薄层色谱参数比移值
薄层色谱鉴别介绍
在给定的条件下（吸附剂、展开剂、板层厚
度等），化合物移动的距离和展开剂移动的 距离之比是一定的，即Rf值是化合物的物理 常数，其大小只与化合物本身的结构有关， 因此可以根据Rf值鉴别化合物。
比移值
组分二 组分一
被分离 混合物
薄层色谱展开示意图
薄层色谱法
优点
操作简单，定性结果直观
缺点
有一定毒性、定量方面的精密度 较差
却后使用。
固定相（吸附剂）的选择
纤维素、淀粉 硅酸镁 硫酸钙 硅胶 佛罗里硅土 氧化镁 氧化铝 对极性有机物的吸附作用增强
活性炭
2
供试品的制备：按照各药品质量标准规
定的方法进行提取分离。制得的供试品应放 置于密塞的小瓶中，防止溶剂挥发影响点样 量。 3 对照品溶液的制备：可按质量标准规定 精配成一定浓度的对照品溶液，置密塞小瓶 中备用。标准药材对照溶液，一般需照供试 品的制备方法制备。在使用对照品溶液时一 定要注意将取样的毛细管充分洗干净，防止 造成对照品污染。
二．展开室应放在水平、稳定的实验台上，不能有阳光直射， 也不能在通风处放置，离开热源，避免温度波动对分离不利； 光敏物质的分离应将展开室置于暗处进行。 三．点样时间不应超过三分钟。硅胶的硅醇基以氢键形式优 先吸附水，物理吸附使硅胶的活度降低，影响了弱极性物质 的吸附，化合物的Rf值相应地增大。硅胶薄层的吸水速度很 快，当用预先经过活化的薄层板，在点样过程中干燥的薄层 会立即吸附空气中的水蒸气，在数分钟内达到平衡，吸附水 蒸气的量决定于点样速度即暴露在空气中的时间和空气的相 对湿度。Dallas指出0.25mm厚、20cm×20cm的硅胶薄层 板在50%相对湿度中放置约3min就失去活性的一半，而放 置15min时吸附的水分已达到最大值。在用相同条件分离同 一组化合物得到的结果不能重现时，必须考虑到相对湿度对 展开的影响，特别是我国南北地区湿度相差很大；即使在同 一实验室冬夏季节不同湿度也有明显差别，如果不注意湿度 的影响就得不到预期的结果。
薄层色谱法简介
➢ TLC定量分析时，样品量的适宜范围为最小检出量的几倍至几 十倍。
➢ 样品原点一般在1mm左右为佳，原点过大或样品量过大，会导 致分离变坏。
薄层色谱的展开剂
➢ 薄层色谱的展开，需在密闭容器中进行，使展开 剂蒸气在缸内达平衡。
➢ 硅胶为固定相主体的正相色谱，溶剂的极性越大， 对化合物的洗脱能力越大，即Rf值越大。
（1）碘蒸气显色：将展开的薄层板挥发干展开剂后，放在盛 有碘晶体的封闭容器中，升华产生的碘蒸气能与许多有机物分子 形成有色的缔合物，完成显色。
（2）紫外线显色：用掺有荧光剂的固定相材料制板，展开后 用紫外线照射展开的干燥薄层板，板上的有机物会吸收紫外线， 在板上出现相应的色点，可以被观察到。
薄层色谱的使用操作
下降法
（3）下降法：用滤纸或纱 布等将展开剂吸到薄层板的 上端，使展开剂沿板下行， 这种连续展开的方法适用于 Rf值小的化合物。
薄层色谱的使用操作
3.显色
分离的化合物若有颜色，很容易识别出来各个样点。但多数情 况下化合有颜色，要识别样点，必须使样点显色。通用的显色方 法有碘蒸气显色和紫外线显色。
• （3）若在同一板上点几个样，样点间距离应为1 ～ 1.5 cm
• （4）点样要轻，不可刺破薄层 • （5）点样结束待样点干燥后，方可进行展开
薄层色谱的使用操作
2.展开
（1）上升法： 将色谱板垂直于 盛有展开剂的容器中，适合于含 粘合剂的色谱板。
上升法
薄层色谱的使用操作
倾斜上行法
（2）倾斜上行法： 色谱板倾 斜10～15°，适用于干板或无 粘合剂软板的展开；色谱板 倾斜45～60°，适用于含有粘 合剂的色谱板
（2）若所选展开剂几乎不能使混合物中的组分点移动，留在了 原点上，此溶剂的极性过弱。
薄层鉴别(8.3)
• （二）点样 • 薄层点样分为手工点样和点样器自动点 样。手工点样简单、快捷，但展开效果 与实验者的熟练程度有较大的关系；自 动点样斑点均匀、大小一致、展开后效 果较好，但仪器价格昂贵。
• • • •
手动点样工具 （1）注射器 （2）毛细管 （3）点样笔
• 一般为圆点状或窄细的条带状，点样基 线距底边10~15mm，直径一般不大于3 mm，条带状宽度一般为5~10mm。 • 点样量一般应控制在6ul以下，否则样品 斑点扩散，影响分离；样品量较低时， 点样量可最大增加至20ul。 • 当使用高沸点溶剂如正丁醇时，点样后 应将溶剂充分晾干，必要时可用电吹风 吹干。
可以依次用不同 极性的溶剂，如 石油醚→乙醚→ 三氯甲烷→乙酸 乙酯→正丁醇进 行提取，对供试 品进行分离、纯 化。
常用的吸附剂有 大孔树脂、氧化 铝、硅胶、聚酰 胺等，根据供试 品的特点选择不 同的吸附剂。
对含有挥发 性成分的供 试品，可采 用华法。
对成分复杂的供试品，有时可同时采用2～3种净化方法对 供试品进行处理。
