这就像去寻宝得先找到宝藏的藏身之处一样。

对于铜绿假单的检测，样本采集很关键呢。

可以从很多地方采集样本，像伤口的分泌物呀，痰液之类的。

如果是怀疑有铜绿假单感染的病人，医护人员就会小心翼翼地采集这些样本，这就像在摘取小秘密一样，可不能马虎哦。

2. 初步观察。

把样本拿到实验室后，先简单看一下。

铜绿假单菌有它独特的模样，在培养基上可能会有一些特殊的表现，比如说颜色可能有点发绿，就像小绿精灵在培养基上安了家。

这时候工作人员就会心里有个小猜测，是不是铜绿假单菌呢？3. 生化鉴定。

接下来就是高科技上场啦。

要对样本进行各种生化反应的检测。

这就好比给这个菌做个超级测试，看看它在各种化学环境下的表现。

比如检测它能不能产生特定的酶呀，对某些糖的分解能力如何之类的。

这些测试结果就像一个个小密码，要是都符合铜绿假单菌的特点，那它的身份就越来越可疑啦。

4. 基因检测（有时候需要）在一些复杂的情况或者要求更精确的情况下，还可能进行基因检测呢。

这就像直接查看这个菌的基因身份证，看看它的基因序列是不是和铜绿假单菌完全匹配。

这一步就特别高大上啦，不过也能让结果更加准确可靠。

二、验证步骤。

1. 重复实验。

当初步判断是铜绿假单菌后，为了保险起见，要重复做几次实验。

就像你觉得自己发现了一个宝藏，要多挖几次确定是真的宝藏一样。

如果每次结果都差不多，那这个结论就更靠谱啦。

2. 对比标准菌株。

把检测出来的菌和标准的铜绿假单菌株进行对比。

这就像是把你发现的宝贝和博物馆里的正品做对比，看看是不是一模一样。

从形态到各种特性都要比一比，如果都很相似，那基本上就可以确定是铜绿假单菌啦。

3. 综合判断。

最后呢，工作人员会综合所有的信息，包括样本来源、检验过程中的各种表现、对比结果等等。

就像法官判案一样，把所有证据都拿出来，然后确定这个菌就是铜绿假单菌。

化妆品中铜绿假单胞菌检测原始记录

2、分离培养：从培养液的薄膜处挑取培养物，划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，置36℃±1℃培养18h~24h。凡铜绿假单胞菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素。在缺乏十六烷三甲基溴化铵琼脂时也可用乙酰胺培养基进行分离，将菌液划线接种于平板上，置36℃±1℃培养24h±2h，铜绿假单胞菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基呈红色，其他菌不生长。
样品编号
增菌培养（36℃±1℃培养18h~24h）后现象
分离培养（十六烷三甲基溴化铵琼脂平板，36℃±1℃培养18h~24h）
革兰氏染色、镜检
生化鉴定试验
试验结果
氧化酶试验
36℃±1℃培养24h±2h（日时至日时）
绿农菌素试验
硝酸盐还原产气试验
明胶液化试验
42℃生长试验
日时至日时
日时至日时
备注：“G+”表示该菌为革兰氏阳性者，“G-”表示该菌为革兰氏阴性；“+”表示阳性，“-”表示阴性。
8、42℃生长试验：挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，置于42℃±1℃培养箱中，培养24h~48h，铜绿假单胞菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。
9、试验结果报告：被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。
项目编号
样品名称
化妆品
检测项目
铜绿假单胞菌
样品性质
收样时间
检测时间
环境条件

铜绿假单胞菌检验方法标准

铜绿假单胞菌检验方法标准铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种广泛存在于环境中的革兰氏阴性细菌。

