替莫唑胺耐药胶质瘤细胞U251的生物学特性的实验研究

基因缺失，其中－ＳＥＡ、－α３．７、－α４．２是最为常见

的３种基因缺失类型，α地贫基因的缺失使α珠蛋白生成完全受阻，可引发ＨｂＢａｒｔ＇ｓ胎儿水肿综合征，导致胎儿发生严重的缺氧水肿，造成妊娠中后期的胎儿死亡或出生或不久即可死亡。β地贫基因以点突变最为常见，其基因类型和频率的分布有更明显的地域和种族差异，若β地贫基因突变为β０或β

＋突变杂合子的β－珠蛋白链生成，

则贫血程度较轻，可无或仅有轻微症状的贫血改变，若为β０纯合子或双重杂和子无β链生成，则为重度的β地贫，需以输血维持生命，如不采取治疗措施，患者多在５岁

前死亡［７］

。

综上所述，佛山市南海区的地贫基因携带率较高，本地区应加强进行孕前优生健康检查，对发现地贫基因携带者提供遗传咨询，进行重点预防和控制，以确保母婴生殖健康。

［参考文献］

［１］　刘可，朱洁明，黄嘉欣，

等．基于国家免费孕前优生健康检查的中医健康管理模式对预防新生儿出生缺陷的临床价值分析

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周知，吴维学，等．海南省东方市育龄夫妇地中海贫血基因检测结果分析［Ｊ］．中华地方病学杂志，２０１８，３７（１）：６９－７２．

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［收稿日期］２０１９－０１－１４

＊［

基金项目］包头市医药卫生科技发展基金计划项目（２０１３Ｓ２００６－１－１５）△［

通讯作者］Ｅ－ｍａｉｌ：１３９４７２５４８０８＠１３９．ｃｏｍＤＯＩ：１０．１６０９６／Ｊ．ｃｎｋｉ．ｎｍｇｙ

ｘｚｚ．２０１９．５１．０４．００４替莫唑胺耐药胶质瘤细胞Ｕ２５１的

生物学特性的实验研究＊

刘来兴，陈　磊，邓轶鑫，赵翠梅，王翔毅△

（内蒙古包钢医院神经外科，内蒙古包头　０１４０１０

）［摘要］目的　观察耐替莫唑胺胶质瘤细胞的生物学特性。方法　Ｕ２５１　ＭＧ细胞的复苏、传代、细胞耐药分步诱导、ＭＴＴ法检测Ｕ２５１　

ＭＧ／ＴＲ对ＴＭＺ的耐药指数、ＣＣＫ８法检测替莫唑胺对两组细胞增殖能力的影响、细胞集落法计数细胞集落。结果　建立脑胶质瘤耐药细胞系Ｕ２５１／ＴＲ　Ｕ２５１ＭＧ／ＴＲ比Ｕ２５１ＭＧ

有更强的替莫唑胺耐药性，且对替莫唑胺的ＩＣ５０是Ｕ２５１ＭＧ的１１．１４倍。结论　本研究观察耐替莫唑胺胶质瘤细胞的生物学特性，为进一步研究替莫唑胺对胶质瘤的耐药机制建立基础，为临床替莫唑胺药物治疗抵抗提供新的研究思路。

［关键词］胶质瘤细胞；替莫唑胺；耐药

［中图分类号］Ｒ９７８．１　［文献标识码］Ａ　［论文编号］１００４－０９５１（２０１９）０４－０３９３－

０３Ｔｈｅ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｓｔｕｄｙ　

ｏｎ　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆＴｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ｇｌｉｏｍａ　Ｃｅｌｌ　

Ｕ２５１＊

ＬＩＵ　Ｌａｉ－ｘｉｎｇ，ＣＨＥＮ　Ｌｅｉ，ＺＨＡＯ　Ｃｕｉ－ｍｅｉ，ＤＥＮＧ　Ｙｉ－ｘｉｎ，ＷＡＮＧ　Ｘｉａｎｇ

－ｙｉ△

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ｂａｏ　Ｇａｎｇ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂａｏｔｏｕ０１４０１０　Ｃｈｉｎａ）［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊ

ｅｃｔｉｖｅ　Ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｎｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ　ｇｌｉｏｍａ　ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｕ２５１　ＭＧ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｅｄ，ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄ，ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｓｔｅｐ　ｂｙ　ｓｔｅｐ，ＭＴＴ　ａｓｓａｙ　

ｗａｓｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎｄｅｘ　ｏｆ　Ｕ２５１　ＭＧ／ＴＲ　ｔｏ　ＴＭＺ，ＣＣＫ８　ａｓｓａｙ　

ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ，ｃｅｌｌ　ｃｏｌｏｎｙ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄｔｏ　ｃｏｕｎｔ　ｃｅｌｌ　ｃｏｌｏｎｉｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｄｒｕｇ

－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｇｌｉｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ　Ｕ２５１／ＴＲ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｕ２５１ＭＧ／

ＴＲ　ｗａｓ　ｍｏｒｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｔｏ　ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ　ｔｈａｎ　Ｕ２５１ＭＧ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ＩＣ５０　ｏｆ　ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ　ｗａｓ　１１．１４　ｔｉｍｅｓｔｈａｔ　ｏｆ　Ｕ２５１ＭＧ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｌｉｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｒｅｓｉｓｔ－ａｎｔ　ｔｏ　ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ，ｓｏ　ａｓ　ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ　ｒｅｓｉｓｔ－ａｎｃｅ　ｔｏ　ｇｌｉｏｍａ　ａｎｄ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ａ　ｎｅｗ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｉｄｅａ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］ｇｌｉｏｍａ　ｃｅｌｌｓ；ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ；ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ

脑胶质瘤又称脑神经胶质细胞瘤（ＧＢＭ），是一种起源于神经上皮细胞的原发性脑肿瘤。据统计，脑胶质瘤可占所有原发性中枢神经系统肿瘤的３２％，占中枢神经系统恶性肿瘤的８１％。其５年病死率在全身肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌，位列第３位［１］。此外，２０１２年中国肿瘤登记报告指出，中国脑及中枢神经系统恶性肿瘤死亡率为３．８７／１０万，位列十大高病死率肿瘤的第９位。因此以恶性胶质瘤为代表的中枢神经系统恶性肿瘤已成为亟待解决的临床问题以及当今肿瘤研究的热点。

作为成人中最常见的恶性原发脑肿瘤以及最具侵袭性的肿瘤，ＧＢＭ具有生长迅速、侵袭性强等特性［２］。临床上，ＧＢＭ的治疗主要以手术切除为主，术后放疗和化疗为辅。通过辅助放疗和化疗可明显延长胶质瘤患者的中位生存期，提高患者的生活质量。目前，国际上公认的胶质瘤化疗首选药物为替莫唑胺（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ，ＴＭＺ）［３］。替莫唑胺是第二代口服烷化剂，其进入体内后可不经肝脏代谢广泛分布于全身，并可透过血脑屏障进入脑脊液，在中枢神经系统中达到有效的药物浓度。然而随着长期的的临床研究，人们发现ＴＭＺ仅能小幅度的延长生存时间，仍有相当部分的胶质瘤对ＴＭＺ治疗不敏感或逐渐出现继发性耐药。即使采用了最为积极的治疗手段，ＧＢＭ患者的中位生存期仍然少于１５个月。因此，胶质瘤对ＴＭＺ的耐药被认为是胶质瘤化疗失败和胶质瘤复发的根本原因［４］。

１　材料与方法

１．１　实验材料　人胶质瘤细胞Ｕ２５１ＭＧ。

１．２　仪器与试剂　实验仪器：二氧化碳培养箱、倒置相差显微镜、低速自动平衡离心机、酶标仪、生物安全柜、纯水仪等。实验试剂：胎牛血清、ＤＭＥＭ培养基、胰蛋白酶、ＣＣＫ８、ＤＭＳＯ等。

１．３　方　法

１．３．１　Ｕ２５１ＭＧ细胞的复苏与传代　复苏细胞：将含有１　ｍｌ细胞悬液的冻存管在３７℃水浴中迅速摇晃解冻，加入４　ｍｌ培养基混合均匀。在１　０００ＲＰＭ条件下离心４　ｍｉｎ，弃去上清液，补加１～２　ｍｌ培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入１０　ｃｍ皿中，加入约８ｍｌ培养基，培养过夜）。第２日换液并检查细胞密度。细胞传代：如果细胞密度达８０％～９０％，即可进行传代培养。