5个薄层鉴别----7个品种
6个薄层鉴别----5个品种
一、 影响薄层色谱展开效果的主要因素
供试品溶液制备 点样 薄层板 展开剂 温度 湿度 显色
二、 对供试品溶液制备进行分析和讨论
由于中药成分的复杂，未知成分多， 供试品溶液中含有的物质较多，其中有被 测定成分，同时也有其他“杂质”成分， 因此常常由于相互干扰或背景污染而难以 得到满意的分离效果，有时甚至难以辨认， 对复方制剂尤其如此。所以为了充分发挥 薄层色谱技术在中药分析方面的优势，提 高色谱的分离度和重现性，供试品溶液的 制备（净化），是一个非常重要甚至是关 键的步骤。
四、复杂成分供试品净化的注意事项
薄层色谱方法
（3）其他固定相
①纤维素 按其用途不同分为普通纤维素（天然纤维
素、高纯度纤维素、微晶纤维素）、乙酰化纤 维素和离子交换纤维素。
②另外还包括聚酰胺，葡聚糖凝胶（亲水性葡 聚糖凝胶、亲脂性葡聚糖凝胶和葡聚糖凝胶离 子交换剂）和硅藻土等固定相。
2、粘合剂及添加剂
（1）粘合剂 理想的粘合剂要求亲水性好、粘结力强
（二）薄层色谱与高效液相色谱的比较
色谱系统 展开方式 流速控制 平衡时间 分析样品 样品量 板高（μm） 有效板数 检测方式 溶剂用量 溶剂更换 固定相
薄层色谱
开放式 展开 吸附剂的毛细管作用 短 可同时分析多个样品 高 30 <600 静态 少 易 一次弃去
高效液相色谱
闭路 洗脱 由泵调节 不定 每次一个样品 低 2~5 ~5000 动态 多 难 反复使用
好的牢度，预制板有用玻璃板，塑料片或铝箔作为 载板，使薄层附着在上面，塑料片或铝箔的预制板 还有裁剪方便的优点。常用于薄层定量。
（2）手工制板 手工制板一般分为不含粘合剂的软板及
含粘合剂的硬板两种。
软 上用板手干是工法将制吸涂板附成所剂均用直匀的接的玻于薄璃玻层板璃即板可一般 为使用5c，m×但软20板cm疏，松1，0c操m×作不20方cm 或便 用，硬20因板cm此。×目2前0c很m少的使2m用m，厚主的要玻 璃板，要求板面平整，洗净后
几种不同点样方式的比较
A
B
C
A.长5~60mm，内径为0.2~0.05mm的熔融石英管；
B.微量注射器，机械控制，接触板面点样；
C.同B，用步进马达控制操作；
D.同B，完全用计算机控制点样。
方式 A B C D
薄层色谱法实验报告
薄层色谱法实验报告一、实验目的1、掌握薄层色谱法的基本原理和操作方法。
2、学习利用薄层色谱法分离和鉴定混合物中的成分。
二、实验原理薄层色谱法（Thin Layer Chromatography，TLC）是一种快速、简便、灵敏的分离和分析方法。
它基于混合物中各组分在固定相（吸附剂）和流动相（展开剂）之间的分配系数不同，从而在薄层板上实现分离。
吸附剂通常是硅胶、氧化铝等具有吸附性能的物质，它们均匀地涂布在玻璃板或塑料板上形成薄层。
展开剂则是一种能够在吸附剂上移动的溶剂系统。
当样品点在薄层板的一端，放入装有展开剂的层析缸中时，展开剂在毛细作用下沿着薄层上升，样品中的各组分随着展开剂的移动而在薄层上发生不同程度的吸附和解吸，导致它们在薄层上的移动速度不同，最终实现分离。
通过与已知标准物质在相同条件下的色谱行为进行比较，可以对样品中的成分进行定性分析。
同时，根据斑点的大小和颜色深浅，可以进行半定量分析。
三、实验仪器与试剂1、仪器玻璃板（5×20cm）层析缸点样毛细管（内径 05mm）喷雾器紫外光灯（254nm 和 365nm）烘箱2、试剂硅胶 G羧甲基纤维素钠（CMCNa）水溶液（05%）展开剂（石油醚乙酸乙酯体系，不同比例）样品溶液（混合有机化合物）标准物质溶液（已知有机化合物）四、实验步骤1、制板将硅胶 G 与适量的 05% CMCNa 水溶液在研钵中充分研磨，调成均匀的糊状。
用涂布器将糊状物均匀地涂布在玻璃板上，厚度约为 025 05mm。
置于水平台上晾干，然后在 105℃烘箱中活化 30 分钟，取出后置于干燥器中备用。
2、点样用点样毛细管吸取样品溶液和标准物质溶液，在距薄层板一端 1 15cm 处轻轻点样，点样直径一般不超过 2mm，每次点样后用电吹风冷风吹干，重复点样 2 3 次，以保证样品量足够。
3、展开在层析缸中倒入适量的展开剂，使其高度不超过 1cm。
将点样后的薄层板小心放入层析缸中，盖上盖子，使展开剂蒸气饱和层析缸 5 10 分钟。
薄层色谱
和颜色的深浅，并与标准品在相同条件下展开所得 到的一系列已知不同浓度的标准斑点相比较，而近 似地判断样品中所测成分的含量。 2 测面积法
展开后色谱上的斑点面积与化合物含量间，符 合一定的线性关系。 3 仪器测定法
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3 仪器测定法
用光密度计或称薄层扫描仪（TLC Scanner）扫描定量， 该方法已成为薄层定量的主要方法。 1.吸收测定法
