反相制备型高效液相色谱法分离纯化过程中的共性问题
反相制备型高效液相色谱法分离纯化过程中的共性问题
成也萧何，败也萧何？！——反相制备型高效液相色谱法分离纯化过程中的共性问题内容概览：本文拟通过一个具体实例来介绍制备型高效液相色谱法的特点、影响制备型高效液相色谱分离纯化的因素，及其在合成药物、中药化学对照品研究中的实际应用，并对制备HPLC分离纯化过程中的共性问题做了总结并提出解决方案。
实际应用：某合成药物最终产品的纯化，对其纯度的要求——HPLC-UV法，210 nm & 254 nm 下，以峰面积归一化法，≥98.0%，同时需提供MS、NMR数据。
具体问题：某特定化合物系强极性有机小分子，极性大、难挥发，采用硅胶柱层析不易提纯，需用其他分离技术来纯化。
解决方法：终极目的是提纯该物质。
总体策略——“先看，后想，再行动”——“看化学结构，想理化性质，定纯化方法”。
由于该化合物及相关杂质的理化性质决定了难以用常规的重结晶、蒸馏（精馏）、硅胶柱层析来分离纯化。
结合实验室的具体条件，考虑采用反相制备型高效液相色谱法（Preparative HPLC）来分离纯化之。
方法步骤：1.了解样品及有关组分的情况→2.样品预处理→3.建立Analytical HPLC Method→4.优化Preparative HPLC条件→5.检查出现的问题→6.回收纯化的物质。
更细致地来讲，开始Preparative HPLC之前须明白：待分离样品及有关组分的信息——所含化合物的结构信息（重点关注酸、碱性等极性基团）、UV光谱图（涉及到后续试验检测波长设定）、分子量（分离后目标化合物LC-MS检测确认）、待分离体系的复杂程度（所含化合物的数目，preparative HPLC之前是否须经flash column粗分）；样品预处理——最主要的是样品的溶解度（将尽量多的样品溶于体积相对较小的溶液中）以及待分离体系里是否含强酸、强碱性物质（潜在的“柱杀手”），样品溶液是否需要中和等；建立Analytical HPLC Method——这一步，跟平常的HPLC相似，重点关注待分离的目标化合物，使该物质与其前、后组分分离得尽量相隔远些（起码得基线分离，利于后续制备时放大），若流动相中必须添加改性剂，应尽量避免非挥发性的缓冲盐，优先选择易挥发性缓冲液（例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、甲酸铵、乙酸铵、三乙胺、氨水等），否则要脱盐，得二次分离；优化Preparative HPLC条件——通常来讲，制备柱是实验室现有的（色谱柱就这么定下来了，没得选择的余地，除非是需新购色谱柱），在Analytical HPLC的基础上优化梯度分离方法、考察进样量、目标组分收集确认（LC-MS测分子量）；检查出现的问题——这一步是最需要费心留神的！很多时候，出了问题，根本就没有挽回的余地，当然了，有时也是亡羊补牢，犹为未晚；所以，更多的时候，是需要未雨绸缪，把可能会发生的事情尽量考虑周全！比如样品的溶解度（在甲醇、水、乙腈、流动相、四氢呋喃那、酸水、碱水中的溶解性如何？），若样品溶解性不好，第一步就卡住，很打击人滴！曾遇到过这么个实例——一个某种酶抑制剂，含氮杂环类化合物，在上面提到的那些溶剂中溶解度都相当地小，analytical HPLC虽然分离得很漂亮，但还是没法做。
高效液相色谱技术中常见问题分析及解决方法
更换。
仪器管路液体泄漏是导致系统压力不稳定的最
常见情况。 漏液严重时,仪器自身会发出系统压力
过低的警报。 轻微泄漏则可用干燥的餐巾纸擦拭管
路外部,观察纸巾是否被渗入液体进行判断。 泄漏
孔璐璐,等:高效液相色谱技术中常见问题分析及解决方法
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可能由管路松动或管路损坏引起,对于前者,重新拧
1. 1. 1 样品前处理不当
样品前处理不当可能会产生鬼峰,一般源于两
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个途径:一是所用试剂被污染;二是测试容器不干
净。 鉴别起来比较简单:使用试剂稀释样品,如果待
测样品出峰明显减小而鬼峰变化不大,则鬼峰源自
试剂污染。 如果洁净容器后重新检测鬼峰消失,则
鬼峰源自容器的污染。
1. 1. 2 流动相污染
的空气。 这种情况可预先将流动相进行超声脱气处
每次补充流动相时以直接补给的方式,没有对贮液
理,然后再装入储液瓶中待用。 二是由于水相和有
瓶进行清洗更换,富集的污染物就会进入到仪器流
机相的物理化学性质存在差异,两者在相互混合时,
路中产生鬼峰。
增加了空气在两种流动相中的溶解度。 对于这种情
上述问题的解决方法是更换流动相,即使用干净
样品的相溶性,如没有特殊原因,一般选择流动相作
留以及色谱柱和仪器管路中污染物的富集。
为待测组分的溶剂,以降低由于待测样品在流动相
在不改变测试条件情况下,如果鬼峰每次有规
中溶解性差引入的空气量。
律地出现在色谱图的相同位置,则污染很可能来自
液相色谱仪采用动态混合器和静态混合器将不
于自动进样器端。 这时可将自动进样针和针座拆
Key words: high performance liquid chromatography; common problems; influence factors;
高效液相色谱仪使用中常见问题及对策
高效液相色谱仪使用中常见问题及对策高效液相色谱（HPLC）作为一种分离技术和方法，目前已经发展到一个全新的阶段。
高精度的输液泵，应用广泛的色谱分离柱，低噪音、高灵敏度的各种检测器和功能强大的数据处理软件系统的出现，都推动了液相色谱技术的迅猛发展。
液相色谱仪正以它分辨率高、分析速度快和应用广泛的优点倍受仪器分析工作者的青睐，广泛地应用于医药卫生、环境监测、食品检测等领域。
作者本人从事液相色谱分析工作二十多年，应用HPLC技术在血药浓度、生物胺、核苷酸、蛋白质浓度测定等实际工作中，积累了许多的方法和经验，在这里与大家交流，希望能对同行们有所帮助和借鉴，共同促进液相色谱分析技术的发展。
1高效液相色谱仪的基本工作原理高效液相色谱仪如图1所示，是由溶液贮器、高压泵、进样系统、色谱分离柱、检测器和数据处理系统几部分组成。
高压泵从溶液贮器中抽走流动相，流经整个仪器系统，形成密闭的液体流路。
样品通过进样系统注入色谱分离柱，在柱内进行分离。
柱流出液进入检测器，使已被分离的组分逐一被检测器收集，并将响应值转变为电信号后经放大被数据处理系统记录色谱峰，通过数据处理系统对记录的峰值进行存储和计算[1]。
液相色谱仪是依靠色谱柱进行分离的。
研究证明：物质的色谱过程是指物质分子在相对运动的两相（液相和固相）中分配“平衡”的过程。
液相色谱是以具有吸附性质的硅胶颗粒为固定相，各种洗脱液为流动相。
当液体样品在载体流动相的推动下，在液-固两相间作相对运动时，由于各组分在两相中的分配系数（K）不同，则使各自的移动速度不同，即产生差速迁移。
