第12章 制备型高效液相色谱模板
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高效液相色谱法 PPT课件
①固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
中国药典-高效液相色谱PPT医学课件
AR／CR 式中 As为内标物质的峰面积或峰高； AR为对照品的峰面积或峰高； Cs为内标物质的浓度； CR为对照品的浓度。
21
再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪 器，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质 的峰面积或峰高，按下式计算含量：
Ax 含量（Cx）＝f·─────
式中 t R2为相邻两峰中后一峰的保留时间； tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1、W2及W1，h/2、W2,h/2分别为此相邻两峰的峰宽及半高峰宽。 当对测定结果有异议时，色谱柱的理论板数（n）和分离度（R）
均以峰宽（W）的计算结果为准。
18
重复性
用于评价连续进样中，色谱系统响应值的重复 性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对 照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其 峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0％ ；采用内标法时，通常配制相当于80％、100 ％和120％的对照品溶液，加入规定量的内标 溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进 样2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差 也应不大于2.0％。
25
美国药典还讨论了多波长检测器，特别是二极管阵列多波长检测 器的特点，指出，二极管阵列检测器比固定波长检测器或可变波 长检测器的信噪比低，不适宜于低浓度化合物的分析。在讨论示 差折光检测器中，认为该检测器不如紫外光检测器灵敏，且受溶 剂组成、流速、温度变化的影响大，要得到满意的基线，需用参 比柱。
由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十 八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动 相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的 随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳 定。
14
二、系统适用性试验
21
再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪 器，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质 的峰面积或峰高，按下式计算含量：
Ax 含量（Cx）＝f·─────
式中 t R2为相邻两峰中后一峰的保留时间； tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1、W2及W1，h/2、W2,h/2分别为此相邻两峰的峰宽及半高峰宽。 当对测定结果有异议时，色谱柱的理论板数（n）和分离度（R）
均以峰宽（W）的计算结果为准。
18
重复性
用于评价连续进样中，色谱系统响应值的重复 性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对 照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其 峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0％ ；采用内标法时，通常配制相当于80％、100 ％和120％的对照品溶液，加入规定量的内标 溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进 样2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差 也应不大于2.0％。
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美国药典还讨论了多波长检测器，特别是二极管阵列多波长检测 器的特点，指出，二极管阵列检测器比固定波长检测器或可变波 长检测器的信噪比低，不适宜于低浓度化合物的分析。在讨论示 差折光检测器中，认为该检测器不如紫外光检测器灵敏，且受溶 剂组成、流速、温度变化的影响大，要得到满意的基线，需用参 比柱。
由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十 八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动 相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的 随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳 定。
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二、系统适用性试验
高效液相色谱法演示文稿
固定相：C8
固定相：C18