相对比移值，即相对于某一物质x的Rf值，用Rx 表示。 其定义为：Rx＝组分的Rf值／物质x的Rf值 组分A相对于物质B的“相对比移值” RB =a/b
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三.薄层色谱的操作
吸附剂的选择 薄层板的制作 展开剂的选择 点样 展开 定位与显色 薄层层析的定量测定
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(一) 薄层层析用的吸附剂
常用的薄层层析吸附剂有硅胶、氧化铝、纤 维素、聚酰胺等。
吸附剂的选择：首先决定于样品成分的性质， 即它们的溶解性、酸碱性、极性以及是否与 吸附剂起化学反应等；
其次要考虑吸附剂、载体是否容易得到及其 价格等。
8
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(二) 薄层板的制作
层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（纸浆、纤维素、硅胶、 中性氧化物、聚酰胺、多孔性玻璃粉，硅烷化键合硅胶等）均匀 地涂在在薄层板（玻璃板、金属板或弹性塑料板）上，干燥 （110℃活化）后即可使用。
2.点样量
点样量的多少与薄层的性能、厚薄及显色剂的 灵敏度有关。一般来说，样品量最小为几ng，常用 量为几至几十µg，制备型的分离可以点样到mg量。 总之点样量随分离目的而定。
3.点样方式 最好是直径3—5mm的圆点。
常用的点样方式
a 一般点样 b 径向点样 c 条状点样 d 线形小孔点样
经典液相色谱法2
吸附剂粒径对展开速度、Rf 值和分离效果的影响： • 颗粒大，则总表面积小，吸附量低，展开速度快，展 开后斑点较宽，分离效果差。 • 颗粒太小，则展开速度太慢，而且不易用干法铺板。 因此，应该选用颗粒大小适宜的吸附剂，而且其 粒度分布要窄。 吸附剂颗粒大小表示方法： • 颗粒直径(以µm表示)， • 筛子单位面积的孔数(以目表示) 干法铺板所用吸附剂颗粒直径一般在75～100µm 或150～200目较为合适，而湿法铺板则用更细的颗粒， 为10～40µm或250～300目。聚酰胺则一般在100～180 目范围内。高效薄层板的颗粒直径为5～10µm。
在薄层色谱使用的一般条件下，固定相、流动 相都不很明确，它们都与蒸汽相一起维持着一种变化 的状态，在分离过程中这三相都可能不断在变化。 • 在使用混合溶剂时，在展开过程中极性较弱、沸点 较低的溶剂在薄层板边缘容易挥发，致使边缘部分的 展开剂中极性溶剂的比例增大，使Rf值相对变大。同 一物质在同一薄层板上出现中间部分的Rf值比边缘的 Rf值小，这种现象称为边缘效应。
2. 软板的制备：直接铺制吸附剂。 3. 粘合薄层板(硬板)的铺制 (1)粘合剂：粘合剂的种类与用量会影响分离的效果，常用 的有煅石膏、羧甲基纤维素钠(CMC−Na) 和某些聚合物 如聚丙烯酸等。参看《分析化学实验》。 (2)倾注法制板：1. 在玻板上倾倒吸附剂糊，2. 用洁净玻棒 涂铺均匀，3. 稍加振动。 (3)平铺法制板：在水平台面上先放置玻璃平板，上面放置 载板，二边加上玻璃条做成的框边(框边高于载板0.25～ lmm)，将吸附剂糊倒在载板上，刮平并振动均匀。 上述两法所铺薄层板只适宜于一般定性分离，不宜 于定量分离。
2．相对比移值 (Rr) 由于影响 Rf 值的因素很多，要在不同实验室、不 同实验者间严格控制色谱条件的一致性，达到 Rf 的可 比性很困难。因此建议采用相对比移值(relative Rf ；Rr) 作为定性参数： Rr = Rf (a)／Rf (s) =la／ls (19·2)
《仪器分析》——平面色谱法
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（三）高效薄层法（high performance thin layer chromatography；HPTLC）
• 在现代色谱理论指导下，以经典薄层色谱法为基 础发展起来的一种薄层色谱技术。
• 特点
分离效率高 分析速度快 检测灵敏度高等
高效薄层色谱法与经典薄层色谱法比较见表19-3
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二、吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂
(2)吸附剂
不活泼
活泼
B’ B
非极性
A’ A
极性
(3)展开剂 C
C’
非极性
极性
(1)被分离物质
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三、薄层色谱操作方法
