薄层色谱扫描法

7、系统适用性试验
（1）检测灵敏度：指用于限量检查时，被测成分能 被检出的最低量。 （2）分离度：用于限量检查或含量测定时，要求定 量峰与相邻峰之间有较好的分离度,应大于1.0。 （3）重复性：指同一薄层板上同一供试品溶液相同 浓度的数个斑点，扫描结果的偏差。不显色直接扫 描，相对标准偏差应不大于3.0%，显色后扫描，相 对标准偏差应不大于5.0%。
3、测量方式
(1)透射法：测定照射光穿透样品斑点后 光的吸收情况。
(2)反射法：样品斑点对照射光的反射情 况进行测定的方法。
4、测光形式
(1)单波长扫描：使用一种波长的光束对薄层进行扫 描。适用于分离度好，背景干扰小的薄层色谱。 (2)双波长扫描：用测定波长和参比波长分别扫描薄 层后，测定样品斑点在两波长下的吸收度之差，可 减少分离度欠佳的组分间的相互干扰，并减少薄层 板的背景干扰，能显著改善基线的平稳性。操作时 应选择待测斑点无吸收或最小吸收的波长作为参比 波长。
6、展距:一般为8-15cm 在这种展距内得不到分离的组分,增加展距并非 解决问题的办法,不仅延长了分离的时间,而且会引 起斑点扩散反而降低分离度,因此,展距内分离不理 想时,不能一味的增加展距,而是可以优化展开剂,以 得到理想的结果。
由此可见,展开时必须控制条件一致，得到重现的 分辨率最佳的色谱，才能得到可靠的定性定量结果。
(三)展开
1、预饱和 薄层各个部分对展开剂蒸气的预吸附程度不同,会影响色 谱分离，因此当用展开剂时，先将薄层及展开缸进行预饱和, 以便得到重现的色谱图。 2、相对湿度：50%-60%较适宜 相对湿度过大影响薄层活度,吸附剂吸附能力下降,分离 效果不理想。 3、温度:一般18-25℃较适宜 温度变化会影响组分在两相间的分配,被分离物质的Rf值 应在0.2-0.8较适合,Rf值太大,斑点易扩散,扫描重现差,Rf 值太小,斑点没有完全展开,扫描结果不能代表真实浓度。
3、CAMAG薄层扫描的组成部分
（1）半自动点样仪：
注意：样品溶液应澄 清，防止溶液中的沉 淀堵塞点样针。
（2）数码照相系统
暗箱:可见光、254nm紫 外光、及365nm紫外光 光源。 注意：薄层照相前应挥 干溶剂，防止溶剂污染, 腐蚀仪器。
(3)薄层扫描仪
(1) 由光源、单色器、薄层板台、检测 器、WINCATS工作站组成。 (2)光源：钨灯：可见光区370-800nm 氘灯：紫外区190-450nm 汞灯：220-650nm
（四）显色
显色剂必须与样品定量反应,且灵敏度要高,专属性要强, 色点稳定性好。 常用的是喷雾法显色,分为自动喷雾、手动喷雾。自动喷雾 的雾滴均匀而细,比手动喷雾得到的背景吸收小,重现性及定 量准确度高。需注意的是：喷完显色剂后,需加热显色的,应 注意控制加热的温度和时间，尤其含羧甲基纤维素钠的薄层 板，温度过高或加热时间过长易焦化，如果用硫酸等显色剂 可使板面炭化而影响显色效果；加热时间不够，导致斑点未 显出或显色不完全；有的成分加热的温度和加热的时间不同. 显色效果是有差别的。 将显色的薄层板避光保存，以同样大小的玻璃板覆盖并密 封，可增加色斑的稳定性。
二、影响薄层扫描定量的因素
（一）吸附剂性能及薄层质量