1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯
非极性键合相常用于反相色谱。键合烷基的链长增加 ，极性降低，载样量增大、k值增大，C18分离效果优于
C8 , C1
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（2）中等极性键合相 中等极性键合相常见的有醚基键合相（如YWG-
②耐高压。 通常要求泵的输出压力达到30-60MPa的高压。
③液流稳定。
输出的液流应无脉动 ④泵的死体积小。 泵的死体积通常要求小于0.5mL。 ⑤密封性能好，耐腐蚀
当前第5页\共有62页\编于星期五\14点
输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵，恒流泵的 应用更广泛。
当前第6页\共有62页\编于星期五\14点
（三）梯度洗脱装置
等度洗脱： 用恒定配比的溶剂系统洗脱，方法简便、
色谱柱易再生等是其优点。
梯度洗脱： 在一个分析周期内，按一定程序不断改变 流动相的配比，逐步提高洗脱强度。梯度洗脱可以使一个 复杂样品中性质差异较大的组分，都能在各自适宜的分离 条件下分离。
梯度洗脱的特点：①缩短分析周期；②提高分离效果；③
3.流动相传质阻力项
流动相传质阻力，实际包括两方面，一是移动流 动相传质阻力Hm，二是滞流（静态）流动相传质阻力
Hsm。
当前第22页\共有62页\编于星期五\14点
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a.移动流动相传质阻力（Cmu）
当流动相在色谱柱内流动时，离固定相较远的组分流动较快， 处于固定相颗粒表面的组分流动较慢，由于这种差别，会使组
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3. 键合相的性质 （1）稳定性 键合相在pH2-8.5范围内稳定，太高的pH值会使硅 胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。 （2）键合量 键合相的键合量常用含碳量(C%)来表示，按含碳量的不
第十二章讲义高效液相色谱
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相柱 色谱装置
高效液相色谱仪
例：分离20种氨基酸
经典柱色 谱
柱长：170 cm 柱径：0.9 cm F：30 mL/h t分离: >20 h
HPL C
t分离：1 h
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相色谱法
固定相 固定相粒度（μm） 固定相粒度分布(RSD) 柱长（cm） 柱内径（cm） 柱 入 口 压 强 （ kg/cm2 ） 柱效(每米理论塔片数) 样品用量（g） 分析所需时间（h） 装置
液相色谱能完成难度较高的分离工作，因为： ①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡
过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。 而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提 高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以 上的液体作流动相，增大分离的选择性。
其是在生物学和医学等方面应
用极为广泛。如氨基酸、蛋白
质、核酸、烃、碳水化合物、 分
药品、多糖、高聚物、农药、
子 量
抗生素、胆固醇、金属有机物
等 分 析 ， 大 多 是 通 过 HPLC 来
完成的。
右图是各种HPLC方法的应
用范围及对象
极性增加 不溶于水 非极性
非离子极性
溶于水 离子
吸附
分配
反向分配
正向分配 离子交换
主要由接管、检测器流通池体积及检测器响应时间 等因素所引起。因此，尽可能用短而内径细的接管， 减少流通池体积，改进检测器和记录系统的响应速度 等都是克服柱后展宽的途径
第二节 高效液相色谱仪
一、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐(滤棒，可滤去颗粒状物质) 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
高效液相色谱分析精品文档
分析法
high performance liquid chromatograph
§3-2 主要分离类型与原理
basic principle and main separating types
一、液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatograph
二、液-固吸附色谱
一、液相色谱固定相
stationary phase of HPLC
二、液相色谱流动相
mobile phase of HPLC
三、分离条件的选择
2019/10/26
一、液相色谱固定相
stationary phases of LC
1. 液-液分配及离子对色谱法固定相
（1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采
2019/10/26
第三章 高效液相色谱
分析法
high performance liquid chromatograph
§3-1 概述
பைடு நூலகம்
一、高效液相色谱法特点
Characteristic of HPLC 二、影响色谱峰扩展及分离的因素
The factors that influence peak expansion and sepration