（一）薄层板的制板 选择 5cm 20cm 、10cm 20cm、 20cm 20cm
涂布 活化
不加粘合剂 加粘合剂如5~15%石膏 或 0.25~0.75%CMC-Na
涂布
晾干
0.2～0.3mm
光物质；在254nm波长紫外光下呈强烈黄绿色荧光 背景
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（二）展开剂
展开剂的选择
根据被分离物质的极性、吸附剂的活度和展开 剂的极性三者的相对关系进行选择
先用单一溶剂展开，然后根据分离效果进行调 整，经常使用混合展开剂
分离酸碱组分时，展开中加入少量酸、碱
常用混合展开剂 表19-3
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化合物极性、吸附剂活度和展开剂极性间的 关系
2. 相对比移值（Rr）
R =R /R =L /L
r
f(i)
f(s)
is
定性参数
纯物质加入试样中
同样条件下测定
或试样中某已知组分
i
s
Li Ls
s＋i
在一定程度上消除系统误差
薄层色谱法测定操作规程
标准操作规程目的：为规范薄层色谱法测定检查操作，确保实验的准确性，依据《中国药典》2020版四部和《药品生产质量管理规范》（2010年修订），特制定本规程。
适用范围：适用于用薄层色谱法进行鉴别、检查或含量测定。
依据：《中国药典》2020版第四部57页0502“薄层色谱法”《药品生产质量管理规范》2010年修订责任：检验员负责本规程的实施。
内容：1.简述：薄层色谱法系将供试品溶液点样于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的标准物质按同法所得的色谱图对比，亦可用薄层色谱扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。
2.TLC的原理：通常所说的薄层色谱一般是指吸附薄层色谱，可根据TLC所采用的涂层材料性质的不同，其物理化学原理也有所不同，可分为：2.1 吸附薄层色谱：采用硅胶、氧化铝等吸附剂铺成薄层，利用吸附剂表面对不同组分吸附能力的差别达到分离的方法。
最为广泛的方法由于混合物中的各个组分对吸附剂（固定相）的吸附能力不同，当展开剂（流动相）流经吸附剂时，发生无数次吸附和解吸过程，吸附力弱的组分随流动相迅速向前移动，吸附力强的组分滞留在后，由于各组分具有不同的移动速度，最终得以在固定相薄层上分离。
2.2 分配薄层色谱：由硅胶、纤维素铺成薄层，不同组分在指定的两相中有不同的分配系数。
2.3 离子交换薄层色谱：由含有交换活性基团的纤维素辅成薄层。
2.4 排阻薄层色谱：利用样品中分子大小不同，受阻情况不同加以分离，也称凝胶薄层。
3.仪器与材料：3.1 薄层板：按支持物的材质分为玻璃板、塑料板或铝板等；按固定相种类分为硅胶薄层板、键合硅胶板、微晶纤维素薄层板、聚酰胺薄层板、氧化铝薄层板等。
固定相中可加入黏合剂、荧光剂。
硅胶薄层板常用的有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254、G、H表示含或不含石膏黏合剂。
F254为在紫外光254nm波长下显绿色背景的荧光剂。
按固定相粒径大小分为普通薄层板(10～40μm)和高效薄层板(5～10μm)。
化验员培训6中药薄层鉴定
（四）分离度（R）
分离度（R）是两个相邻斑点的分离程度， 以两个斑点中心距离之差与其平均斑点宽 度之比。
R=2（d2-d1）/(W1+W2)
D为两个斑点中心间的距离，W为斑点宽度 。
三、 常规薄层色谱法 （一） 薄层板 （二） 点样 （三） 展开 （四） 显色与检视
（一）薄层板
化验员培训6 中药薄层鉴定
丛培臣
2019年5月19日
广泛适用性
薄层色谱最常用的是以硅胶板为基础固定相 的正相色谱，最适合中等极性成分的展开；
有多种组合的有机溶剂展开系统可供选择； ������
甲苯系统；氯仿系统、己烷系统、乙酸乙酯 类系统、正丁醇系统等。������
酸性、碱性、中性。������ 高极性、中等极性、低极性
应用领域
药品生产、检验 临床医学 环境监测 食品生产、检测 化学、化工
薄层色谱联用技术
薄层色谱-质谱联用 薄层色谱-核磁共振联用 薄层色谱-红外联用 薄层色谱-液相、气相色谱联用
课程内容
薄层色谱基础知识 中药薄层色谱鉴别中供试品溶液制备的注
意事项及方法
3、检视装置 为装有可见光、254nm及365nm 紫外光光源及相应的滤光片的暗箱。
同一薄层板在日光及紫外光灯下提供的信息不同
UV365nm
日光
四. 薄层色谱在药物分析中的应用 （一）.鉴别 （二）.限度检查 （三）.含量测定
（一）.鉴别
取适宜浓度的对照溶液与供试品溶液，在 同一薄层板上点样、展开与检视，供试品 溶液所显主斑点的颜色（或荧光）和位置 应与对照溶液的斑点一致。