1、吸附剂： （1）吸附剂颗粒大小，分布均匀程度能影响分离度 和检出限度。小颗粒且分布均匀的吸附剂，分离度 好，灵敏度高。 （2）吸附剂的含水量影响薄层活度，如果大气湿度 过大，吸附剂含水量过高，导致薄层活度过低，就 会影响分离效果，所以在点样前薄层板应进行活化 在110℃干燥30分钟。
5、扫描方式
(1)线性扫描：用一束比待测斑点略宽的狭窄 光带沿展开方向做单向等速扫描。适于形状 较规则斑点的扫描。在进行荧光测定时一般 只用线性扫描。 (2)锯齿扫描：使用微小正方形光束沿展开方 向扫描的同时，在垂直于展开方向进行往复 式扫描，扫描过程中光束的运动轨迹呈锯齿 形或矩形，它对于形状不规则或分布不均匀 的斑点扫描重复性较好，但扫描速度较慢。
4 、边缘效应：同一化合物，在同一块薄层板上,用同一混 合展开剂，在同一展开槽内展开后，薄层中间部分的斑点比 薄层两侧边缘处的斑点的Rf值小。 用展开剂将展开缸及薄层板饱和后再进行展开就可以消 除边缘效应，饱和时间的长短因展开剂极性以及比例不同而 异。 5、展开剂 (1)展开剂过多次数的重复使用，也会影响Rf值的稳定。多 次使用展开剂时，实际上每一次的展开剂的组成,由于挥发、 吸附等原因已有改变。最好是临用新配，这样每次展开剂少 量、定量使用，以足够展层一次的用量为宜。


硅胶G板、硅胶GF254板、硅胶H板、氧化铝板。 硅胶G板以石膏作为黏合剂； 硅胶GF254板是添加荧光指示剂；常用的荧光指示 剂有两种:一种是锰激活的硅酸锌（Zn2SiO4:Mn）, 在254nm波长下能发出荧光;另一种是银激活的硫 化锌、硫化镉（ZnS.CdS:Ag）,在366nm波长下能 发出荧光。我们常用的是硅胶GF254板。 硅胶H板是没有外加黏合剂。 氧化铝板以氧化铝作为固定相，可以分离萜类， 生物碱类，脂肪族及芳香族化合物。
6、定量方法
(1)外标法：如果标准曲线经过原点，可用一点法校正；如 果不通过原点，采用二点法校正，必要时用多点校正法。测 定时，供试品溶液和对照品溶液应交叉点于同一薄层板上， 每份供试品溶液点样不得少于2个，对照品每一浓度不得少 于2个，其计算结果的相对平均偏差不得大于5%。计算公式: C=kA+b (kA+b)×稀释倍数 点样量×称样量 (2)内标法：将内标加入供试品溶液和对照品溶液中以峰面 积的比值为定量依据.由于内标物的选择比较困难，目前应 用较少。 内标物：a.在样品溶液中加入一种在样品溶液中不存在的， b.性质与被测物质类似且又与样品中被测成分得 易分离的纯化物，
（一）吸附剂性能及薄层质量
2、薄层：薄层厚度会影响定量结果，厚度下 降，展开后斑点扩散较严重，影响定量结果。 用透射法测定时，峰面积值随薄层厚度下降 而减小，用反射法测定，峰面积值随薄层厚 度下降而增加。 因此对吸附剂及薄层性能的规格化是薄层 色谱重现性及定量准确性的先决条件。
薄层板的种类

三、介绍CAMAG薄层扫描仪
1、基本原理
日本岛津生产的CS系列仪器 瑞士CAMAG公司的薄层扫描仪 基本原理：就是用一束长宽可以调节 的一定波长、一定强度的光照射到薄 层斑点上进行整个斑点的扫描，用仪 器测量通过斑点或被斑点反射的光束 强度的变化达到定量的目的。

2、基本用途