各组分在两相间经过多次分配，从而达到使混合物分离的目的。
上式反映了物质在两相中进行吸附、解吸、再吸附、再解吸…过程中，由于在两相中浓度的不同，而存在分配系数上的差异。
既然分配系数及其差异是引起组分在液相色谱柱分离的根本原因，那么，必然地也会同色谱理论中可测宏观量之间存在着某种定量关系，事实上，色谱理论中通常用容量因子k’的概念来反映物质在两相中的分配关系：k’值可以非常方便地表达组分在两相的分配，又很容易从色谱实验数据中直接测得，是色谱理论中重要的基本参数之一[2]。
制备型液相使用
内容概览：本文拟通过一个具体实例来介绍制备型高效液相色谱法的特点、影响制备型高效液相色谱分离纯化的因素，及其在合成药物、中药化学对照品研究中的实际应用，并对制备HPLC分离纯化过程中的共性问题做了总结并提出解决方案。
实际应用：某合成药物最终产品的纯化，对其纯度的要求——HPLC-UV法，210nm&254 nm下，以峰面积归一化法，≥98.0%，同时需提供MS、NMR数据。
具体问题：某特定化合物系强极性有机小分子，极性大、难挥发，采用硅胶柱层析不易提纯，需用其他分离技术来纯化。
解决方法：终极目的是提纯该物质。
总体策略——“先看，后想，再行动”——“看化学结构，想理化性质，定纯化方法”。
由于该化合物及相关杂质的理化性质决定了难以用常规的重结晶、蒸馏（精馏）、硅胶柱层析来分离纯化。
结合实验室的具体条件，考虑采用反相制备型高效液相色谱法（Preparative HPLC）来分离纯化之。
方法步骤：1.了解样品及有关组分的情况→2.样品预处理→3.建立Analytical HPLC Method→4.优化Preparative HPLC条件→5.检查出现的问题→6.回收纯化的物质。
更细致地来讲，开始Preparative HPLC之前须明白：待分离样品及有关组分的信息——所含化合物的结构信息（重点关注酸、碱性等极性基团）、UV光谱图（涉及到后续试验检测波长设定）、分子量（分离后目标化合物LC-MS检测确认）、待分离体系的复杂程度（所含化合物的数目，preparative HPLC之前是否须经flash column粗分）；样品预处理——最主要的是样品的溶解度（将尽量多的样品溶于体积相对较小的溶液中）以及待分离体系里是否含强酸、强碱性物质（潜在的“柱杀手”），样品溶液是否需要中和等；建立Analytical HPLC Method——这一步，跟平常的HPLC相似，重点关注待分离的目标化合物，使该物质与其前、后组分分离得尽量相隔远些（起码得基线分离，利于后续制备时放大），若流动相中必须添加改性剂，应尽量避免非挥发性的缓冲盐，优先选择易挥发性缓冲液（例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、甲酸铵、乙酸铵、三乙胺、氨水等），否则要脱盐，得二次分离；优化Preparative HPLC条件——通常来讲，制备柱是实验室现有的（色谱柱就这么定下来了，没得选择的余地，除非是需新购色谱柱），在Analytical HPLC的基础上优化梯度分离方法、考察进样量、目标组分收集确认（LC-MS测分子量）；检查出现的问题——这一步是最需要费心留神的！很多时候，出了问题，根本就没有挽回的余地，当然了，有时也是亡羊补牢，犹为未晚；所以，更多的时候，是需要未雨绸缪，把可能会发生的事情尽量考虑周全！比如样品的溶解度（在甲醇、水、乙腈、流动相、四氢呋喃那、酸水、碱水中的溶解性如何？），若样品溶解性不好，第一步就卡住，很打击人滴！曾遇到过这么个实例——一个某种酶抑制剂，含氮杂环类化合物，在上面提到的那些溶剂中溶解度都相当地小，analytical HPLC虽然分离得很漂亮，但还是没法做。
高效液相色谱仪使用过程中常见问题及其解决方法(2006121)
高效液相色谱仪使用过程中常见问题及其解决方法作者：陈莲，高…文章来源：饲料工业点击数：630 更新时间：2005-10-11 高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）是近30年发展起来的一种具有高灵敏度、高选择性的高效快速分离分析技术。
它既能用于微量组分的分析测定，又能用于大量的制备分离，灵活多样，其应用范围已超过其它各种分离方法，尤其在生化医药样品的分析分离方面更能充分发挥它的特长，为推动这些领域的进步和发展作出了巨大贡献。
液相色谱在使用过程中常会出现一些影响分析结果的小问题，如果使用人员了解常见问题及其成因和相关的解决方法，能做到早预防、勤维护，会使分析结果保持较好的稳定性与较高的精确性。
1 液相色谱仪系统液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱、柱温箱、检测器、数据处理系统组成（如图1所示）。
对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件，同时也是容易出事故的主要场所。
2 常见问题及解决方法2．1 针对柱压问题（表1）柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。
所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值，而是指压力波动范围在50PSI之间。
压力过高、过低及波动较大都属于柱压问题，但柱压的高低与色谱柱的种类、品牌、液相系统本身及使用的流动相种类相联系。
值得注意的是在使用梯度洗脱时，进柱压的平稳缓慢的变化是允许的。
在实际应用中柱压过高可从以下几个方面来考虑[1]。
首先考虑柱子是否被堵，此时可更换一根新柱子进行检测。
2．2 针对保留时间漂移的问题[2，3] （表2）保留时间的改变是很多液相色谱使用者常碰到的问题，其包括了保留时间增大和减小。
它的产生与很多原因有关。
2．3 针对异常色谱峰问题[2-4]异常的色谱峰指的是色谱图中无峰或出现负峰、宽峰、双峰、肩峰、峰形不对称等情况。
高效液相色谱使用常见问题解决方法