1、点样时几个样点要在一条直线上，大小 要合适。
03薄层色谱法检验操作规程
目 的：建立薄层色谱法的标准操作规程。
范 围：本规程适用于薄层色谱法。
职 责：检验员、QC 主任。
依 据：《中国药典》2010年版。
内 容：方法一（中国药典2010年版一部）1 简述薄层色谱法系指以适宜的固定相涂布于玻璃板、铝箔片或聚酯薄膜上使成一均匀的薄层，将供试品与相应的对照物点于薄层板的一端，以适宜的溶剂置展开容器内展开，使供试品所含的相应成分分离，采用适宜的显色剂或显色方法显色，将供试品色谱与对照物色谱相比较，或采用薄层扫描仪扫描，以进行鉴别、检查或含量测定的方法。
2 仪器与材料2.1 薄层板按照固定相的种类，薄层板可分为正相薄层板（如硅胶薄层板、聚酰胺薄膜）、反相薄层板（如C 18键合相薄层板）等。
硅胶薄层板是目前使用最广的薄层板，如硅胶G 、硅胶GF 254、硅胶H 和硅胶HF 254等。
高效薄层板所使用的固定相较普通薄层板平均粒度小，颗粒分布范围窄，因此在相对短的展开距离中可以达到更好的分离效果。
目前使用的薄层板有市售薄层板和自制薄层板两种。
一般市售薄层板分离效果较自制薄层板好。
如需特殊薄层板（如改性板）时，可采用自制薄层板。
2.2 点样器2.2.1 手动点样主要用微升毛细管、微量注射器或配合与之相应的手动点样仪等。
2.2.2 自动点样采用半自动点样仪或全自动点样仪，按预设程序自动点样。
2.3 展开容器 又称展开缸，为大小适宜的密闭展开容器。
有双槽展开缸及平底展开缸等。
此外，也有自动展开仪器，可将薄层板按预定程序单次或多次展开，提高薄层展开的重现性。
2.4 显色设备包括喷雾显色、浸渍显色以及蒸气熏蒸显色的设备。
2.4.1 喷雾显色多用玻璃喷雾瓶或其它专用的喷雾设备，喷雾形成的雾滴应细小并且均匀。
2.4.2 浸渍显色多在盛有显色剂的展开缸中进行。
2.4.3 蒸气熏蒸显色可在密闭的展开缸、干燥器等设备中进行。
如薄层板需加热，可使用烘箱或专用的薄层加热台。
2.5 检视和记录设备由暗箱及摄像设备组成。
薄层色谱的实验报告
薄层色谱的实验报告一、实验目的1、掌握薄层色谱的基本原理和操作方法。
2、学会利用薄层色谱进行物质的分离和鉴定。
二、实验原理薄层色谱（Thin Layer Chromatography，TLC）是一种快速、简便、灵敏的分离分析技术。
其原理是基于混合物中各组分在固定相和流动相之间的分配系数不同，从而在薄层板上实现分离。
固定相通常是涂敷在玻璃板或塑料板上的吸附剂，如硅胶、氧化铝等。
流动相则是一种或多种溶剂的混合物。
当样品溶液点在薄层板的一端，并置于装有流动相的层析缸中时，流动相通过毛细作用沿板上升，样品中的各组分在固定相和流动相之间不断进行吸附和解吸，导致它们在板上以不同的速度移动，最终实现分离。
通过与已知标准物质在同一条件下进行色谱分析，并比较它们的 Rf 值（比移值），可以对样品中的组分进行定性鉴定。
三、实验仪器与试剂1、仪器薄层板（硅胶 G 板或氧化铝板）层析缸点样毛细管紫外灯喷雾显色剂装置2、试剂样品溶液（待分离和鉴定的混合物）标准物质溶液展开剂（根据样品性质选择合适的溶剂系统，如石油醚乙酸乙酯、氯仿甲醇等）显色剂（如碘蒸气、硫酸乙醇溶液等）四、实验步骤1、制备薄层板选择合适的玻璃板或塑料板，洗净并干燥。
称取适量的吸附剂（如硅胶 G 或氧化铝），加入一定量的蒸馏水或粘合剂（如羧甲基纤维素钠溶液），搅拌均匀成糊状。
将糊状物均匀地涂布在玻璃板或塑料板上，厚度一般为 025 05mm。
放置在水平台上，自然晾干后，在适当温度下活化一定时间，备用。
2、点样用点样毛细管吸取少量样品溶液，在距薄层板一端 1 15cm 处轻轻接触板面，形成一个直径约 2 3mm 的圆点。
点样时应注意控制样品量，避免斑点过大或过小。
同时点上标准物质溶液作为对照。
3、展开在层析缸中加入适量的展开剂，深度约 05 1cm。
将点样后的薄层板小心放入层析缸中，使点样端朝下，确保展开剂液面低于点样线。
盖上盖子，让展开剂通过毛细作用沿板上升，直到展开剂前沿接近板的顶端（一般上升高度为 8 10cm）。
薄层色谱和柱层析综述
聚酰胺
硅酸镁 多孔玻璃珠
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纤维素硅藻土
离子交换剂 反相键合硅胶（硅烷化处理）
5-薄层板的制备
将吸附剂均匀地涂铺在规定尺寸的玻璃板或其它平面板上， 这一过程称铺板或铺层，即制成薄层板。 板的好坏是分离成功与否的关键，好的板要求吸附剂涂铺 均匀，表面光滑，厚度一致。现有预制板出售。 制板方法主要有干法和湿法两种： （1）干法制板 氧化铝和硅胶可用干法铺板，干法铺层比较简便，制得的 板展开速度快，但展开后不能保存，薄层不牢固，喷显色剂时 易吹散。 方法：将吸附剂均匀地撒在薄层板上，两手用两端圈套的 玻璃棒滚动，厚度0.25～3mm，滚动不宜太快，不能停。 0.25mm左右主要是分析和分离用，3mm的厚板主要是制备色 谱用。