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
2019/10/26
2019/10/26
影响色谱峰扩展及分离的因素
• 基本概念及基础理论同气相色谱：保留值、分 配系数、分配比、分离度、选择性因子(分离因 子)、塔板理论及速率理论。
• 由于流动相的差别，对色谱过程必然产生影响。
2019/10/26
high performance liquid chromatograph
§3-2 主要分离类型与原理
basic principle and main separating types
一、液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatograph
二、液-固吸附色谱
一、液相色谱固定相
stationary phase of HPLC
二、液相色谱流动相
mobile phase of HPLC
三、分离条件的选择
2019/10/26
一、液相色谱固定相
stationary phases of LC
1. 液-液分配及离子对色谱法固定相
（1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采
2019/10/26
第三章 高效液相色谱
分析法
high performance liquid chromatograph
§3-1 概述
பைடு நூலகம்
一、高效液相色谱法特点
Characteristic of HPLC 二、影响色谱峰扩展及分离的因素
The factors that influence peak expansion and sepration
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
2019/10/26
2019/10/26
影响色谱峰扩展及分离的因素
• 基本概念及基础理论同气相色谱：保留值、分 配系数、分配比、分离度、选择性因子(分离因 子)、塔板理论及速率理论。
• 由于流动相的差别，对色谱过程必然产生影响。
2019/10/26
生物制药工艺学第12章制备型HPLC
可再生和可降解的溶剂
使用可再生和可降解的溶剂代替传统有机溶剂，降低对环境的污染。
高效回收和再利用技术
通过高效回收和再利用技术，减少溶剂的浪费和排放，降低对环境 的影响。
06
结论
制备型HPLC在生物制药工艺中的重要性
高效分离
制备型HPLC具有高效分离的特点， 能够快速、准确地分离和纯化生 物药物中的目标组分，提高药物 的纯度和收率。
04
制备型HPLC的挑战与解决方案
生物样品对分离介质的影响
80%
生物样品成分复杂
生物样品中含有多种蛋白质、细 胞、微生物等，对分离介质的稳 定性、选择性及使用寿命产生影 响。
100%
分离介质选择
针对不同生物样品，选择合适的 分离介质，如硅胶、聚合物等， 以提高分离效果和介质的稳定性 。
80%
清洗和维护
制备型HPLC在生物制药工艺 学中的应用
目
CO备型HPLC的基本原理 • 制备型HPLC在生物制药工艺中的应
用 • 制备型HPLC的挑战与解决方案 • 制备型HPLC的未来发展 • 结论
01
引言
生物制药工艺学概述
生物制药工艺学是一门研究利用生物技术生产药物的学科，涉及 微生物发酵、细胞培养、基因工程等领域。
优化色谱柱
通过改进色谱柱填料、粒径和孔径等参数，提高分离效率和通量。
优化流动相
通过选择合适的流动相组成和比例，优化流动相流速和梯度洗脱 程序，提高分离效率和通量。
串联色谱分离
将多个色谱分离单元串联起来，实现多级分离，提高分离效率和 通量。
绿色环保的分离介质和溶剂
生物相容性好的分离介质
选择对生物无毒或低毒的分离介质，降低对环境和人体的危害。
使用可再生和可降解的溶剂代替传统有机溶剂，降低对环境的污染。
高效回收和再利用技术
通过高效回收和再利用技术，减少溶剂的浪费和排放，降低对环境 的影响。
06
结论
制备型HPLC在生物制药工艺中的重要性
高效分离
制备型HPLC具有高效分离的特点， 能够快速、准确地分离和纯化生 物药物中的目标组分，提高药物 的纯度和收率。
04
制备型HPLC的挑战与解决方案
生物样品对分离介质的影响
80%
生物样品成分复杂
生物样品中含有多种蛋白质、细 胞、微生物等，对分离介质的稳 定性、选择性及使用寿命产生影 响。
100%
分离介质选择
针对不同生物样品，选择合适的 分离介质，如硅胶、聚合物等， 以提高分离效果和介质的稳定性 。
80%
清洗和维护
制备型HPLC在生物制药工艺 学中的应用
目
CO备型HPLC的基本原理 • 制备型HPLC在生物制药工艺中的应
用 • 制备型HPLC的挑战与解决方案 • 制备型HPLC的未来发展 • 结论
01
引言
生物制药工艺学概述
生物制药工艺学是一门研究利用生物技术生产药物的学科，涉及 微生物发酵、细胞培养、基因工程等领域。
优化色谱柱
通过改进色谱柱填料、粒径和孔径等参数，提高分离效率和通量。
优化流动相
通过选择合适的流动相组成和比例，优化流动相流速和梯度洗脱 程序，提高分离效率和通量。
串联色谱分离
将多个色谱分离单元串联起来，实现多级分离，提高分离效率和 通量。
绿色环保的分离介质和溶剂
生物相容性好的分离介质
选择对生物无毒或低毒的分离介质，降低对环境和人体的危害。
高效液相色谱法模板
b) 洗脱液离子强度低增加到0.3-0.5mol/L c) 常用磷酸盐和硫酸盐进行离子强度的调节 d) 用氯化钠作离子剂，疏水作用最小 e) PH值不能太低，因为H+会腐蚀不锈钢柱
4、流速 蛋白质分离时，流速对分离度的影响是一个很 重要的因素，一般在低流速下蛋白质分离是比 较理想。
5、样品容量
进样体积和样品的浓度将明显地影响蛋白质的 分离度。 样品的浓度范围一般在0.01%----0.5%.