高效液相色谱使用常见问题症状：(一)保留时间变化可能的原因 : 解决方法1.柱温变化: 柱恒温2.等度与梯度间未能充分平衡 : 至少用10倍柱体积的流动相平衡柱3.缓冲液容量不够 : 用>25mmol/L的缓冲液4.柱污染 : 每天冲洗柱5.柱内条件变化 : 稳定进样条件,调节流动相6.柱快达到寿命 : 采用保护柱(二)保留时间缩短可能的原因 : 解决方法1.流速增加 : 检查泵,重新设定流速2.样品超载 : 降低样品量3.键合相流失 : 流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向4.流动相组成变化 : 防止流动相蒸发或沉淀5.温度增加 : 柱恒温(三)保留时间延长可能的原因: 解决方法1.流速下降 : 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.硅胶柱上活性点变化 : 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱3.键合相流失 : 同前(二)34.流动相组成变化 : 同前(二)45.温度降低 : 同前(二)5(四)出现肩峰或分叉可能的原因: 解决方法1.样品体积过大 : 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.样品溶剂过强 : 采用较弱的样品溶剂3.柱塌陷或形成短路通道 : 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.柱内烧结不锈钢失效 : 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.进样器损坏 : 更换进样器转子(五)鬼峰可能的原因: 解决方法1.进样阀残余峰 : 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.样品中未知物 : 处理样品3.柱未平衡 : 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) : 每天新配,用抗氧化剂5.水污染(反相) : 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水(六)基线噪声可能的原因: 解决方法1.气泡(尖锐峰) : 流动相脱气,加柱后背压2.污染(随机噪声) : 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂3.检测器灯连续噪声 : 更换氘灯4.电干扰(偶然噪声) : 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)5.检测器中有气泡 : 流动相脱气,加柱后背压(七)峰拖尾可能的原因: 解决方法1.柱超载 : 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相2.峰干扰 : 清洁样品,调整流动相3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品4.同前(四)4 : 同前(四)45.同前(四)3 5. : 同前(四)36.死体积或柱外体积过大 : 连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管7.柱效下降 : 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱(八)峰展宽可能的原因: 解决方法1.进样体积过大 : 同(四)12.在进样阀中造成峰扩展 : 进样前后排出气泡以降低扩散3.数据系统采样速率太慢 : 设定速率应是每峰大于10点4.检测器时间常数过大 : 设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%5.流动相粘度过高 : 增加柱温,采用低粘度流动相6.检测池体积过大 : 用小体积池,卸下热交换器7.保留时间过长 : 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8.柱外体积过大 : 将连接管径和连接管长度降至最小9.样品过载 : 进小浓度小体积样品液相色谱常见问题及处理方法HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法1、样品量不足，解决办法为增加样品量2、样品未从柱子中流出。
高效液相色谱仪使用过程中常见问题及其解决方法
８ ２００５．０５高效液相色谱仪使用过程中常见问题及其解决方法陈莲 高洪 肖啸（云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明 ６５０２０１）高效液相色谱（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， ＨＰＬＣ）技术是近３０年发展起来的一种具有高灵敏度、高选择性的高效快速分离分析技术。
它既能用于微量组分的分析测定，又能用于大量的制备分离，手段灵活多样，其应用范围已超过其它各种分离方法，尤其在生化医药样品的分析分离、食品卫生安全检验等方面更能充分发挥它的特长，为推动这些领域的进步和发展作出了巨大贡献。
液相色谱在使用过程中常会出现一些影响分析结果的小问题，如果使用人员了解了常见问题及其成因和相关解决方法，能做到早预防勤维护，使分析结果保持较好的稳定性与较高的精确性。
１ 液相色谱仪系统液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。
对于整个系统而言，色谱柱、泵和检测器是核心部件同时也是容易出事故的主要部件。
２ 常见问题及解决方法２．１ 针对柱压问题柱压变化是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的指标，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效高低、分离效果及保留时间等密切相关。
所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在５０ＰＳＩ（针对Ｗａｔｅｒｓ高效液相色谱仪）之间。
压力过高、过低及波动较大都属于柱压问题，但柱压的高低与色谱柱的种类、品牌、液相系统本身及使用的流动种类相关。
值得注意的是在使用梯度洗脱进柱压的平稳缓慢的变化是允许的。
一般而言，柱压变化最先考虑的是柱子，在排除柱子因素后再考虑其它因素。
在实际应用中常见柱压问题可从以下几个方面来考虑（见表１）。
２．２ 针对保留时间漂移的问题保留时间的改变是很多液相色谱仪使用者常碰到的问题，包括了保留时间的延长或缩短。
它的产生与很多因素有关，可从以下方面进行考虑（见表２）。
图１ 液相色谱仪工作系统及流程２００５．０５ ９更换新的色谱柱。
高效液相色谱实验教学存在的问题、原因及对策
用脱节 的问题
从 用 工 企业 反 馈 的信息 来 看 ， 大 部分 学 过高 效 液相 色谱 实验课 程 的毕 业 生 ， 对 于 色谱 进 样 针 的使
用、 进样操作、 软件使用 、 数据分析掌握相对较好 ， 但
基金项 目 ： 西华大学重点科研基金项 目（ Ｚ １ ２ ２ ３ ３ ２ ２ ） ； 西华大学校级教改项 目。
２ ６
第３ ０卷第 ３期
高效液相 色谱 实验教 学存在 的问题、 原 因及 时策
２ ０ １ ３年 ９月
题 。很 多 同学 在实 际使 用 过 程 中 ， 往 往 按 照 这 样 的 错 误操 作 执行 ： 当分析样 品色谱 峰 出来 完毕后 ， 就直 接停 泵 、 关 软件 、 关 电源 。这 样 的错 误 操作 过程 缺少
一高效液相色谱实验教学中存在学与用脱节的问题从用工企业反馈的信息来看大部分学过高效液相色谱实验课程的毕业生对于色谱进样针的使用进样操作软件使用数据分析掌握相对较好但是对于一些核心操作过程特别是涉及仪器保护方面的操作技能掌握很差有些知识点甚至根本没有掌握到存在以下学与用脱节的问题