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将溶剂抽提中的一个相固定在硅胶上，装在柱内，并按色 谱法操作，使另一液相流过柱子，分离获得成功。从此出现了 基于分配原理的分配色谱法，因此获得了诺贝尔奖。以后的发 展采用了纤维素、继而采用滤纸作分配色谱载体，发展了纸色 谱法。薄层色谱法的研究和发展也出现在二十世纪的三、四十 年代，现在已和气、液色谱一起成为最常用的色谱分离、分析 方法。为与柱色谱相区别，并突出纸色谱和薄层色谱的特点， 这两种方法也叫平床色谱法（Flat bed chromatography）或平 面色谱法（Planar chromatography）。 色谱法经过多年的发展已有多种操作形式，其分类方法 也有多种。按固定相和流动相的物态可分为以气体为流动相的 气相色谱（包括气固色谱、气液色谱）和以液体为流动相的液 相色谱（包括液固色谱、液-液色谱）；如以固定相的操作方 式以及形状分类则有柱色谱、 纸色谱、薄层色谱；
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薄层色谱中，Rf值与组分的分配系数K值有关：
薄层色谱rf值的计算公式
薄层色谱rf值的计算公式薄层色谱（Thin Layer Chromatography, TLC）是一种用于分离化合物的常见技术，广泛应用于化学、药学、生化学、环境科学等领域。
在薄层色谱中，化合物被沿着一张涂有吸附剂的硅胶或氧化铝薄片上运移，通过化学吸附、物理吸附、离子交换或其他选择性相互作用进行分离。
而薄层色谱在实际应用中，对于每个化合物的检测与鉴定有一个关键指标，即“rf值（移动率）”。
rf值的计算公式rf值指的是一种运动速度比值，即化合物前进距离与溶剂前进距离之比。
换句话说，rf值是一个化合物相对其他化合物在薄层色谱上运移的速度，而非绝对运动速度。
在薄层色谱中，化合物在运移过程中，会受到来自基质、溶剂等多种因素的影响，并且化合物的极性、分子量、溶剂极性等因素也会影响其在薄层色谱上的运移速度。
因此，要求出一个准确的rf值，需要事先选择合适的溶剂、基质，并控制温度、湿度等条件，同时对化合物进行正确的结晶、离子对形成和紫外吸收筛选等操作。
具体而言，rf值的计算公式为:rf = Df / Ds其中Df（化合物前进距离）是从基线（起始线）到化合物上沿的垂直距离，Ds（溶剂前进距离）是从基线到溶剂前缘上沿的垂直距离。
在实际中，为了计算rf值而测量Df和Ds，需要使用刻度尺或线性仪等工具。
评价时为了计算rf值，我们需要正确地确定Df和Ds的值，下面将简单介绍一些关键点。
如何选择基质基质是薄层色谱分离中不可或缺的一部分，它决定着分离的选择性和灵敏度。
基质种类很多，硅胶属于最常用的一种。
硅胶基质分为不同的等级，每级大小不等，通常数字越大，其粒径越小。
为了选择适合的基质，我们需要考虑以下因素：1. 化合物极性。
通常而言，基质的极性应该略低于化合物的极性，这样化合物可以被吸附在基质上。
因此，如果化合物是疏水性的，则硅胶G的选择是比较合适的，如果是极性化合物，则可以采用硅胶K。
2. 化合物分子量。
较大的化合物从表面吸附时间相对较长，因此较大的基质在筛选这些化合物时是比较有用的，如硅胶G、F254等。
tlc适宜的rf值
tlc适宜的rf值色谱技术（chromatography）是一种广泛应用于化学、药学、生物学等领域的分析方法。
薄层色谱（thin-layer chromatography，TLC）是其中一种简单、快速和有效的色谱技术。
在TLC中，样品溶液被施加在薄层吸附剂上，并通过溶剂在薄层上移动，分离成不同的化合物。
RF值是衡量化合物在TLC中迁移程度的指标，也是TLC中常用的重要参数之一。
RF值（retention factor，保留因子）定义为化合物迁移距离（假定为溶剂前端至化合物斑点垂直距离）与溶剂前端至起始线的距离之比。
RF值越大，表示化合物在TLC过程中迁移得越远；而如果RF值过小，则表示化合物吸附在薄层吸附剂上，几乎没有迁移。
TLC适宜的RF值对于分析和解释色谱图谱结果起着至关重要的作用。
以下是几个关于TLC适宜的RF值的重要考虑因素：1. 预期分离效果：不同的化合物在薄层上具有不同的亲和性和吸附能力。
通过确定化合物在TLC中的RF值，可以预测各化合物之间的分离程度。
在选择溶剂或调整溶剂系统时，可以根据所需的分离效果来确定适宜的RF值范围。
2. 样品性质：样品的物理化学性质是选择适宜RF值的重要考虑因素之一。