亲合色谱作为液相色谱的一个重要分支，对于生 物大分子的分离具有特殊的意义。原则上讲，如 果在固相载体上连接一种具有生物特异性的配基， 就可以建立一种亲合色谱方法，用于分离与配基 相对应的物质。
1、有机高分子类：多孔的硬质凝胶——交联聚 苯乙烯，交联聚甲基丙烯酸酯，亲水性高聚性 等树脂。 优点 ①具有均匀的粒度、较大的孔径、良好的刚性， 广泛的PH值的适应性 ②对于生物大分子样品都有较好的相溶性。 ③填料容易合成
4、分子排阻色谱
5、亲和色谱
三、HPLC在生物大分子中的应用
在生物大分子中的HPLC中，体积排阻色谱，离 子交换、反相液相和亲和色谱是最常用的分离 模式。
第五节 液-固色谱法 液-固色谱法通常称为吸附色谱 1、载体：硅胶
2、吸附剂吸附试样的能力 3、原理
第六节 键合相色谱法
一、正相色谱法 1、在正相色谱法中共价结合到载体上的基团 都是极性基团。 2、分离机制属于分配色谱
种类
强酸性
阳离子交换树脂 弱酸性 强碱性 阴离子交换树脂 弱碱性
-SO3H
COOH
-PO3 H
N (CH3)2X C2H4OH
N (CH3)3X
NR2
NHR
NH2
离子交换层析适用性
4、流速 蛋白质分离时，流速对分离度的影响是一个很 重要的因素，一般在低流速下蛋白质分离是比 较理想。
5、样品容量
进样体积和样品的浓度将明显地影响蛋白质的 分离度。 样品的浓度范围一般在0.01%----0.5%.
亲合色谱作为液相色谱的一个重要分支，对于生 物大分子的分离具有特殊的意义。原则上讲，如 果在固相载体上连接一种具有生物特异性的配基， 就可以建立一种亲合色谱方法，用于分离与配基 相对应的物质。
1、有机高分子类：多孔的硬质凝胶——交联聚 苯乙烯，交联聚甲基丙烯酸酯，亲水性高聚性 等树脂。 优点 ①具有均匀的粒度、较大的孔径、良好的刚性， 广泛的PH值的适应性 ②对于生物大分子样品都有较好的相溶性。 ③填料容易合成
4、分子排阻色谱
5、亲和色谱
三、HPLC在生物大分子中的应用
在生物大分子中的HPLC中，体积排阻色谱，离 子交换、反相液相和亲和色谱是最常用的分离 模式。
第五节 液-固色谱法 液-固色谱法通常称为吸附色谱 1、载体：硅胶
2、吸附剂吸附试样的能力 3、原理
第六节 键合相色谱法
一、正相色谱法 1、在正相色谱法中共价结合到载体上的基团 都是极性基团。 2、分离机制属于分配色谱
种类
强酸性
阳离子交换树脂 弱酸性 强碱性 阴离子交换树脂 弱碱性
-SO3H
COOH
-PO3 H
N (CH3)2X C2H4OH
N (CH3)3X
NR2
NHR
NH2
离子交换层析适用性
《高效液相色谱法》PPT课件
第12章 高效液相色谱 法
high performance liquid chromatography HPLC
HPLC与经典LC区别
经典液相色谱
固定相颗粒较大，不均 匀 常压下输送流动相 柱效低 分析周期长
现代液相色谱
固定相颗粒小，均匀
高压下输送流动相 柱效高 分析周期短
第2节 基本理论-速率理论
ε0：液-固色谱中溶剂强度参数，反 映溶剂分子对吸附剂亲和力。 经验：ε0减小0.05，k值增加1~3倍
②溶解度参数δ
Ec Vm
EC是1mol气体变液体释放能量; Vm液体摩尔体积
δ=色散δ+偶极δ+接受质子δ+给出质子δ
③极性参数P/ P’:液-液色谱溶剂极性参数，表示溶 剂洗脱强度和溶剂的选择性
参考物的选择 (Snyder法)
强偶极作用------硝基甲烷-------Xn 质子给予体------乙醇-------------Xd 质子接受体------二氧六环-------Xe
参考物与被检溶剂间作用力关系表
参考物
被检溶剂 作用力
给质子— 受质子—
乙醇
二氧六环
接受质子 给质子作 作用力Xe 用力Xd
0.39 0.21 0.40 3 0.75 0.39 0.23 0.39 3
①溶剂的强度因素ε,P/ 规定：戊烷在Al2O3的ε=0
ε(硅胶)=ε(Al2O3)×0.77
混合溶剂 ?