第３ ０卷 第 ３期
处理 操作 过程 。 ２ ．不知 道 如何 更 换 液 相 色谱 柱 。有 的 同 学 不
发展 出了制备 型高 效 液 相 色谱 ， 大 大丰 富 了分离 制
备手 段 。但是 ， “ 仪 器分 析 实验 ” 课 程所 涉 及 大型
仪器 由于价格 昂 贵 ， 实验 室仪 器 的数量有 限 ， 实践教 学 时很难 达到 每人 一 台仪 器 ， 高效液 相色谱实验教学存在 的 问题 、 原 因及对策 术
高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法
高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法1 色谱柱跑干了，处理方法：将贮液瓶装入重蒸水，首先按purge键，将柱前气柱排出，若无法排出，可将色谱柱前拆下，用注射器抽吸。
待柱前气体排空后，连接色谱柱，用水高低流速交替冲洗色谱柱，直至柱压稳定为止。
2.基线不稳，有静电，处理方法：检查接地是否良好。
3.峰面积变化非常大，处理方法：检查是否进样阀堵塞。
4.基线突然提高，变粗，处理方法：检查样品池能量，若低于正常值，说明检测器污染。
5.柱压变动范围较大，处理方法：多为进气泡。
高低流速交替冲洗。
6.柱效或峰形突然变差，处理方法：更换预柱。
7塔板数低：色谱柱选择不对，二次保留、峰形不好的影响8色谱柱易变性：色说柱选择不对，二次保留的影响9色谱柱寿命短：色谱柱选择不对，样品需预处理（PH<3或PH>7）10保留值变化：色谱柱平衡不够，流动相比例改变11出现新的干扰峰：初始分离不够或初始样品无代表性选择波长要从以下几个方面考虑：1. 检测波长要大于溶剂截止波长。
如果所选择的波长下溶剂有很强的吸收当然是不合适的。
溶剂有强吸收后，基线抬高，减小检测的线性范围而且会加大基线噪声，对溶质的检测灵敏度下降。
2. 对各组分都要有适当的吸收。
一般是不可能做到的。
所以只要选择一个对大多数组分都有较大吸收的波长就可以了。
3. 外标法定量时，要选择被测组份最大吸收波长。
254nm 对常见的共轭结构和羰基官能团都有吸收。
对饱和基团也有弱的吸收。
而对于常见的乙腈、甲醇的透过率很高。
是在不知道用什么波长时最理想的试验波长。
（一）涡流扩散（Eddy diffusion）流动相碰到较大的固体颗粒，就像流水碰到石头一样产生涡流。
如果柱装填得不均匀，有的部分松散或有细沟，则流动相的速度就快；有的部位结块或装直紧密则流就慢，多条流路有快有慢，就使区带变宽。
因此，固相载体的颗粒要小而均匀，装柱要松紧均一，这样涡流扩散小，柱效率高。
高效液相色谱使用过程中的常见问题及解决方法
高效液相色谱使用过程中的常见问题及解决方法2014-07-02高效液相色谱技术,HPLC 是近期发展起来的一种具有高灵敏度、高选择性的高效快速分离、分析技术.它既能用于微量组分的分析测定，又能用于大量的制备分离，灵活多样，应用范围已超过其它各种分离方法。
如果HPLC使用人员能在分析样品之时就熟悉常见的问题并加以解决，就能避免许多麻烦，让您在HPLC使用过程中轻松应对。
1 高效液相色谱仪系统液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成(见图1)。
对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件，同时也是易出问题的主要部位。
2 高效液相色谱仪常见问题及解决方法高效液相色谱仪作为一种高精密仪器，如果在使用过程中操作不当的话,就容易导致一些问题，其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰形异常问题。
2.1 柱压问题柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。
所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值，而是指压力波动范围在345kPa以内(在使用梯度洗脱时，柱压平稳、缓慢的变化是允许的)。
压力过高、过低都属于柱压问题。
2.1.1 压力过高这是高效液相色谱仪在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的情况。
此时，我们应该分段进行检查。
①首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。
处理方法：用30%的硝酸浸泡0.5h，在用超纯水冲洗干净。
如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，再检查。
②打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤头堵塞。
处理方法：将过滤头取出，用10%的异丙醇超声30min。
如果压力降至690kPa以下，过滤头正常，再检查。
③把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。
高效液相色谱常见问题分析与对策
高效液相色谱常见问题分析与对策高效液相色谱常见问题分析与对策液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。
其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决；而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。
对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。
A、峰拖尾原因解决方法1、筛板阻塞a、反冲色谱柱b、更换进口筛板c、更换色谱柱2、色谱柱塌陷填充色谱柱3、干扰峰a、使用更长的色谱柱b、改变流动相或更换色谱柱4、流动相PH选择错误调整PH值。
对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰5、样品与填料表面的溶化点发生反应a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂b、更改色谱柱B、峰前延原因解决方法1、柱温低升高柱温2、样品溶剂选择不恰当使用流动相作为样品溶剂3、样品过载降低样品含量4、色谱柱损坏见A1、A2C、峰分叉原因解决方法1、保护柱或分析柱污染取下保护柱再进行分析。
如果必要更换保护柱。
如果分析柱阻塞，拆下来清洗。
如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。
如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。