如果样品溶解度较低或具有较强的亲和性，则较小的RF值可能更适合，以防止化合物在起始线附近过度吸附并难以迁移。
相反，如果样品溶解度较高或亲和性较弱，则较大的RF值可能更适合，以确保化合物能够有效迁移。
3. 薄层吸附剂的选择：不同种类的薄层吸附剂具有不同的极性和吸附能力。
根据样品和需要分析的化合物，在合适的薄层吸附剂上探索具有适宜RF值的迁移条件。
4. 溶剂系统的优化：溶剂的选择和混合比例对于TLC中化合物的迁移速率和RF值有着重要的影响。
通常，在实验过程中需要尝试不同的溶剂系统，并根据所得结果确定最适合的溶剂系统来获得适宜的RF值。
总结起来，TLC适宜的RF值是根据具体的实验目的和样品性质来决定的。
薄层色谱参数比移值
操作方法
将1份固定相和3份水（或羧甲基纤维素钠 水溶液）在研钵中沿同一方向研磨混匀，去 除表面的气泡后，置玻璃板上使涂布均匀， 或倒入涂布器（见图8-14）中，在玻板上 平稳地移动涂布器进行涂布(涂层厚度为 0.2mm～0.3 mm)，取涂好的薄层板，置 水平台上于室温下晾干后，在110℃活化30 分钟，立即置于有干燥剂的干燥器中备用 。
1．吸附剂
三、仪器与材料
粒径 5~40 m
硅胶
硅胶H 硅胶G 硅胶GF254 硅胶HF254
氧化铝 常用
硅藻土 聚酰胺 微晶纤维素
想一想 H、G、F各代表何种意思？试解释硅胶HF365？
2． 载 板
种类
玻璃板 塑料膜
厚度 2mm
规格
5cm×20cm 10cm×10cm 10cm×15cm
10cm×20cm
分离效能
2． 鉴 别
等浓度对照法----同板---大致同位、同大、同色泽
等体积混合法----斑点单一、紧密 结构相似对比法-----Rf不同或两斑点
杂质对照品法 3．杂质检查 样品溶液的自身稀释对照法
二者合用法
4．定量方法
（1）目视比色法 -----半定量法（精度±10%） （2）斑点洗脱法
（3）薄层扫描法(正在减小使用)
四、操作技术
无黏合剂
分类
自制薄
含黏合剂
层板
10%～15%煅石膏
0.2%～0.5%羧甲基纤维 素钠水溶液
1．薄层 板制备
市售薄 层板
操作方法
普通薄层板(玻璃、聚酰胺薄膜和铝基) 分类 高效薄层板（固定相粒径为5~7 u）m
操作方法
临用前一般应在110℃活化30分钟。聚酰胺薄膜不需活 化。铝基片薄层板和聚酰胺薄膜可根据需要剪裁
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四、操作技术
无黏合剂
分类
自制薄
含黏合剂
层板
10%～15%煅石膏
0.2%～0.5%羧甲基纤维 素钠水溶液
1．薄层 板制备
市售薄 层板
操作方法
普通薄层板(玻璃、聚酰胺薄膜和铝基) 分类 高效薄层板（固定相粒径为5~7 u）m
操作方法
临用前一般应在110℃活化30分钟。聚酰胺薄膜不需活 化。铝基片薄层板和聚酰胺薄膜可根据需要剪裁
纸色谱上行展开
4．斑点定位
纸色谱法斑点的定位基本和薄层色谱法相似，但纸色谱法不能使用腐 蚀性显色剂，也不能在高温下显色。
运用纸色谱进行药物的鉴别、检查和含量测定的方法、要求与薄层色 谱法一致
二、薄层色谱参数
1．比移值 (1）定义 组分迁移的距离与展开 剂迁移的距离之比
(2)计算方法
原点到斑点中心的距离 R f 原点到溶剂前沿的距离
R f（A）
lA l0
R
f（B）
lB l0
2．相对比移值
(1）定义 指被测组分的比移值与参照组分的比移值之比
(2）计算方法
Rr
R f (i) R f (s)
第3节 薄层色谱分离检测技术
薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC) 将固定相均匀平铺在光洁表面的玻璃、塑料或金属板上
形成薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法 可分为吸附、分配、分子排阻色谱法等
一、分离原理
薄层色谱是一种开放性色谱，是将混合组分样品溶液点在薄层板一端的 起始线上，点样处称为原点，在密闭容器中用适宜的流动相（薄层色谱法中 又称为展开剂）展开。因吸附剂对不同组分的吸附能力不同，展开剂对不同 组分的解吸能力也不完全相同，造成各组分在薄层析上移动的速度有快有慢 ，经过一段时间展开后，不同的组分彼此分开，最终形成相互分离的斑点
钾试液
多数有机化 合物
多数有机化 合物
醛等还原性 物质
氨基酸类
含酚羟基化 合物
喷雾加热 多数加热后呈 黑色
薰蒸
多数显黄棕色
喷雾烘干 蓝色
喷雾或浸 紫色或黄色 渍
喷雾或浸 红褐色或棕红
渍色喷雾瓶来自5．显色装置浸渍槽
蒸气熏蒸 ----双槽展开缸
紫外分析仪(三用)
6．检 视装置 摄像设备
薄层色谱扫描仪(CS9301型）
点样量---- ＜5
ul
3. 展开
（1）展开要求 查阅 A.何为边缘效应?何因？如何防止?
