逆转胶质瘤贝伐单抗和替莫唑胺治疗耐药的方法及机制研究

逆转胶质瘤贝伐单抗和替莫唑胺治疗耐药的方法及机制研究第一部分胶质瘤干细胞通过自噬诱导贝伐单抗耐药的机制及其逆转研究胶

质母细胞瘤(glioblastomamultiforme,GBM)是最常见,也是人类生存预后最差的原发性恶性脑肿瘤。手术切除,术后替莫唑胺(temozolomide,TMZ)联合同步放疗再加以辅助化疗已成为临床上普遍采取的新诊断GBM的标准治疗方案。

然而,即便经积极治疗后,GBM患者中位生存期仅为14.6个月,成人高级别胶质瘤的1年及5年生存率分别约30%和13%。贝伐单抗(bevacizumab)是一种重组人源性靶向VEGFA的单克隆中和性抗体,于2009年被批准用复发性胶质母细胞瘤。

临床研究显示,贝伐单抗的使用尽管延长了无进展生存期,但对于GBM患者

总生存期并无显著提高。本课题组前期已研究了胶质瘤血管拟态(vascular mimicry)的特征及形成机制,发现胶质瘤干细胞具有形成血管拟态的能力,并且VEGFR2在胶质瘤干细胞形成血管拟态的过程中发挥关键作用。

目前,血管拟态对于针对靶向VEGF的抗血管生成治疗策略(如贝伐单抗)缺

乏反应。前期实验也显示,在没有VEGF的环境中,胶质瘤干细胞依然可以形成血管拟态。

自噬(autophagy)是细胞一种进化保守的生物学过程,细胞可以通过自噬过

程将细胞质和细胞器等组分包裹到自噬体(autophagosome)中,然后自噬体与溶

酶体融合形成自噬溶酶体(autolysosome)降解其内所包裹的物质。已有研究表明,缺氧诱导的自噬促进了肿瘤细胞在抗血管生成治疗中的生存,而且抗血管生成药物可以通过HIF1α促进肿瘤干细胞的富集。

肿瘤的抗血管生成治疗(如贝伐单抗)治疗效果不佳的因素包括很多,其中血管旁路形成便是其中重要的原因。血管拟态的主要形成细胞是肿瘤细胞,其结构

特点决定了其对抗血管治疗的不敏感性。

加之应用抗血管生成药物后,肿瘤内血管数量减少,血供不足,造成缺氧、乳酸增多等应激条件,可触发肿瘤细胞的自噬活性。自噬和血管拟态的已有研究可见,自噬和血管拟态在形成条件和机制上有很多相似之处。

提示,自噬可能参与了肿瘤血管拟态的形成,进而导致胶质瘤贝伐单抗抗血管生成治疗策略效果不佳的结果。活性氧族(Reactive oxygen species,ROS)是一组来源于氧分子的异质性的具有高度活性的离子或分子衍生物。

越来越多的证据表明ROS的作用是复杂和矛盾的,尤其是ROS参与了对维持细胞稳态非常重要的生物学过程。已有相关研究显示ROS在VEGF-VEGFR通路中发挥调控作用。

自噬可通过PI3K/AKT与ROS发生关联。本部分主要内容和拟讨论的问题包括:(1)探究自噬在胶质瘤贝伐单抗抗血管生成治疗中的作用;(2)探究胶质瘤干细胞通过自噬诱导贝伐单抗耐药的机制。

结果:1.联合使用氯喹可改善贝伐单抗对胶质母细胞瘤干细胞移植小鼠的治疗效果;2.自噬通过ROS-PI3K/AKT通路活化胶质瘤干细胞的VEGFR-2。结论:本部分研究阐明了胶质瘤干细胞内自噬、ROS、PI3K/AKT与VEGFR-2磷酸化活化几者之间的关系,阐明胶质瘤干细胞通过自噬活化VEGFR-2的分子机制。

从而证实血管拟态这一血管旁路是胶质瘤患者使用贝伐单抗的抗血管治疗效果不佳的重要原因,为肿瘤病人开展个体化抗血管治疗提供理论基础和实验依据。第二部分炎症小体-IL-1β通路在胶质瘤替莫唑胺耐药中的作用及机制研究肿瘤耐药已成为肿瘤化疗药物效果不佳甚至失败的主要原因,其产生机制复杂,涉及多种因素的共同作用。

因此,肿瘤耐药机制研究应从多途径、多环节、多层次及多靶点上进行考虑,这样才能提高肿瘤化疗药物的治疗效率。替莫唑胺,一种咪唑类衍生物,作为第二代烷化剂在1999年被FDA批准用于复发性GBM,并在2005年推广用于新诊断GBM 的一线化疗药物。

同步放疗及联合辅助化疗可以使GBM患者中位生存时间由12.1个月延长到14.6个月,两年生存率由10.4%提高到26.5%。然而,55%的GBM患者因O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(06-methylguanine DNA methyl-transferase,MGMT)的高表达并未从替莫唑胺化疗中受益。

由于GBM本身分子特征的多样性、异质性、和复杂性,关于替莫唑胺治疗抵抗的机制研究以及相应的治疗策略仍有待进一步探究。炎症小体是一种可以活化caspase-1的多蛋白复合体。

炎症小体的活化使这些细胞分泌释放成熟IL-1β和IL-18到胞外,进而发挥相应生物学功能。炎症小体在肿瘤发生发展中的作用已有相关报道。

研究显示,IL-1β能直接驱动胃癌、乳腺癌的发生或免疫监视机制从而促进肿瘤进展。炎症小体促进黑色素瘤和肺癌肿瘤血管生成,以及在乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌侵袭转移中的作用也有报道。

就GBM而论,目前一线化疗药物替莫唑胺通过其烷化作用,使肿瘤细胞的DNA 出现错配修复反应,进而导致胶质瘤细胞凋亡。这种反应对胶质瘤细胞来讲,是一种很大的应激,故很有可能激活胶质瘤细胞内炎症小体通路,使其分泌IL-1β,再通过分泌出的IL-1β激活下游信号通路,发挥一定的生物学功能。

结合我们课题组之前的基因芯片结果,胶质瘤干细胞相对于非干细胞高表达分泌IL-1β,我们推测NLRP3炎症小体-IL-1β通路可能是胶质瘤替莫唑胺治疗

抵抗的机制之一。本部分主要内容和拟讨论的问题包括:(1)探究替莫唑胺处理对胶质瘤细胞NLRP3炎症小体-IL-1β通路的影响,及此通路在胶质瘤替莫唑胺治疗抵抗中的作用;(2)研究IL-1β通过下游何种通路机制发挥生物学功能。

结果:1.替莫唑胺能活化胶质瘤细胞内NLRP3炎症小体通路,胶质瘤细胞分泌IL-1β增多;2. IL-1β中和抗体阻断IL-1β通路提高瘤细胞对替莫唑胺治疗的敏感性;3.阻断IL-1β通路降低替莫唑胺处理后胶质瘤细胞MGMT的表达,干性以及IL-6的表达。结论:本部分内容初步阐明了 NLRP3炎症小体-IL-1β通路介导胶质瘤替莫唑胺耐药的作用及机制,认识到其在胶质瘤耐药中的重要意义,为针对这一通路的胶质瘤治疗策略提供基础理论和实验依据。