铜绿假单胞菌可以导致多种感染，特别是对于免疫系统功能较弱的患者，如免疫抑制剂使用者或者长期使用呼吸机的患者。

因此，及时、准确地检验并识别铜绿假单胞菌对于预防和控制感染至关重要。

本文将介绍铜绿假单胞菌的检验方法，并提供一个标准的检验方案，以确保测试的准确性和可靠性。

一、铜绿假单胞菌检验前的准备工作1.1 样本采集从患者身上采集适当的样品，如各种体液（如血液、尿液、脑脊液等）或病灶分泌物。

确保样本获取的无菌操作，以避免外界细菌的污染。

1.2 检验材料准备准备必要的检验材料，包括培养基（如MacConkey琼脂培养基、肉汤培养基等）、培养皿、菌液吸管、无菌显微镜玻片、无菌移液器等。

一、铜绿假单胞菌检验方法2.1 培养方法将适量的样品分别接种于不同种类的培养基上。

通常情况下，MacConkey琼脂培养基和肉汤培养基可以用于初步选择铜绿假单胞菌的生长。

将培养皿置于适当的温度下（通常在35-37摄氏度），保持培养皿适当湿润。

在培养过程中要注意杂菌的干扰，定期观察培养皿上的菌落的形态、颜色等特征。

2.2 生理生化试验经过初步培养，我们可以利用各种生理生化试验来确认菌种的鉴定。

例如，碳水化合物利用试验、氧化酶试验、羟基苯丙酮酸酶试验等。

这些试验可以帮助我们确定菌株是否为铜绿假单胞菌。

2.3 PCR检测使用聚合酶链反应（PCR）技术是一种快速而准确的方法来检测铜绿假单胞菌。

通过选择合适的引物和扩增条件，可以从样品中扩增出铜绿假单胞菌特异性的基因片段。

通过检测PCR反应产物，可以确认铜绿假单胞菌的存在。

2.4 抗生素敏感性试验由于铜绿假单胞菌普遍存在多重耐药性的问题，进行抗生素敏感性试验十分必要。

通过将不同的抗生素添加到含有菌落的培养皿中，观察菌落的生长情况及抗生素对菌落的抑制作用，可以确定铜绿假单胞菌的抗生素敏感性谱。

桶装水铜绿假单胞菌污染及检测方式

现阶段，人们对于桶装饮用水的需求量不断增加，饮用水安全问题受到了人们的高度关注。

国家标准对桶装水中铜绿假单胞菌作出了不得检出的要求，但是在近几年间有多个地区出现了桶装水中铜绿假单胞菌严重超标的问题。

铜绿假单胞菌属于水源性致病菌,属于条件致病菌的一种，在水、人体皮肤、空气、呼吸道或者肠道等空间内均可存活，免疫力低的人群误饮受其污染的水以后，有较大的可能感染相关疾病。

1　桶装水铜绿假单胞菌出现的主要原因1.1　水源水污染因素因为水源水污染是导致桶装水污染的主要诱因之一，桶装水的主要原料为自来水、河流水、湖泊水或者泉水。

近几年，我国经济市场快速发展，未经处理达标的现代工业废水或者生活污水的排放会对水源水造成污染，如果水源水在受到污染并且没有通过后续清除流程，则很可能会造成连续污染现象。