B.展开剂加入量?展开剂展开距离？
（2）展开方式
上行 近水平 双向 多次
上行展开
近水平展开
有色物质斑点----目光检视
4．检视
荧光检出法
五、检测技术
无色物质斑点 化学检出法
检测灵敏度
1．系统适用性试验 比移值
1．吸附剂
三、仪器与材料
粒径 5~40 m
硅胶
硅胶H 硅胶G 硅胶GF254 硅胶HF254
氧化铝 常用
硅藻土 聚酰胺 微晶纤维素
想一想 H、G、F各代表何种意思？试解释硅胶HF365？
2． 载 板
种类
玻璃板 塑料膜
厚度 2mm
规格
5cm×20cm 10cm×10cm 10cm×15cm
10cm×20cm
li ls
/ l0 / l0
li ls
(3）特点
消除系统误差， 值的重复性和可靠性都比 好
Rr
Rf
3．分离度
（1)定义 衡量薄层色谱分离效果的重要指标，是 指相邻两斑点中心至原点的距离之差与 两斑点平均径向宽度（径向宽度是指斑 点沿着展开方向的宽度）的比值
(2）计算方法
R l2 l1 2(l2 l1 ) (W1 W2 ) / 2 W1 W2
操作方法
将1份固定相和3份水（或羧甲基纤维素钠 水溶液）在研钵中沿同一方向研磨混匀，去 除表面的气泡后，置玻璃板上使涂布均匀， 或倒入涂布器（见图8-14）中，在玻板上 平稳地移动涂布器进行涂布(涂层厚度为 0.2mm～0.3 mm)，取涂好的薄层板，置 水平台上于室温下晾干后，在110℃活化30 分钟，立即置于有干燥剂的干燥器中备用 。
二、仪器与材料 1．色谱滤纸
想一想:色谱滤纸如何选择?
2．展开剂
（1）纸色谱一般固定相是什么? （2）纸色谱展开剂如何选择?
3．展开容器 圆形或长方形玻璃缸，缸上具有磨口玻璃盖且能密闭
下行纸色谱展开缸
三、操作技术
1．色谱滤纸的准备
（1）用于下行法的色谱滤纸 （2）用于上行法的色谱滤纸
2．点样 样品溶解于适宜的溶剂中制成一定浓度的溶液。用定量
毛细管或微量注射器吸取溶液，点于点样基线上，溶液宜分 次点加，每次点加后，俟其自然干燥、低温烘干或经温热气 流吹干，点样直径为2 mm～4mm，点样量取决于色谱滤纸的 薄厚程度和显色剂的灵敏度，一般几到几十微克。点间距离 约为1.5cm～2.0cm，样点通常为圆形，也可点成条形。
3．展开
纸色谱下行展开
金属箔
要求 表面光滑、平整清洁
玻板处理措施 清洁剂或铬酸洗液浸泡洗涤，用清水充分清洗，再用 蒸馏水或去离子水冲洗，表面应不附水珠，晾干备用
定量毛细管
手动
3．点样器
平口微量注射器
全自动点样仪
3．展 开容器
平底色谱专用展开缸
双槽薄层色谱专用展开缸
4．显色剂
显色剂
适用范围
显色方法 斑点颜色
浓硫酸乙醇溶液 碘 磷钼酸乙醇溶液 茚三酮试液 三氯化铁-铁氰化
手动涂布器
2．点样
普通板 点样基线----距底边2.0cm 圆点状---- R≤3mm 条带状-----宽度5～10mm 点或条带间距----＜8mm
点样量---- ＜10
ul
高效板 点样基线----距底边0.8~1cm 圆点状---- R≤2mm 条带状-----宽度4～8mm 点或条带间距----＜5mm
分离效能
2． 鉴 别
等浓度对照法----同板---大致同位、同大、同色泽
等体积混合法----斑点单一、紧密 结构相似对比法-----Rf不同或两斑点
杂质对照品法 3．杂质检查 样品溶液的自身稀释对照法
二者合用法
4．定量方法
（1）目视比色法 -----半定量法（精度±10%） （2）斑点洗脱法
（3）薄层扫描法(正在减小使用)
第4节 纸色谱分离技术
一、分离原理(液-液萃取 ) 利用样品中不同组分在两相溶剂中溶解性（或分配系数）不
同，当流动相携带样品流经固定相（被吸附或固定在惰性材料 上的液体）时，各组分在两相间不断进行溶解、萃取、再溶解 、再萃取，……，样品经过多次反复分配后，造成分配系数稍 有差异的组分移行的距离不同面实现分离 .