宋存江《微生物发酵工程》第4章 微生物发酵过程

发 酵
固态发酵 (Solid State Fermentation )
高密度发酵 (High Cell Density Fermentation )
基因工程菌的发酵 (Recombinant strain fermentation )
1. 分批发酵 (Batch Fermentation)
发酵罐进行的间歇操作称为分批发酵。在好氧发酵过程中，需要不断通入无菌空气并加入酸碱以调节 发酵液的pH值，除此以外，与外界没有其它的物料交换。分批发酵是一种操作简单并且广泛使用的发酵方式。 分批发酵中菌体生长规律及生长参数的数学模型将在第七章已有详述。工艺变量随时间而变化是该发酵方式 的主要特征。摇瓶培养也属分批发酵.分批发酵的主要设备是种子培养罐、主发酵罐、无菌供气系统和产物分 离纯化系统。分批发酵的基本过程如图
液体 发酵
液体环境适合菌体生长和物质传递，发酵在均 质条件下进行，便于控制，液体输送方便，易 于机械化操作，产品易精制｡ 设备占地少，容 量大，可自动控制，适合大规模生产。
投资大，设备要求严格， 动力消耗比较大
表面发酵和深层发酵
表面培养法
深层培养法
放置曲盘需要更多的厂房
利用密闭的发酵罐
需要更多的劳动力
扩大了固态发酵的运用范围 操作能耗高，设备投资较大
需要无菌处理发酵原料
适宜于分离纯化高附加值产品
限于传统食品的生产
操作能耗低，设备投资小，劳动强度 大
可直接利用价格低廉的粮食和纤维素 原料，
产品处理一般较简单，可直接烘干
固态发酵生物活性物质
生理活性物质 伴孢晶体
（细菌内毒素）
赤霉素
赭曲毒素 土霉素
5. 高密度发酵 (High Cell Density Fermentation )
微生物代谢产物的合成完全是靠菌体作为生产者来实现的。菌体量越多产物的产量也越大。因此，通 过发酵工程实现高密度微生物细胞培养则是发酵的最终要求。
采用一定的工艺技术实现了高密度发酵，它不仅使发酵液的菌体浓度比分批发酵提高了10倍以上，而 且使菌体的生产能力也处于最佳状态，并能消除有害代谢物对菌体正常发酵的影响。高密度发酵较分批发 酵有显著的技术优势。表15-4 列举了几种微生物的高密度发酵结果。
麸皮，玉米穗，木薯粉， 甘蔗渣等
大麦，大米，玉米 玉米穗 甘蔗渣 大麦粒
向日葵种子 豆渣 麸皮百度文库
黏土及稻草复合培养基 大米糠
固态发酵和液体发酵是微生物发酵的两大技术领域，各具特征，并存在着明显的区别。固态发酵 投资少，设备简单，操作容易可因陋就简，因地制宜地利用农副产品以及下脚料作为原料进行生产。液 体发酵适合菌体生长和物质传递，发酵在均质条件下进行，便于控制，液体输送方便易于机械化操作， 产品易精制｡同时，液体发酵设备占地少，容量大，可自动化控制，适合大规模生产，具有很大的优势。 但是，如能解决好固态发酵的设备问题，固态发酵也将会发挥出更大的作用。
培养时间(h) 30-40 30 50-120
高密度发酵生物反应器有常用的搅拌罐和带有外置式或内置式细胞持留装置的反应器，如透析膜 反应器、气升式反应器、气旋式反应器等。日本人铃木等用搅拌陶瓷膜反应器系统实现乳酸杆菌高密 度培养，其陶瓷过滤器可从发酵液中去除抑制生长的代谢副产物。日本人内野等采用内外两个圆筒的 膜透析反应器，能连续去除抑制性代谢产物，始终保持菌体生长繁殖。
重组原核微生物生产的部分蛋白药物
药物名称
α1-抗胰蛋白酶 (α1-antitrypsin) 促肾上腺皮质激素 (adrenocorticotrophic hormone) B细胞生长因子 (B-cell growth factor) 降钙素 (calcitonin) 集落刺激因子 (colony stimulating factor) 绒毛膜促性腺激素 (chorionic gonadotropin) 内啡肽和脑啡肽 (edorphine and enkephalin) 上皮生长因子 (epidermal growth factor) 红细胞生成素 (erythropoietin) 凝血因子VIII (factorVIII) 凝血因子IX (factorIX) 生长激素 (growth hormone) 生长激素释放因子 (growth hormone