例如：部分桶装矿泉水在其生产期间为了保证水体中的矿物质含量，不会使用精滤装置进行处理，就给了铜绿假单胞菌的污染机会[1]。

1.2　卫生意识不强，生产设备消毒不彻底部分企业设备陈旧、生产工艺简陋，对于铜绿假单胞菌的控制力度不足，水源水存在污染的可能性很高。

因为用于生产的主要仪器设备有很多接口，在正式生产期间容易出现交叉污染的情况，此时病菌会进入到最终产品中。

因为铜绿假单胞菌能够黏附于管道、贮水池或者增压泵中，并在其中繁殖，通过简单的冲洗不能彻底清除。

与此同时，如果正在使用的生产设备存在未经定期消毒、消毒不彻底的情况，也有可能造成铜绿假单胞菌污染，其中，消毒剂不合格造成污染的可能性也很高。

在上述内容之外，采用传统消毒方式，利用臭氧浓度低或者短时间冲洗并不能达到完全杀灭的效果，如此周而复始，水源水污染程度会不断加剧[2]。

1.3　包装材料的消毒清洗不到位对桶装清洁以及消毒处理不到位被视为成品水受到污染的最主要原因。

时下多数桶装水产品的制造商存在回收水桶的情况，而水桶自身的特殊结构非常不利于消毒工作的展开，同时消毒效果也会因此受到影响。

铜绿假单胞菌在医院环境中的检测方法及它的后果分析

铜绿假单胞菌在医院环境中的检测方法及它的后果分析在医院环境中，铜绿假单胞菌是一种常见的致病菌。

它广泛存在于水、土壤、动物和人体等多种环境中，特别是在医疗设施和医院环境中，铜绿假单胞菌非常易于传播和繁殖。

因此，开展对铜绿假单胞菌的检测方法及其后果分析具有重要的意义。

首先，关于铜绿假单胞菌的检测方法，主要有以下几种实验室技术可供选择。

其中，首要的方法是传统的细菌培养技术。

这种方法通过将采集到的样本在含有适当培养基的培养皿上进行培养，然后观察是否出现铜绿色的菌落形成。

此外，还可以使用分子生物学技术，如PCR（聚合酶链反应）和实时定量PCR。

利用这些方法，可以通过检测铜绿假单胞菌的特定基因序列来确定其存在与否。

除此之外，还可以应用质谱技术（MALDI-TOF MS）对菌落进行鉴定和分析。

其次，我们需要认识到铜绿假单胞菌在医院环境中散播的重要后果。

首先，铜绿假单胞菌是导致医院感染的主要致病菌之一。

它能够引起众多感染，尤其是对免疫功能较弱的患者，如长期住院的老年人和重症患者造成严重威胁。

其次，铜绿假单胞菌对多种抗生素具有耐药性。

这使得治疗感染变得复杂和困难，有效抗菌药物的选择变得极为有限。

再者，它还可能在医疗设施管道、水龙头、洗手台等地方形成生物被膜，给设备和环境带来难以清除的感染源。

针对铜绿假单胞菌在医院环境中的后果，我们需要采取一些措施来预防和控制其散播。

首先，建立和加强医院感染控制政策和规范流程，明确责任和义务，确保医务人员正确执行感染防控措施，如手卫生和环境清洁消毒。

其次，严格执行医院的水质管理，确保水源的安全、干燥和通风的医疗环境。

此外，实施有效的感染监测，定期对医院内不同区域、设备和患者进行铜绿假单胞菌的检测，及时发现和隔离感染源。

最后，加强医务人员的培训和教育，提高他们对感染防控的认识和理解，增强对患者和环境的保护意识。

综上所述，铜绿假单胞菌在医院环境中的检测方法和其后果分析对于确保医院环境安全和患者健康具有重要的作用。

食品中铜绿假单胞菌检测(2).

铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）俗称绿脓杆菌，因为在代谢过程中产生水溶性的绿色色素，皮肤有伤口时易感染，使伤口与创面呈绿色，故名绿脓杆菌。
• 铜绿假单胞菌的菌体形态
无芽孢，无夹膜，革兰氏染色后为红色，革兰阴性杆菌，有单鞭毛或丛鞭毛，运动活泼。菌体的大小为0.5～1µm×1.5～ 3.0µm，菌体笔直或弯曲。

本菌为条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者，以及术后或某些治疗后的患者易感染本菌。经常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。本菌引起的感染病灶可导致血行散播，而发生菌血症和败血症。烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。

WHO在HACCP的评估中明确指出铜绿假单胞菌是婴儿瓶装饮用水的危害指示菌，可造成婴儿腹泻。尤其是抵抗力较差的老弱病幼孕人群，饮用含铜绿假单胞菌的瓶装水很可能导致疾病的发生。普通人食入103~104个菌体细胞即可被侵害。

假单胞菌属包括200余种菌。多数为腐生菌，少数为植物和动物寄生菌，大多为条件致病菌。

假单胞菌属分布广泛，土壤、水和空气中均有存在。
人类非发酵菌感染中，假单胞菌占 70 ％～ 80 ％，
主要为铜绿假单胞菌。

铜绿假单胞菌也是医院感染的主要病原菌。
假单胞菌属致病检出率
嗜麦芽 15% 其他 13%
不动杆菌 16%
铜绿假单胞菌56%
二、铜绿假单胞菌的致病性

主要致病物质是内毒素，此外尚有菌毛、荚膜、胞外酶和外毒素等多种致病因子。可引起局部化脓性炎症，也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃肠炎、心内膜炎、脓胸，还可引起败血症及婴儿流行性腹泻。