2、样品溶剂不溶于流动相改变样品溶剂。
如果可能采取流动相作为样品溶剂。
D、峰变形原因解决方法1、样品过载减少样品载量E、早出的峰变形原因解决方法1、样品溶剂选择不恰当a、减少进样体积b、运用低极性样品溶剂F、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰原因解决方法1、柱外效应a、调整系统连接（使用更短、内径更小的管路）b、使用小体积的流通池G、K’增加时，脱尾更严重原因解决方法1、二级保留效应，反相模式a、加入三乙胺（或碱性样品）b、加入乙酸（或酸性样品）c、加入盐或缓冲剂（或离子化样品）d、更换一支柱子2、二级保留效应，正相模式a、加入三乙胺（或碱性样品）b、加入乙酸（或酸性样品）c、加入水（或多官能团化合物）d、试用另一种方法3、二级保留效应，离子对加入三乙胺（或碱性样品）H、酸性或碱性化合物的峰拖尾原因解决方法1、缓冲不合适a、使用浓度50-100mM的缓冲液b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液I、额外的峰原因解决方法1、样品中有其他组份正常2、前一次进样的洗脱峰a、增加运行时间或梯度斜率b、提高流速3、空位或鬼峰a、检查流动相是否纯净b、使用流动相作为样品溶剂c、减少进样体积J、保留时间波动原因解决方法1、温控不当调好柱温2、流动相组分变化防止变化（蒸发、反应等）3、色谱柱没有平衡在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱K、保留时间不断变化原因解决方法1、流速变化重新设定流速2、泵中有气泡从泵中除去气泡3、流动相选择不恰当a、更换合适的流动相b、选择合适的混合流动相L、基线漂移原因解决方法1、柱温波动。
高效液相色谱使用中常见问题及对策
高效液相色谱使用中常见问题及对策
高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离和分
析技术。
在使用HPLC的过程中，可能会遇到一些常见问题，以下是一些可能的问题及对策：
1. 峰形不对称或分离不良：可能是由于柱问题引起的。
可以尝试更换柱，确保柱的性能良好，
并尽量避免超出柱的最大推荐压力。
2. 峰形峭度低：这可能意味着分离不充分。
可以尝试调整流动相的组成、pH值或流速来改善
分离。
3. 噪音较大：可能是由于进样器或检测器的问题引起的。
可以检查进样器和检测器的状态，并
确保它们正常运行。
4. 色谱柱寿命较短：这可能是由于样品中的杂质或试剂导致的。
可以尝试优化样品的准备方法，如前处理或过滤样品，以减少对柱的损害。
5. 流动相配制错误：这可能导致峰错位或分离不良。
可以仔细检查流动相的配制方法和溶剂的
纯度，确保配制正确。
6. 峰定量不准确：可能是由于进样量不准确或方法参数设置不合适引起的。
可以检查进样量的
准确性，并根据实际情况调整仪器参数。
7. 泵压过高：可能是由于管路堵塞或柱封堵引起的。
可以检查管路是否通畅，并根据需要更换
柱或清洗柱。
8. 柱渗漏：可能是由于柱端部密封不良或柱老化引起的。
可以检查柱端部的密封情况，并确保
柱处于良好状态。
针对以上问题，及时检查、调整和维护HPLC设备，并根据具体情况进行修复或更换，可以提
高HPLC分析的效果和结果的准确性。
高效液相色谱仪使用遇到的问题及对策
高效液相色谱仪使用遇到的问题及对策1高效液相色谱仪的基本工作原理高效液相色谱仪是由溶液贮器、高压泵、进样系统、色谱分离柱、检测器和数据处理系统几部分组成。
高压泵从溶液贮器中抽走流动相，流经整个仪器系统，形成密闭的液体流路。
样品通过进样系统注入色谱分离柱，在柱内进行分离。
柱流出液进入检测器，使已被分离的组分逐一被检测器收集，并将响应值转变为电信号后经放大被数据处理系统记录色谱峰，通过数据处理系统对记录的峰值进行存储和计算。
2输液泵的常见故障及对策输液泵/高压泵是保证HPLC系统流路畅通、流量精确和压力稳定的重要仪器部件，目前多用往复式恒流柱塞泵，主要由柱塞杆、密封垫圈和两个单向阀组成，用马达带动凸轮驱动柱塞杆作吸液和排液的往复运动。
常分为单柱塞泵、并联柱塞泵、串联柱塞泵和柱塞隔膜泵等类型。
流动相混合方式分为低压混合和高压混合。
常见泵的故障主要有以下几种，并提供解决的办法。
2．1单向阀故障由于球与阀座密封不严，液体倒流，造成压力不稳，甚至球与阀座粘在一起阻死。
密封不严主要是污染或气泡引起，球与阀座粘连也是由于污染和磨损造成。
为避免单向阀中的宝石球和阀座被污染，流动相应使用HPLC级的溶剂，并且配好的流动相一定要用0．45u 滤膜过滤和脱气。
如果泵被微粒污染，可分别用水、甲醇、异丙醇、二氯甲烷依次冲洗。
冲洗时应打开泄液阀，最后再用所用的溶液冲洗整个系统。
气泡进入阀中会紧贴在阀体的一侧，使宝石球难返回到阀座，引起倒流，泵的压力和流速会明显改变。
此时，应立即打开泄液阀，大流量（2ml/min）冲洗泵，直至排除液为直线型。
因为甲醇可润湿泵内壁，挤出气泡，故也可使用脱过气的甲醇冲洗泵。
长期不用的泵或新装的泵头应该用甲醇赶气泡。
泵进气泡也可在泵头上排气泡，即用扳手固定住进气泡的泵头，拧开输出管道的压帽，手动泵送液，可见到气泡从孔中挤压出来，直至无气泡排出将压帽拧紧[3]。
采取上述办法仍不能使压力稳定，应考虑是否密封垫坏了？或单向阀磨损、球不光滑等，需更换部件。
高效液相色谱法的常见问题及解决方法
高效液相色谱法的常见问题及解决方法高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法，这些方法在使用的过程中往往会遇到诸如鬼峰、基线漂移、拖尾、分叉峰、保留时间漂移、柱压过高等系列问题，如何解决这些问题呢?1.用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在?如何解决?关于漂移问题：①温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定;②流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等;③柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡;关于快速变化问题①流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定;②泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出;③流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合;2.液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么?①筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子;②存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子;③可能柱超载，减少进样量;3.HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法①样品量不足，解决办法为增加样品量;②样品未从柱子中流出。