0 AB
0 A
lg[ N B .10 .nB
(
0 B
0 A
Байду номын сангаас
)
(1
.nB
high performance liquid chromatography HPLC
HPLC与经典LC区别
经典液相色谱
固定相颗粒较大，不均 匀 常压下输送流动相 柱效低 分析周期长
现代液相色谱
固定相颗粒小，均匀
高压下输送流动相 柱效高 分析周期短
第2节 基本理论-速率理论
ε0：液-固色谱中溶剂强度参数，反 映溶剂分子对吸附剂亲和力。 经验：ε0减小0.05，k值增加1~3倍
②溶解度参数δ
Ec Vm
EC是1mol气体变液体释放能量; Vm液体摩尔体积
δ=色散δ+偶极δ+接受质子δ+给出质子δ
③极性参数P/ P’:液-液色谱溶剂极性参数，表示溶 剂洗脱强度和溶剂的选择性
参考物的选择 (Snyder法)
强偶极作用------硝基甲烷-------Xn 质子给予体------乙醇-------------Xd 质子接受体------二氧六环-------Xe
参考物与被检溶剂间作用力关系表
参考物
被检溶剂 作用力
给质子— 受质子—
乙醇
二氧六环
接受质子 给质子作 作用力Xe 用力Xd
0.39 0.21 0.40 3 0.75 0.39 0.23 0.39 3
①溶剂的强度因素ε,P/ 规定：戊烷在Al2O3的ε=0
ε(硅胶)=ε(Al2O3)×0.77
混合溶剂 ?
0 AB
0 A
lg[ N B .10 .nB
(
0 B
0 A
Байду номын сангаас
)
(1
.nB
高效液相色谱法
液相色谱法固定相
(三) 离子交换色谱法固定相
1. 薄膜型离子交换树脂: 即以薄壳玻璃珠为担体， 在它的表面涂约 1% 的离子交换树脂而成。
2. 离子交换键合固定相: 用化学反应将离子交换基 团键合在惰性担体表面。
液相色谱法固定相
（四） 亲和色谱固定相
亲和色谱是一种基于分离物与配体间特异
的生物亲合作用来分离生物大分子的技术，它
五 高效液相色谱分离类型的选择
要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的 了解样品
的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应
用范围。选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分子质 量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度
以及化学结构等物理、化学性质。
1、相对分子质量 对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比
的作用越来越大，主要应用如下：
多环芳烃、农药、酚类、真菌毒素、异腈酸酯等
等。 特别是有机农药方面的检测。
1. 有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m)
流动相：正己烷
流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径)
检测器：差示折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药残 留量进行分析。
极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱
适于分离极性组分
反相色谱——固定液极性 < 流动相极性（RLLC）
极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分
载体又称担体
(1) 全多孔型担体：
a.
HPLC早期使用的担体与GC类似，是颗粒均匀的多孔球 体，如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的 Φ 100μ m全多孔型担体。
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High-Pressure Mixing
目的是分离多组容量因子相差较大的组分
2 进样系统 六通阀
3 色谱柱
Normal column Narrow bore column Micro column
5-m、4.6- m 1-3 m < 1 m
色谱柱是实现分离的核心部件。要求柱效高、 柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、 填充质量和使用条件有关。
作用：脱去流动相中的溶解气体。流动相先经过脱气 装置再输送到色谱柱。
在线脱气、超声脱气、真空脱气等
脱气不好时有气泡，导致流动相流速不稳定，造成 基线飘移，噪音增加。 Pressure Dampers
O2 , N 2 , CO2…
（3）梯度洗脱装置 Isocratic elution 恒定组成的单一溶剂体系 Gradient elution 以一定速度改变多种溶剂的配比淋洗，
1.2 基本仪器装置
• • • • • 输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统
2.1 高效液相色谱仪组成
高压输液泵
1 输液系统
(1) 高压输液泵
在线脱气装置
作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。
输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。