铜绿假单胞菌检测方法

铜绿假单胞菌检测方法铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的革兰氏阴性杆菌，广泛存在于自然界中的土壤、水体和植物表面等环境中。

它是一种致病菌，可以引起多种感染疾病，尤其是对免疫系统较为薄弱的人群造成危害。

因此，及早检测和准确诊断铜绿假单胞菌的存在至关重要。

一、培养法检测。

1. 样品采集，从疑似感染部位采集分泌物、组织或体液样品，如痰液、伤口分泌物、尿液等。

2. 培养基选择，选择适合铜绿假单胞菌生长的培养基，如Pseudomonas Agar Base等。

3. 培养条件，在适宜的温度和湿度条件下进行培养，通常在37摄氏度下培养24-48小时。

4. 观察结果，观察培养皿上是否有铜绿色的细菌克隆形成，这是铜绿假单胞菌的特征之一。

二、生化试验检测。

1. 氧化酶试验，使用氧化酶试纸涂抹样品，观察是否产生紫色反应。

2. 发酵试验，利用不同的碳源进行发酵试验，观察铜绿假单胞菌对不同碳源的利用情况。

3. 硝化还原试验，观察铜绿假单胞菌是否具有硝化还原能力。

三、分子生物学检测。

1. PCR法，利用聚合酶链式反应（PCR）技术，选择特异性引物扩增靶基因，如16S rRNA基因等。

2. 基因测序，对PCR扩增产物进行测序分析，确认靶基因序列是否与铜绿假单胞菌相符。

四、质谱法检测。

1. 蛋白质质谱，利用质谱技术对铜绿假单胞菌的蛋白质进行分析，寻找特异性蛋白质标志物。

2. 代谢产物质谱，分析铜绿假单胞菌代谢产物的质谱图谱，寻找特异性代谢产物。

以上是目前常用的铜绿假单胞菌检测方法，每种方法都有其特点和适用范围。

在实际检测中，可以根据具体情况选择合适的方法进行检测，以确保检测结果的准确性和可靠性。

同时，为了避免检测过程中的污染和误差，操作人员需要严格按照操作规程进行操作，并做好实验室卫生和消毒工作。

总之，对于铜绿假单胞菌的检测工作，需要综合运用多种方法，以提高检测的准确性和可靠性。

只有及时有效地检测到铜绿假单胞菌的存在，才能采取针对性的治疗措施，保障患者的健康和安全。

保健用品微生物检验方法-—铜绿假单胞菌测定

保健用品微生物检验方法第3部分：铜绿假单胞菌测定警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。

本标准并未指出所有可能的安全问题。

使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

1 范围本标准规定了保健用品中微生物中铜绿假单胞菌的测定方法。

本标准适用于生产和经营的保健用品中的铜绿假单胞菌测定。

2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。

凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489 实验室生物安全通用要求3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。

3.1铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。

此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42 ℃±1 ℃条件下能生长。

4 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯。

实验用水符合GB/T 6682中二级水的要求。

4.1 灭菌生理盐水:详见附录A.1。

4.2 灭菌液体石蜡:详见附录A.2。

4.3 灭菌吐温-80:详见附录A.3。

4.4 SCDLP:详见附录A.4。

4.5 十六烷基三甲基溴化铵:详见附录A.5。

4.6 乙酰胺:详见附录A.6。

4.7 革兰氏染液:详见附录A.7。

4.8 绿脓菌素测定培养基:详见附录A.8。

4.9 硝酸盐蛋白胨水:详见附录A.9。

4.10 明胶液化培养基:详见附录A.10。

5 仪器和设备5.1 天平：感量0.1 g。

5.2 灭菌刻度吸管:10 mL、5 mL、1 mL。

5.3 高压灭菌器。

5.4 量筒：100 mL、200 mL、2000 mL。

5.5 恒温水浴箱或隔水式恒温箱:44.5 ℃±0.5 ℃。

5.6 无菌锥形瓶：100 mL、200 mL、250 mL、2000 mL。

桶装水中铜绿假单胞菌检测和解决办法

桶装水中铜绿假单胞菌检测和解决办法摘要：铜绿假单胞菌经过水源水消毒，管道消毒和臭氧消毒后，其活力会大大降低，处于非可培养状态，导致传统方法培养不出和检测结果的假阴性。