releasing factor) 胰岛素 (insulin) 干扰素 (interferon) 白细胞介素 (interleukin) 淋巴细胞毒素 (lymphotoxin) 巨噬细胞激活因子 (macrophage activating factor) 神经生长因子 (nerve growth factor) 血小板衍生长因子 (plaelet-derived growth factor) 松弛素 (relaxin) 血清白蛋白 (serum albumin) 生长调节素 (somatomedin C) 组织型纤溶酶原激活剂 (tissue plasminogen activator) 肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor) 尿抑胃素 (urogastrone) 尿激酶 (urokinase)
培养基呈液态或固态
液态发酵 固态发酵
发酵在培养基表面或深层进行
微
生
物
间歇发酵或连续进行
发
酵
菌种状态
表面发酵 深层发酵
分批发酵
补料分批发酵
连续发酵 游离发酵
×√
固定化发酵
单一或混合菌种
单一纯种发酵 双菌发酵 混合发酵
另外，细胞固定化，生物法处理废水，细菌采矿等等;
空气
如：黑曲霉发酵生产柠檬酸； 棒状杆菌的Glu发酵； 地衣芽胞杆菌发酵生产聚谷氨酸等
伴随着发酵工程机械化、自动化、化工技术和设备的改进，在传统固态发酵的基础上发展到现在的固态发 酵。
性质 反应器
菌种 范围 能耗
原料
分离
现代固态发酵和传统固态发酵的比较
现代固态发酵 在密闭的固态发酵反应器中进行
采用单一纯种菌株或混合菌株发酵
传统固态发酵 在极为简单的发酵容器中进行或敞口
式固态发酵
基本是自然富集发酵或强化菌种发酵
基因工程技术日臻成熟，所构建的工程菌已实现发酵生产，很多产品已投放市场。如：胰岛素、 干扰素、生长激素、乙型肝炎疫苗、高产苏氨酸等。有的基因工程菌其产品产量已高于普通菌种。一 种带有头孢菌素生物合成限制性扩环酶外源基因的工程菌，其头孢菌素C的产量比原有菌种提高了15%。
下表列举了部分基因工程菌发酵产生的药物及其用途
补料技术常用于高密度发酵，对提高菌体密度效果明显。有人采用三阶段式流加葡萄糖，高密度 培养大肠杆菌重组菌株（YK537/pDH-B2m），菌体密度达到53 OD600，骨形成蛋白（BMP-2A）产 量达到2.78g/L。但有些菌体高密度发酵菌体浓度较理论浓度尚有距离，仍需深入研究。
6. 基因工程菌的发酵 (Recombinant strain fermentation )
如，酵母厌氧产酒精；好氧积累菌体； 如：乳酸杆菌的乳酸发酵；
梭状芽孢杆菌的丙酮丁醉发酵等
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固定化细胞
发酵形式
固体发酵和液体发酵的区别
优点
缺
点
固体 发酵
投资少，设备简单，操作容易可因陋就简， 因地制宜，利用农副产品以及下脚料作为 原料进行生产。
广房面积大劳动强度 大不易机械化操作。
相反
利用抵押空气鼓风机
需要高压空气
动力消耗少
空压机、搅拌耗能
需要简单控制
需要精密控制
很少有污染问题
污染往往成为严重问题
产品回收包括水溶、抽提、
相同
过滤、离心、蒸发、沉淀
相同
分批发酵 (Batch Fermentation)
微 生
补料分批发酵 (Fed-batch Fermentation )
物
连续发酵 (Continuous Fermentation )
4. 固态发酵 (Solid State Fermentation )
固态发酵是指微生物在没有游离水或几乎没有游离水的较湿的固态培养基上的发酵过程。固态的湿培养基 一般根据成分不同控制含水量在40-80％左右，无游离水流出。农村的堆肥、青饲料发酵和酿酒制曲，就是典型 的固态发酵。特别是我国工艺历史悠久、国际著名的白酒生产都有自己独特的固态发酵工艺过程。由于固态发 酵方式节能、环保，近来又得到了人们的青睐。如：以产朊假丝酵母（Candida utilis）、面包酵母（ Saccharomyces cerevisiae）和啤酒酵母（Saccharomyces carlsbergensis）为复合发酵菌种，以麸皮、大豆饼和少 量脱毒棉籽饼为原料，经固态发酵法生产饲料蛋白添加剂得到快速发展。