１．３．２　细胞耐药分步诱导　将处于对数生长期的Ｕ２５１　ＭＧ细胞传代后，以６　０００／孔的密度接种在９６孔板里，测定ＴＭＺ对Ｕ２５１　ＭＧ细胞的半数抑

制浓度（ＩＣ５０）为１５．８６。待细胞生长稳定后，开始倍增药物诱导剂量，依次为１．２５、２．５、５、１０、２０、４０、８０、１６０μｇ／ｍｌ，每个剂量保持培养２０　ｄ左右。至第８个月末可诱导出对ＴＭＺ具有５－８倍耐药的细胞系，并命名为Ｕ２５１　ＭＧ／ＴＲ［５，６］。上述加药完成后，进行后续ＭＴＴ检测细胞活性，流式检测细胞凋亡情况。

１．３．３　ＭＴＴ法检测Ｕ２５１　ＭＧ／ＴＲ对ＴＭＺ的耐药指数。

１．３．４　ＣＣＫ８法检测替莫唑胺对两组细胞增殖能力的影响　替莫唑胺耐药株培养基：ＤＭＥＭ基础培养基＋１０％胎牛血清＋１％青霉素／链霉素＋１６μｇ／ｍｌ替莫唑胺。正常细胞培养基：ＤＭＥＭ基础培养基＋１０％胎牛血清＋１％青霉素／链霉素。取正常培养的处于对数期的人胶质瘤细胞Ｕ２５１ＭＧ替莫唑胺耐药株（Ｕ２５１　ＭＧ／ＴＲ）和人胶质瘤细胞Ｕ２５１ＭＧ细胞，弃去原有培养基，加０．２５％胰酶１ｍｌ放进３７度培养箱，消化２　ｍｉｎ左右，显微镜下观察待细胞全部变圆变亮后轻轻拍打培养皿边缘使其全部脱落，加３　ｍｌ培养基终止消化，收集细胞悬液放入１５　ｍｌ离心管，１　０００　ｒｐｍ离心３　ｍｉｎ，弃去上清，加１　ｍｌ完全培养基重悬，按所需比例传代至新的培养皿里。进行ＣＣＫ－８实验收集Ｕ２５１　ＭＧ和Ｕ２５１ＭＧ／ＴＲ对数期细胞，调整细胞悬液浓度，药物梯度依次为：０、０．２５、０．５、１、２、４、８、１６、３２　ｕｇ／ｍｌ，每孔１００μｌ，设３个复孔。在酶联免疫检测仪ＯＤ４５０　ｎｍ处测量各孔的吸光值。

１．３．５　细胞集落法计数细胞集落　替莫唑胺耐药株培养基：ＤＭＥＭ基础培养基＋１０％胎牛血清＋１％青霉素／链霉素＋１６μｇ／ｍｌ替莫唑胺。正常细胞培养基：ＤＭＥＭ基础培养基＋１０％胎牛血清＋１％青霉素／链霉素。取正常培养的处于对数期的人胶质瘤细胞Ｕ２５１　ＭＧ替莫唑胺耐药株（Ｕ２５１ＭＧ／ＴＲ）和人胶质瘤细胞Ｕ２５１ＭＧ细胞，弃去原有培养基，加０．２５％胰酶１　ｍｌ放进３７度培养箱，消化２ｍｉｎ左右，显微镜下观察待细胞全部变圆变亮后轻轻拍打培养皿边缘使其全部脱落，加３　ｍｌ培养基终止消化，收集细胞悬液放入１５　ｍｌ离心管，１　０００ｒｐｍ离心３　ｍｉｎ，弃去上清，加１　ｍｌ完全培养基重悬，按所需比例传代至新的培养皿里。

收集Ｕ２５１　ＭＧ和Ｕ２５１　ＭＧ／ＴＲ对数期细胞，调整细胞悬液浓度，５％ＣＯ２，３７℃孵育，至细胞贴壁，加入含有不同浓度药物的新鲜完全培养基，前１日下午铺板，次日上午加药。药物梯度依次为：０、１、２、４、８　ｕｇ／ｍｌ，每孔２　ｍｌ，设３个复孔。每３　ｄ更换１次含有不同浓度药物的新鲜完全培养基，持续２周，