本文通过对检测方法的分析，提出一种可以彻底杀灭铜绿假单胞菌的方法。

关键字：桶装水；铜绿假单胞菌；检测；解决铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种重要的水源性致病菌，广泛存在于各类型水中，对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素具有很强的抵抗力，可引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病。

近年来，随着全球范围内桶装饮用水消费量的不断上升，国内外有关铜绿假单胞菌污染桶装水的报道逐渐增多，引起了诸多学者和消费者的普遍关注。

目前桶装饮用水铜绿假单胞菌检测技术方面，除传统的生化培养外，PCR 和环介导等温扩增技术（LAMP）等分子方法逐步建立起来，应用于水样快速检测中。

本文在分析检测方式的基础上提出彻底解决的办法。

一．铜绿假单胞菌的传统检测方法参考《饮用天然矿泉水检验方法》 GB/T8538-2008/54 铜绿假单胞菌-滤膜法和ISO16266：2006（E）水质-铜绿假单胞菌的检测和计数－滤膜法进行检验。

具体步骤：将250 mL水样用孔径为0.45 μm的滤膜过滤，并将滤膜移至 CN 琼脂选择性培养基上，36 ±1 ℃℃恒温培养 48 h。

铜绿假单胞菌在 CN 琼脂出现的菌落形态有 3 种：有脓青素产生的蓝/绿色、无荧光的菌落，直接判为检出；产生有荧光素的黄色菌落，进一步做产氨(乙酰胺肉汤)试验确认，产氨试验阳性的判为检出；产生红脓素的红褐色、无荧光的菌落，要继续做氧化酶试验、产氨试验、荧光(金氏 B 斜面)试验，若氧化酶阳性、产氨试验阳性结果判为铜绿假单胞菌检出。

二．铜绿假单胞菌 PCR 检测方法将 250 mL 水样用孔径为 0.45 μm 的滤膜过滤，将滤膜转移至 100 mL LB 肉汤（内含 0.02 g 溴化十六烷基三甲胺和 1.5 mg 萘啶酮酸），选择增菌 18 h 后，吸取 1 mL 增菌液，煮沸法提取 DNA。

铜绿假单胞菌检验

1.1 生物学特性
革兰氏阴性细长杆菌，大小为1.5～3.0×0.5μm，菌体长短不一，呈球杆状或长丝状，成对或成短链排列。菌体一端有一根鞭毛，运动活跃，无芽孢，无荚膜。专性需氧菌。最适温度为35℃，42℃生长，4℃不生长。（所以一般情况下不能冷藏保存，需在室温下于阴凉处保存）可产生多种，主要为绿脓素，是一种水溶性色素，但是也产生能溶于氯仿、蓝绿色、无荧光的吩嗪类色素。

平铺时应避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡。
2.2.3 检验程序
结果观察：

所有显蓝色或绿色（绿脓色素）的菌落，初步判定为铜绿假单胞菌。所有发荧光不产绿脓色素疑似铜绿假单胞菌菌落，进行乙酰胺肉汤确证性试验。

将其它所有红褐色不发荧光的菌落进行氧化酶测试、乙酰胺肉汤、金氏B培养基确证性试验。

2. 检验方法
2.1

铜绿假单胞菌检验方法（GB/T 8538）
2.1.1 Water quality -- Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa -Method by membrane filtration （ ISO 16266:2006 ） 2.1.2 《饮用天然矿泉水检验方法》（GB/T8538－ 2008/ 4.54）铜绿假单胞菌检验
2.2.3 检验程序
确证性试验
（4）乙酰胺肉汤将新鲜纯培养物接种到装有乙酰胺肉汤的试管中，36℃±1℃，20h～24h。向每支试管培养物加入1～2滴钠氏试剂，检查各试管的产氨情况，如表现出从深黄色到砖红色的颜色变化，则为阳性结果，否则为阴性。
3. 结果表示
菌落计数公式：N＝P＋F(CF/nF)＋R(CR/nR)