可根据样品的化学性质改变流动相或柱子;③样品与检测器不匹配。
根据样品化学性质调整波长或改换检测器;④检测器衰减太多。
调整衰减即可;⑤检测器时间常数太大，解决办法为降低时间参数;⑥检测器池窗污染。
解决办法为清洗池窗;⑦检测池中有气泡。
解决办法为排气;⑧记录仪测压范围不当。
调整电压范围即可;⑨流动相流量不合适。
调整流速即可;⑩检测器与记录仪超出校正曲线。
解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。
4.做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在?如何解决?①泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理;②比例阀失效，更换比例阀即可;③泵密封垫损坏，更换密封垫即可;④溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法;⑤系统检漏，找出漏点，密封即可;⑥梯度洗脱，这时压力波动是正常的。
高效液相色谱法分析中的常见问题与解决方案
高效液相色谱法分析中的常见问题与解决方案高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种现代化的分析方法，广泛应用于药物、食品、环境等领域。
然而，在实际应用过程中，常常会遇到一些问题。
本文将探讨高效液相色谱法分析中的常见问题，并提供解决方案。
1. 色谱峰分离不良在进行高效液相色谱分析时，首要问题就是色谱峰的分离不良。
造成这个问题的原因可能是样品组分过于复杂，或是色谱柱选择不当。
解决的方法包括：（1）优化样品前处理方法，如提取、净化等，以减少样品的复杂性；（2）调整流动相的组成和流速，或试用其他类型的色谱柱，以提高色谱峰的分离度。
2. 流动相持续泵出问题在HPLC分析过程中，流动相持续泵出是关键步骤之一。
当出现流量不稳定或持续泵出不工作的情况时，可以尝试以下解决方法：（1）检查管路是否有漏气现象，尤其是连接件的密封性；（2）清洗或更换柱子和过滤器，以防止堵塞；（3）检查、更换流量检测器，并校正流量计。
3. 柱寿命较短柱寿命的短暂是高效液相色谱法分析中常见的问题之一，主要原因是样品残留物的堆积、色谱柱废液的积累、和流动相的不合适。
针对这个问题可以采取以下措施：（1）对样品进行预处理，减少残留物的堆积；（2）定期清洗和维护色谱柱，保持柱的表面状况；（3）使用适当的流动相，避免酸性或碱性物质损害色谱柱。
4. 波峰畸变问题波峰畸变是指在色谱图上观察到的峰形呈现为不对称的情况，这可能是由于柱床不均匀、流量不稳定或是组分浓度过高引起。
解决这个问题的方法包括：（1）更换新的色谱柱，确保柱床的均匀性；（2）检查各部分的流量是否稳定，尤其是溶液的泵出和进样流速的稳定性；（3）适当稀释样品，以降低组分浓度。
5. 某些组分无法检测到当分析物无法检测到时，可以考虑以下解决方法：（1）确认所使用的检测器是否适用于分析物的检测，并检查检测器的灵敏度；（2）尝试使用其他检测器或改变检测器条件，如波长或电流；（3）检查样品制备方法是否完整，是否包含了分析物。
高效液相常见问题及解决
高效液相色谱仪使用中常见问题及解决方法●高效液相色谱仪系统液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。
对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。
●常见问题及解决方法高效液相作为一种高精密仪器，如果在使用过程中不按照正确操作的话，就容易导致一些问题。
其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。
1 柱压问题柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。
所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在345kPa 以内或在50PSI（针对Waters高效液相色谱仪）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。
压力过高、过低都属于柱压问题。
1.1 压力过高这是高效液相在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高，1、一般都是由于流路中有堵塞的原因。
此时，我们应该分段进行检查。
(1).首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。
处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。
如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查；(2).打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。
处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。
如果压力降至100PSI以下，过滤白头正常，在检查；(3).把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。
处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。
如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。
假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。
这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。
高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法
高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法1色谱柱跑干了，处理方法：将贮液瓶装入重蒸水，首先按purge键，将柱前气柱排出，若无法排出，可将色谱柱前拆下，用注射器抽吸。
待柱前气体排空后，连接色谱柱，用水高低流速交替冲洗色谱柱，直至柱压稳定为止。
2.基线不稳，有静电，处理方法：检查接地是否良好。
3.峰面积变化非常大，处理方法：检查是否进样阀堵塞。