(1) 高压输液泵
(2)在线脱气装置
色谱柱填料
基质：载体或担体。数m~数十m，球形。 硅胶或有机高分子聚合物
spherical and irregular silica particles Macroporous spherical silica particle. [K.K.Unger, Porous silica, Elsevier, 1979]
第十二章 制备型高效液相色谱
在生物制药中的应用
• 基因工程药物:白细胞介素、胰岛素。 • 天然产物: 蛋白质,多肽,多史 • 1903年，色谱法问世 俄国植物学家茨维特 1903年3月21日，大会报告 “一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用” 1906年在德国植物学杂志发表文章，首次命名上 述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法 • 1931年，库恩（Kuhn）分离胡萝卜素，1938年， Kuhn和Lederer从维生素B中分离出B6，获得了 1938年的诺贝尔化学奖。 • 1941年，马丁（Martin）和辛格（Synge）提出 液液分配色谱法，1952年度的诺贝尔奖。 • 60年代末，70年代初，高效液相色谱仪的成功研 制
• 容量因子：溶质在固定相中的总摩尔数与 流动相中总摩尔数之比。 t R t0
k
• 选择因子：两组分容量因子的比值 k 2
t0
k1
• 容量因子、选择因子、理论塔板数对分离 度的影响
1 1 k2 R ( )( )N 2 4 1 k2
1
六、制备型高效液相色谱的重要参数
Porous particle
1-2m 3-10m
3050m
Pellicular particle
色谱柱填料
功能层：物理吸附或化学键合
三、高效液相色谱法的特点
• 采用高效色谱柱、高压输液设备和高灵敏度检 测器, 从而实现了高效、高速、高灵敏度和定 量准确。 • 和经典液相相比有以下优点：快速、灵敏度高、 分辨率高、自动化程度高 等。
七、分离机理和色谱类型 分离蛋白质类物质时的分离依据： 疏水性 分子大小 等电点 结构特异性
色谱介质按分离机理分为
正相色谱 反相色谱：常加入TFA 离子交换色谱：阴离子交换色谱（ DEAE二乙基 氨基乙基， Q 季胺盐）阳离子交换色谱（ CM 羧甲基S磺酸基） 凝胶过滤色谱 疏水色谱：苯基，辛基等。 金属螯合色谱：镍、铜等 亲合色谱
Capacity:纯化过程中，目标物质的上样量。可以 是体积也可以是质量。 Speed:在除去蛋白酶的过程中此项非常关键。 Recovery: 产品贵重时此项很重要。流动相的条件、 环境会影响它。减少步鄹和保持一种对生物样品 合适的环境条件。 Resolution: 在纯化的最后阶段，此项很关键，尤 其是杂质的结构和目的物结构相似时。
第二节 分离方案的设计
• What is the intended use of the product? • What kind of starting material is available and how should it be handled? • What are the purity issues in relation to the source material and intended use of the final product? • What has to be removed? • What must be removed completely? • What will be the final scale of puridication? • What are the economical constraints and what resources and equipment are available?
有关参数
• 分离度：在色谱过程中表示两组分相互分离的程度, 一般情况下,分离度大于1.5时称分离完全.
R t r2 t r1 1 (W1 W2 ) 2 2(t r2 t r1 ) W1 W2
只有峰窄而间距大的分离是令人满意的。 在色谱分析中要求： 两组分的保留值差别要足够大。 两色谱峰要足够窄。 待测组分的分离度要足够大，分离过程要尽可能短.
四、制备型高效液相色谱与分析型 高效液相色谱法的区别
• • • • 流速不同 检测池不同 上样量不同 色谱柱不同
五、色谱的基本理论及有关参数
两大理论： • 塔板理论(the plate model):阐明了色谱、蒸馏和萃 取之间的相似性，将色谱柱设想成由许多液液萃 取单元或理论塔板组成；相似于精馏过程，色谱 分离也是一个分配平衡过程 . N = 16 (tR / wb)2 N = 5.54 (tR / w1/2)2 • 速率理论:研究各种动力学因素对峰展宽的影响。 H= A+Cu
目的是分离多组容量因子相差较大的组分
2 进样系统 六通阀
3 色谱柱
Normal column Narrow bore column Micro column
5-m、4.6- m 1-3 m < 1 m
色谱柱是实现分离的核心部件。要求柱效高、 柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、 填充质量和使用条件有关。
作用：脱去流动相中的溶解气体。流动相先经过脱气 装置再输送到色谱柱。
在线脱气、超声脱气、真空脱气等
脱气不好时有气泡，导致流动相流速不稳定，造成 基线飘移，噪音增加。 Pressure Dampers