铜绿假单胞菌检测(滤膜法)

铜绿假单胞菌检测（滤膜法）
录入时间:2015-4-27 10:30:42 来源：青岛海博生物
一、原理
将250mL水样用孔径为0.45μm的滤膜过滤，并将滤膜移至CN琼脂培养基上，于36℃士1℃恒温箱中培养48h，能够在溴化十六烷基三甲铵选择性培养基上生长并产生绿脓菌素，或者能够在溴化十六烷基三甲铵选择性培养基上生长并且氧化酶呈阳性、紫外光（360±20nm）照射下能发荧光、能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌，经证实为铜绿假单胞菌，则其检测结果为阳性。

二、培养基和试剂
1.假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂（配制好之后低温避光保存）
2.金氏B（King’s B）培养基（配制好之后低温避光保存）
3.乙酰胺肉汤（用蒸馏水配制，配置好之后低温避光保存）
4.营养琼脂
5.氧化酶试剂
6.钠氏试剂（配制好之后低温避光保存）
7.设备和仪器
8.玻璃器具：所有玻璃器皿使用前需121℃高压蒸汽灭菌15分钟
9.恒温培养箱：36℃±1℃
10.紫外灯：波长应为360±20nm
11.滤膜：直径47mm，微孔径为0.45μｍ（处理方法：如滤膜未经灭菌，则使用前需先将
滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每次15 min。

前两次煮沸后需更换水，用蒸馏水洗涤2次～3次，以除去残留溶剂。

建议使用一次性无菌滤膜。

）12.显微镜：10×～100×
13.冰箱：0℃～8℃
三、操作流程图。

铜绿假单胞菌检验方法

铜绿假单胞菌检验方法铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的病原菌，广泛存在于自然环境中，尤其在水体和土壤中较为常见。

它是一种革兰阴性杆菌，具有极强的耐受性和适应性，可在各种环境条件下生存和繁殖。

铜绿假单胞菌具有多种致病因子，可引起多种感染疾病，如呼吸道感染、尿路感染、创伤感染等，对免疫力较低的人群尤为危险。

铜绿假单胞菌的检验方法主要包括传统的实验室培养和分子生物学方法。

下面将介绍几种常用的铜绿假单胞菌检验方法。

1. 培养方法铜绿假单胞菌的培养常用的培养基有MacConkey琼脂、Eosin Methylene Blue琼脂、香槟琼脂等。

这些培养基能够选择性地培养铜绿假单胞菌，并通过它们的特殊染色反应来区分铜绿假单胞菌与其他细菌。

在培养过程中，需要注意严格控制培养基的温度、湿度和时间，以促进菌落的生长和繁殖。

2. 生化试验生化试验是铜绿假单胞菌鉴定的重要手段之一。

常用的生化试验包括氧化/发酵试验、葡萄糖氧化酶试验、酮酸氧化试验等。

这些试验能够通过菌株对特定底物的反应来判断是否为铜绿假单胞菌。

此外，还可以通过菌株对不同抗生素的敏感性试验来确定其耐药性情况。

3. 分子生物学方法随着分子生物学技术的发展，PCR（聚合酶链式反应）和基因测序等方法逐渐应用于铜绿假单胞菌的检验中。

通过PCR扩增特定基因片段，如16S rRNA基因，可以快速、准确地鉴定铜绿假单胞菌。

同时，基因测序可以进一步确定菌株的亚型和毒力因子等信息，为临床治疗和流行病学调查提供重要依据。

4. 抗生素敏感性试验铜绿假单胞菌对多种抗生素具有较高的耐药性，因此抗生素敏感性试验对临床治疗具有重要意义。

常用的抗生素敏感性试验包括纸片扩散法（Kirby-Bauer法）和微量稀释法（MIC法）。

通过这些试验可以确定铜绿假单胞菌对不同抗生素的敏感性，从而指导临床医生选择合适的抗生素治疗。

总结起来，铜绿假单胞菌的检验方法主要包括培养方法、生化试验、分子生物学方法和抗生素敏感性试验。