2. 补料分批发酵 (Fed-batch Fermentation )
以某种方式定时向培养系统补加一定营养物质的发酵方式称为补料分批发酵。它是介于分批发酵和连续 发酵之间的发酵形式。定时补料的同时并不向外排放发酵液，所以使发酵系统不再封闭，且培养液体积随时 间和物料流速而变化。由于营养底物缓慢补入，既满足微生物生长和产物合成的持续需要，又避免了由于底 物基质过量所引起的各种调控反应。
3. 连续发酵 (Continuous Fermentation )
连续发酵是指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使培 养系统内培养液的体积维持恒定，使微生物细胞处于近似恒定状态下生长的微生物发酵方式。下图为典型的实 验室连续发酵系统。
连续发酵的最大特点是微生物细胞的生长速度、产物的代谢均处于恒定状态，可达到稳定、高速培养微 生物细胞或产生大量代谢产物的目的。
定时补充物料，可使培养液中的底物浓度较长时间地保持在一定的范围内，既保证了微生物生长，又不 会产生不利影响，从而达到提高容量产率、产物浓度和得率的目的。
补料技术可以采用少量多次、少次多量、流加或微机控制流加；整个发酵过程中不断地调节补料率，维 持各项物质的供需平衡。
根据补入物料的组成可将补料分批发酵分为完全补料发酵和半分批补料发酵。完全补料发酵是补入成分 完全的培养基。半分批补料发酵是仅补入一种或几种限制性营养成分。
高细胞密度发酵成功的实例
菌 种 基础培养基
发酵罐
补料方法
细胞干重(g/L)
大肠杆菌 葡萄糖矿物 盐或甘油矿物盐
枯草杆菌 含葡萄糖的完全 培养基
毕氏酵母 葡萄糖，矿物盐 补加甲醇
搅拌罐 搅拌罐 搅拌罐
葡萄糖（甘油） 非限制指数补料
140-150
补料分批培养
185
补加葡萄糖调节pH
补料分批培养， 100
分子生物学技术特别是重组DNA技术的快速发展，众多的基因工程产品相继问世。下表列举了部 分基因工程菌发酵产生的药物及其用途。
工程菌常以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、某些假单胞菌、酵母菌、哺乳动物细胞等作为外源基因受 体，其发酵培养与普通菌种的好气培养没有本质的差异。基因工程菌通常采用二阶段发酵培养工艺， 先在一定时间内提高菌体浓度，其后添加诱导物或改变培养温度而诱导外源基因的产物表达，并以综 合评价决定产物表达的最佳诱导条件。
麦角类生物碱 头孢霉素 头丙菌素
枯草菌溶血素 环孢素
抗真菌素 绿僵菌素
微生物
底物
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis)
椰子果渣
藤仓赤菌(Gibberella fujikuroi)， 串珠镰孢(Fusarium moniliforme) 赭曲霉(A.ochraceus)，鲜绿曲霉(P.viridicatum) 龟裂链霉菌(Streptomyces,rimosus) 串珠镰孢(Fusarium moniliforme) 顶头孢霉(Cephalosporium acremonium) 带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus) 枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis) 丝状真菌(Tolypocladium inflatum) 枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis) 金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)
第四章 微生物发酵过程
(Microbial Fermentation-Process)
一. 微生物发酵的类型 二. 种子扩大培养 三. 发酵培养基 四. 发酵过程中间分析 五. 发酵终点的判断 六.主要技术经济指标
一. 微生物发酵的类型
微生物发酵的不同类型
需氧或不需要
好氧发酵 兼性发酵 厌氧发酵
√× √ ×