O2 , N 2 , CO2…
（3）梯度洗脱装置 Isocratic elution 恒定组成的单一溶剂体系 Gradient elution 以一定速度改变多种溶剂的配比淋洗，
1.2 基本仪器装置
• • • • • 输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统
2.1 高效液相色谱仪组成
高压输液泵
1 输液系统
(1) 高压输液泵
在线脱气装置
作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。
输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。
(1) 高压输液泵
(2)在线脱气装置
色谱柱填料
基质：载体或担体。数m~数十m，球形。 硅胶或有机高分子聚合物
spherical and irregular silica particles Macroporous spherical silica particle. [K.K.Unger, Porous silica, Elsevier, 1979]
第十二章 制备型高效液相色谱
在生物制药中的应用
• 基因工程药物:白细胞介素、胰岛素。 • 天然产物: 蛋白质,多肽,多史 • 1903年，色谱法问世 俄国植物学家茨维特 1903年3月21日，大会报告 “一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用” 1906年在德国植物学杂志发表文章，首次命名上 述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法 • 1931年，库恩（Kuhn）分离胡萝卜素，1938年， Kuhn和Lederer从维生素B中分离出B6，获得了 1938年的诺贝尔化学奖。 • 1941年，马丁（Martin）和辛格（Synge）提出 液液分配色谱法，1952年度的诺贝尔奖。 • 60年代末，70年代初，高效液相色谱仪的成功研 制
• 容量因子：溶质在固定相中的总摩尔数与 流动相中总摩尔数之比。 t R t0
k
• 选择因子：两组分容量因子的比值 k 2
t0
k1
• 容量因子、选择因子、理论塔板数对分离 度的影响
1 1 k2 R ( )( )N 2 4 1 k2
1
六、制备型高效液相色谱的重要参数
Porous particle
1-2m 3-10m
3050m
Pellicular particle
色谱柱填料
功能层：物理吸附或化学键合
三、高效液相色谱法的特点
• 采用高效色谱柱、高压输液设备和高灵敏度检 测器, 从而实现了高效、高速、高灵敏度和定 量准确。 • 和经典液相相比有以下优点：快速、灵敏度高、 分辨率高、自动化程度高 等。
七、分离机理和色谱类型 分离蛋白质类物质时的分离依据： 疏水性 分子大小 等电点 结构特异性
色谱介质按分离机理分为
正相色谱 反相色谱：常加入TFA 离子交换色谱：阴离子交换色谱（ DEAE二乙基 氨基乙基， Q 季胺盐）阳离子交换色谱（ CM 羧甲基S磺酸基） 凝胶过滤色谱 疏水色谱：苯基，辛基等。 金属螯合色谱：镍、铜等 亲合色谱
Capacity:纯化过程中，目标物质的上样量。可以 是体积也可以是质量。 Speed:在除去蛋白酶的过程中此项非常关键。 Recovery: 产品贵重时此项很重要。流动相的条件、 环境会影响它。减少步鄹和保持一种对生物样品 合适的环境条件。 Resolution: 在纯化的最后阶段，此项很关键，尤 其是杂质的结构和目的物结构相似时。
第二节 分离方案的设计
• What is the intended use of the product? • What kind of starting material is available and how should it be handled? • What are the purity issues in relation to the source material and intended use of the final product? • What has to be removed? • What must be removed completely? • What will be the final scale of puridication? • What are the economical constraints and what resources and equipment are available?
有关参数
• 分离度：在色谱过程中表示两组分相互分离的程度, 一般情况下,分离度大于1.5时称分离完全.
R t r2 t r1 1 (W1 W2 ) 2 2(t r2 t r1 ) W1 W2
只有峰窄而间距大的分离是令人满意的。 在色谱分析中要求： 两组分的保留值差别要足够大。 两色谱峰要足够窄。 待测组分的分离度要足够大，分离过程要尽可能短.
四、制备型高效液相色谱与分析型 高效液相色谱法的区别
• • • • 流速不同 检测池不同 上样量不同 色谱柱不同
五、色谱的基本理论及有关参数
两大理论： • 塔板理论(the plate model):阐明了色谱、蒸馏和萃 取之间的相似性，将色谱柱设想成由许多液液萃 取单元或理论塔板组成；相似于精馏过程，色谱 分离也是一个分配平衡过程 . N = 16 (tR / wb)2 N = 5.54 (tR / w1/2)2 • 速率理论:研究各种动力学因素对峰展宽的影响。 H= A+Cu