（1）定性—光谱测定 在波长200-800nm之间进行斑点原位扫描，测得 该化合物的吸收曲线及最大吸收，并与对照品比较 从而对样品中该成分进一步确证。CAMAG公司的 WINCATS软件有斑点光谱图的储存功能，因此可对 斑点光谱进行检索，可随时与分析样品或标准进行 对比。 （2）定量—色谱测定，前面已经介绍了定量方法： 外标法、内标法等。
(2)每一种溶剂在展开中都有其一定的作用：
a.展开剂中比例较大的溶剂起溶解物质和基本分离 的作用，极性相对较小： b.展开剂中比例较小的溶剂,极性较大，对被分离物 质有较强的洗脱力，帮助化合物在薄层上移动， 可以增大Rf值，但不能提高分辨率； c.展开剂中加入少量酸、碱可抑制某些化合物的斑 点拖尾；比如：六味地黄丸测定山茱萸中的熊果 酸，展开剂是：环己烷-氯仿-醋酸乙酯-甲酸（20： 5：8：0.1） d.展开剂中加入丙酮等中等极性溶剂可使不相混合 的溶剂混溶，并可以降低展开粘度，加快展速。
薄层色谱扫描法
中药二室
一、薄层色谱扫描法简介 二、影响薄层扫描定量的因素 三、介绍CAMAG薄层扫描仪
一、薄层色谱扫描法简介
1、简述
薄层色谱扫描法是指用一束一定波长、 一定强度的紫外或可见光对薄层板进行 扫描，测定薄层板上的样品斑点对光的 吸收强度或斑点经激发后产生的荧光强 度。所得到的图谱及积分数据可用于药 品的鉴别、检查及含量测定。
注意：（1）仪器使用过程中，当长时间不进 行扫描（约2小时），应把仪器内部的三个 光源灯（D2，W，Hg）通过手动控制面板熄 灭，或关闭仪器电源。 （2）仪器扫描结束后，应及时把薄层板取出， 避免溶剂蒸气进入仪器内部，污染光路部 件和腐蚀仪器。
4、维护
1、仪器工作环境：温度：18-35℃，相对湿度： 85%以下；要远离酸性、碱性或其他会引起 金属表面腐蚀的气体。 2、仪器使用后要马上清洁薄层板装载台，避 免溶剂或脱落的硅胶颗粒及残存试剂对仪 器的腐蚀。 3、仪器上盖不能摆放任何东西，包括纸张或 溶剂瓶子，避免影响仪器散热和防止溶剂 撒落到仪器表面和内部。
谢 谢
中药材：山豆根、槲寄生、女贞子、牛 黄、两面针、黄连等； 中成药：六味地黄丸（浓缩丸）、元胡 止痛片、清肺消炎丸、二妙丸、板上的样品斑点 对光吸收强度的方法。 (2)荧光法:测定样品斑点经激发后产生的荧 光强度的方法。 (3)荧光淬灭法:利用某些化合物减弱吸附剂 中荧光剂的紫外吸收强度而进行定量的方 法。由于薄层板各部分荧光强度不均匀,对 定量不太适用,而是便于斑点的定位。
（二）点样
1 、一般为圆点状或窄细的条带状; 点样基线距底边10-15mm; 圆点状直径一般不大于3mm; 条带宽度一般为5-10mm; 点间距离不少于8mm。 2 、点样是薄层色谱的第一步,也是关键的一步,它既关系到 能否得到可以重现的薄层色谱,也关系到定量测定结果的准 确与否,点样量不宜过大,最好控制在10μ l以下,点样过多或 原点“超载”,展开剂产生“绕行”现象,使斑点拖尾或重叠, 致使扫描峰形不对称,或达不到基线分离。
（五）薄层扫描定量
（1）色谱条件不优化，操作技术不规范得到的色谱 很差，就不可能得到准确的定量结果。 （2）输入薄层扫描仪的参数不合理也会影响定量的 准确性，扫描方向应保持一致，应沿展开方向扫描, 不宜垂直于展开方向扫描。 总之，要得到理想的色谱分离及准确的定量结 果，色谱条件的标准化，操作技术的规范化是十分 重要的。