4.基线突然提高，变粗，处理方法：检查样品池能量，若低于正常值，说明检测器污染。
5.柱压变动范围较大，处理方法：多为进气泡。
高低流速交替冲洗。
6.柱效或峰形突然变差，处理方法：更换预柱。
7塔板数低：色谱柱选择不对，二次保留、峰形不好的影响8色谱柱易变性：色说柱选择不对，二次保留的影响9色谱柱寿命短：色谱柱选择不对，样品需预处理(PH 3或PH 7)10保留值变化：色谱柱平衡不够，流动相比例改变11出现新的干扰峰：初始分离不够或初始样品无代表性选择波长要从以下几个方面考虑：1.检测波长要大于溶剂截止波长。
如果所选择的波长下溶剂有很强的吸收当然是不合适的。
溶剂有强吸收后，基线抬高，减小检测的线性范围而且会加大基线噪声，对溶质的检测灵敏度下降。
2.对各组分都要有适当的吸收。
一般是不可能做到的。
所以只要选择一个对大多数组分都有较大吸收的波长就可以了。
3.外标法定量时，要选择被测组份最大吸收波长。
254nm对常见的共轭结构和羰基官能团都有吸收。
对饱和基团也有弱的吸收。
而对于常见的乙腈、甲醇的透过率很高。
是在不知道用什么波长时最理想的试验波长。
(一)涡流扩散(Eddy diffusion)流动相碰到较大的固体颗粒，就像流水碰到石头一样产生涡流。
如果柱装填得不均匀，有的部分松散或有细沟，则流动相的速度就快；有的部位结块或装直紧密则流就慢，多条流路有快有慢，就使区带变宽。
因此，固相载体的颗粒要小而均匀，装柱要松紧均一，这样涡流扩散小，柱效率高。
(二)分子扩散(Molecular diffusion)分子扩散就是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动，也称纵向分子扩散。
高效液相色谱法应用中常见问题与处理
高效液相色谱法应用中常见问题与处理lionguy（呼和浩特010010；）[摘要] 对高效液相色谱法应用过程中常见的问题及其处理方法进行了阐述。
[关键词] 液相色谱法，问题及处理1.对流动相的要求1.1应使用色谱纯的液体试剂配制流动相，固体试剂至少使用优级纯。
流动相配制后应立即使用，时间久了(超过2天)，不宜再用；特别是加有缓冲盐的流动相，过久的贮存会导致其内部生长肉眼看不见的细菌，若仍然使用它，大量的菌丝体就会附着在色谱柱内，将大大缩短色谱柱的使用寿命。
1.2高纯水也应该使用新鲜制备的，否则回出现与1.1同样的问题。
高纯水是将饮用水经过二次处理(其中至少一次是蒸馏)的水，高纯水中若含有极微量的无机离子杂质，就好像流动相中含有的缓冲盐一样，通常对检测结果不产生不良影响。
高纯水中若存在有机物杂质，当时对检测好像也没有什么影响，当日积月累的杂质吸附达到饱和时，在以后某次检测中就有可能发生吸附杂质的脱落，引起“鬼峰”现象，如果“鬼峰”叠加到了组分的吸收峰上面，就会出现不准确的检测数据。
1.3当使用酸性的缓冲盐流动相时，在pH为7左右时，首选磷酸盐缓冲溶液作为流动相，因其缓冲范围是pH=6.1～8.1；其次可选择醋酸盐缓冲溶液作为流动相，其缓冲范围是pH=3.8～5.8。
当样品的检测波长在210nm附近时，不可使用含有醋酸或柠檬酸的缓冲液做流动相，因其本身在210nm波长处具有一定的吸收[1]。
1.4当检测的样品比较多时，所使用的流动相应一次性足量配制完成，避免在检测过程中由于添加流动相，而造成被测组分峰面积的变化及保留时间的漂移。
1.5流动相在使用前均应进行脱气处理，避免溶解在其中的气体影响基线的稳定性和检测的灵敏度。
2.流路中流动相的存放2.1如果当天使用的是甲醇－水混合流动相系统，而且，次日仍然使用该流动相系统。
检测结束后用该流动相继续冲洗色谱柱后，就可以关机。
2.2如果在反相色谱法中使用了其他有机流动相或者是使用了加有缓冲盐的流动相，检测结时间），最后再用甲醇冲洗，洗净后（柱压很稳定时）就可以关机。
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成也萧何，败也萧何？！——反相制备型高效液相色谱法分离纯化过程中的共性问题内容概览：本文拟通过一个具体实例来介绍制备型高效液相色谱法的特点、影响制备型高效液相色谱分离纯化的因素，及其在合成药物、中药化学对照品研究中的实际应用，并对制备HPLC分离纯化过程中的共性问题做了总结并提出解决方案。
实际应用：某合成药物最终产品的纯化，对其纯度的要求——HPLC-UV法，210 nm & 254 nm 下，以峰面积归一化法，≥98.0%，同时需提供MS、NMR数据。
具体问题：某特定化合物系强极性有机小分子，极性大、难挥发，采用硅胶柱层析不易提纯，需用其他分离技术来纯化。
解决方法：终极目的是提纯该物质。
总体策略——“先看，后想，再行动”——“看化学结构，想理化性质，定纯化方法”。
由于该化合物及相关杂质的理化性质决定了难以用常规的重结晶、蒸馏（精馏）、硅胶柱层析来分离纯化。
结合实验室的具体条件，考虑采用反相制备型高效液相色谱法（Preparative HPLC）来分离纯化之。
方法步骤：1.了解样品及有关组分的情况→2.样品预处理→3.建立Analytical HPLC Method→4.优化Preparative HPLC条件→5.检查出现的问题→6.回收纯化的物质。
更细致地来讲，开始Preparative HPLC之前须明白：待分离样品及有关组分的信息——所含化合物的结构信息（重点关注酸、碱性等极性基团）、UV光谱图（涉及到后续试验检测波长设定）、分子量（分离后目标化合物LC-MS检测确认）、待分离体系的复杂程度（所含化合物的数目，preparative HPLC之前是否须经flash column粗分）；样品预处理——最主要的是样品的溶解度（将尽量多的样品溶于体积相对较小的溶液中）以及待分离体系里是否含强酸、强碱性物质（潜在的“柱杀手”），样品溶液是否需要中和等；建立Analytical HPLC Method——这一步，跟平常的HPLC相似，重点关注待分离的目标化合物，使该物质与其前、后组分分离得尽量相隔远些（起码得基线分离，利于后续制备时放大），若流动相中必须添加改性剂，应尽量避免非挥发性的缓冲盐，优先选择易挥发性缓冲液（例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、甲酸铵、乙酸铵、三乙胺、氨水等），否则要脱盐，得二次分离；优化Preparative HPLC条件——通常来讲，制备柱是实验室现有的（色谱柱就这么定下来了，没得选择的余地，除非是需新购色谱柱），在Analytical HPLC的基础上优化梯度分离方法、考察进样量、目标组分收集确认（LC-MS测分子量）；检查出现的问题——这一步是最需要费心留神的！很多时候，出了问题，根本就没有挽回的余地，当然了，有时也是亡羊补牢，犹为未晚；所以，更多的时候，是需要未雨绸缪，把可能会发生的事情尽量考虑周全！比如样品的溶解度（在甲醇、水、乙腈、流动相、四氢呋喃那、酸水、碱水中的溶解性如何？），若样品溶解性不好，第一步就卡住，很打击人滴！曾遇到过这么个实例——一个某种酶抑制剂，含氮杂环类化合物，在上面提到的那些溶剂中溶解度都相当地小，analytical HPLC虽然分离得很漂亮，但还是没法做。
最后是通过结构修饰，在某活性基团上上个保护基，纯化，再脱保护，曲径通幽，绕了个圈才搞定！再比如，样品的酸碱稳定性、热稳定性，这涉及到分离后，如何除去流动相问题。
若样品在酸性、碱性、加热等条件下，会变坏，那得万分谨慎了。
虽困难，到从合成的角度来讲，也容易判断，合成过程中是否耐受过酸、碱、高温等剧烈条件，很多时候，可从这儿推测出样品的稳定性。
同时，也可以回到出发点——了解样品结构信息，是否含氰基-CN、活性酯键、游离氨基、游离羧基等，以防去除流动相过程中发生氰基变酰胺、酯水解、酸催化酯化等等情况，基础有机化学方面的知识可以派上用场。
回收纯化的物质——万里长征最后一步，但极其需要走稳，否则就前功尽弃、徒劳无益了。
可以先低温旋蒸掉乙腈（甲醇）后，再溶剂萃取或者沉淀出目标化合物；若热稳定性好的话，也可以直接旋蒸干水，或者用油泵拉干，量少的话。
冷冻干燥也可以派上用场。
具体情况具体分析吧。
需要留心的是，虽然挥发性添加剂会旋蒸掉，但也不可能一蹴而就，在旋蒸过程中，梨形瓶里面的收集液酸碱性会越来越强的，相当于浓缩了酸碱，需要注意这个过程中目标化合物的稳定性，是否顶得住。
具体实例：某强极性、含氮碱性化合物的分离纯化上面简单陈述了反相制备型高效液相色谱法分离纯化的基本流程及方法建立过程中的注意事项，下面，聊一个自己的亲身经历，在这次分离纯化过程中，该发生和不该发生的状况都遇到了，痛定思痛，与大家分享一下，前事不忘后事之师！对该强极性、含氮碱性化合物，先在analytical HPLC上摸索分离条件，初次尝试乙腈-水体系，流动相中不添加任何改性剂，结果，分离效果极不理想，出峰偏早且色谱峰形差，拖尾严重！考虑在流动相中添加Formic Acid，调pH 2.0，抑制色谱柱残留硅羟基的解离，从而降低硅羟基效应。
这么一试，效果立竿见影，再微调梯度洗脱强度，就这样在analytical HPLC的条件模式好了，下一步，转移到preparative HPLC上。
制备分离之前，在溶解样品的时候，又遇到麻烦了，该化合物在纯甲醇、纯水中溶解度都不怎么好，甲醇-水混合溶剂，还是不咋的——成了乳浊液了，跟牛奶似的，考虑到流动相里添加了酸，而该化合物又是碱，于是乎，滴加甲酸助溶，边滴加边振摇，样品终究给溶清了，0.45um滤过，备用，待分离。
先试试，小体积进样；观望ing，期待ing，留意系统反压，居然比平时类似色谱条件下，柱压高了1000多psi，眉头紧锁，有问题？！果然，出峰不正常，很快就出来了，居然没怎么保留！！！检查管路，流动相设置是否对应，没问题呀，难不成样品有问题？询问合成的同事，这个化合物是怎么做过来的。
不问不知道，一问吓一跳！！！样品含脂肪胺（二乙烯三胺），是反应起始原料之一，由于其沸点高（～200℃）旋干溶剂的时候根本没有除去。
赶紧测样品溶液的pH值，10左右，汗ing～～～，好在第一针是预试，进样体积小，不然制备柱就。
先前溶解样品时都用甲酸助溶了，没想到碱性居然还有这么强，没办法，只得中和了。
调整到偏酸性了，再次尝试。
这下倒是一切正常了，分离效果也不错！耶～∨，经这么折腾，梯度洗脱条件基本固定下来了，然后优化考察进样量，逐步增大上样量，正常，分离效果不错，再增加进样体积，还是分得不错！进一步增大，居然很快就洗下来了，明显地不正常！仔细一想，看来这个低分子有机胺对色谱分离是有影响的，只是在分析条件下、小体积进样一时没有表现出来而已。
既然是游离伯胺，能否用铜离子去络合呢？但是目标化合物也含有这个片段，也会同时被络合掉，没办法，看来只能小体积进样了，少量多次啦！就这样，一针、两针、三针。
边分离，边让同事回收已经收集好的组分。
一天过去了。
担心旋蒸去除溶剂的过程中样品变坏，取已经脱除溶剂的样品做个NMR H谱，结果大事不妙，噩耗啊，H谱上居然多出了个峰，仔细一看，甲酸意外地跟氨基干上了，旋蒸过程中游离伯胺被甲酰化了，苦笑不得呀。
冷静想想也正常，甲酸HCOOH，具有醛基，跟胺反应了。
幸好，幸好只溶解了少量的样品，大部分的膏状物还放在一边，还能经得起这次折腾。
（突然想起来老子的——“祸兮福之所倚，福兮祸之所伏”或者说“成也萧何，败也萧何”）看来，这种情况之下是不能用甲酸作为流动相添加剂了，改用TFA，况且TFA沸点比Formic Acid低，容易去除。
就这么改过来了，试试，效果还不错！但是有个潜在的问题没解决——体系里脂肪胺对色谱分离的影响！！这个比较麻烦，虽少量多次可以做，但太耗费时间和流动相了，还是得想办法增大进样量。
于是乎，斗胆，大体积进样一针，试试看？！结果正常，让人惊喜啊！再试试，看能否重复？结果令人失望！邪乎？再试，正常，再试，又不正常。
这么个周期下来很可能是上一针对下一针的色谱分离有影响。
但不敢肯定，于是乎，进个空白，再进样品，正常！！！如今，华山两条道——要么一针样品一针空白，要么想个法子把胺的影响消除掉。
一针样品一针空白，这么做太费时间了，也耗溶剂。
能否把胺给洗掉呢？仔细分析上面的图谱，发现上一针跟硅羟基作用的胺在下一针能部分洗下来的。
好，好，洗洗看！在洗脱梯度过后增加高比例水洗柱，再平衡柱子。
就这么尝试，管用！松了口气，就这么连续3天，分离出了足够量的样品。
哈哈，搞定！没想到，没想到的是，一波为平，一波又起！在去除溶剂回收目标化合物的过程中又出岔子了。
旋干溶剂后，样品成了三氟乙酸盐，加碱，调pH值，游离出来！打算这么干，将三氟乙酸除掉，可惜，三氟乙酸居然不能完全除去，做NMR19F谱，在化学位移-73左右能明显看到TFA的峰，可怜那位做合成的同事啊。
只能再来一次纯化了，过离子交换树脂，除去TFA。
这部分的工作是意料之外的。
幸好，幸好能搞掉，不然in vitro pharmacolog怎么办呀，TFA不把那些细胞毒死才怪！！！至此，事情有个令人满意的结局了，虽然中途破费周折。
痛定思痛，从这个case中，可以得出三点启发：1. Preparative HPLC分离纯化之前，必须对待分离化合物体系有充分的了解。
诸如目标化合物的溶解度——在流动相中的溶解度显得非常重要。
若溶解性差，易于柱头析出，小心添“堵”！另外，对于合成产物纯化而言，由于反应种类繁多、体系复杂，所用溶剂、酸碱催化剂均有可能对色谱分离产生影响（诸如合成反应过程中所用TFA、TEA、DEA、甲/乙基磺酸、三氟甲磺酸、吡啶、脂肪胺等）。
进样之前，是否需要预处理（比如调节样品溶液pH）2. Preparative HPLC分离纯化过程中，需实时密切关注系统压力，留意仪器设备工作状态。
若有反常现象则意味着某处有潜在的问题，考虑从样品溶液、流动相、仪器本身、色谱柱、检测器等各个方面排查。
3. Preparative HPLC分离纯化之后，在回收目标化合物时，需对其耐酸、碱性、热稳定性有所了解，谨防最后一步出乱子。
同时，结合具体情况，留心防范流动相添加剂的“副作用”。
“且做且学，且学且做，且做且行，且行且珍惜……”。