转化及重组子的筛选
14 第十四讲(2) 重组子的筛选和鉴定
2 营养缺陷型检测法
如果目的基因产物能降解某些药物使菌 株呈现抗性标记，或者基因产物与某些药物 作用是显颜色反应，则可根据抗性或颜色直 接筛选含目的基因的克隆子。
亮氨酸(leu)为leu菌所必须 。 在不含leu的基本培养基中，只有重组子 表达的leu才能被leu缺陷菌所利用而能生 长，形成菌落。 因此，能生长的菌落是阳性的重组子克 隆，没有重组子的leu缺陷菌在不含leu的 培养基中不能生长，不能形成菌落。
催化4-甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸， 产生萦光物质4-甲基伞形花酮，以此筛选 含gus基因的转化子。 尤其是gus基因的3’端与其他结构基因连接 产生的嵌合基因仍能正常表达，产生的融 合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在 转化生物体中的定位分析。
Hale Waihona Puke 萤火虫萦光素酶基因（luc）
luc表达产物萤火虫萦光素酶（LUC）在 Mg2+的作用下，可以与萦光素和ATP底物发 生反应，形成与酶结合的腺苷酸萦光素酰 化复合物，经过氧化脱羧作用后，该复合 物转变成为处于激活状态的氧化萦光素， 可以用萦光测定仪快速灵敏地检测出产生 的萦光，是目前研究动植物转基因很好用 的一种报告基因。
3 依赖于重组子结构特征分析的筛选法
⑴ 快速裂解菌落鉴定分子大小 主要是根据有外源DNA片段插入载体后的 重组DNA与载体DNA之间的大小差异来鉴 定重组子。 分别提取不同转化子的DNA，经琼脂糖凝 胶电泳，在琼脂糖凝胶板上出现的DNA带 中，落后的带是重组DNA的带。 此方法只用于重组子的初步鉴定。
7 插入失活法
基本原理： 是将特定的DNA随机插入到重组DNA分子 中，获得一系列插入重组子，根据其突变 的类型鉴定失活的基因，进一步利用此插 入DNA作为标记物，对失活基因进行定位。
基因片段与载体连接、转化和重组子筛选
1、ＤＮＡ分子的体外连接
ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下，
由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组 邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸 酸脂键的生物化学过程， ＤＮＡ分子的连接 是在酶切反应获得同种酶得注意的几个问题：
1.ＤＮＡ连接酶
常用的ＤＮＡ连接酶有两种：
制备感受态细胞
现在制备感受态细胞通常用CaCl2处理，在低温中 与外来ＤＮＡ分子相混合. ＤＮＡ分子转化分以下几步: １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； ２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受 体菌，另一条降解； ３． 自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制成 双链； ４．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。
四．结果与分析讨论
１．计算转化率。 ２．根据转化率和阴性对照分析实验结果。 问题与讨论： １．根据本实验认为影响转化率的因素有哪
些？ ２．抗性法筛选和互补筛选原理是什么？
2.重组子的筛选
这和受体菌：质粒ＤＮＡ的选择相关，
原则
上要注意： １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌 株； ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原 则而定。 重组子的筛选方法常用的有两种方法：
１．抗生素筛选法
菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有 该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等 ）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养 基上长出。 本实验利用抗生筛选转化子。
四．结果与分析
电泳检查连接结果
１．如何判断连接效果的成功性？
问题与讨论：
１．简述Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机理。 ２．简述一个完整外源ＤＮＡ的克隆过程。 ３．连接反应中应注意些什么问题及如何提
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。
4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。
二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。
在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。
目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。
Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。
Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。
Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。
Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。
限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。
重组DNA转化及筛选实验报告
重组DNA转化及筛选实验报告引言DNA重组技术是现代生物学研究中不可或缺的工具之一，它可以将外源基因片段插入到宿主细胞的染色体中，从而实现特定基因的表达。
DNA转化是重组技术的关键步骤之一，通过电刺激或化学方法将外源DNA引入宿主细胞中。
本实验旨在通过DNA转化及筛选，构建宿主细胞中的重组DNA，并对成功转化的细胞进行筛选。
实验材料和方法材料：1. E. coli DH5α细胞2.外源质粒DNA3.LB琼脂培养基4.青霉素/链霉素抗生素5.离心管6.PCR仪7.恒温摇床方法：1.准备转化液：将50 mL LB琼脂培养基加入含有适量抗生素的离心管中，混匀。
2.取出青霉素/链霉素抗生素的冻存液，解冻后加入LB培养基中，使其浓度为最佳浓度。
3.取出冻存的E. coli DH5α细胞，放在冰上解冻。
4.加入转化液中的合适量DNA，比例为1:10（DNA:转化液）。
5.放入37℃恒温培养箱中孵育30分钟。
6.取出孵育后的细胞转化液，通过离心将细胞沉淀。
7.倒掉上清液，用适量的无菌去离子水悬浮细胞。
8.取一小部分悬浮液涂抹在含有抗生素的琼脂平板上。
9.将琼脂平板放置在37℃恒温培养箱中培养过夜。
10.检查平板上是否有菌落生长，记录结果。
11.选取生长菌落较大、菌落形态规则的菌落进行进一步筛选。
12.取一小部分菌落涂抹在新的琼脂平板上进行单克隆分离。
13.重复步骤12，直至获得纯合阳性克隆菌落。
14.提取纯合阳性菌落中的质粒DNA，进行PCR验证。
结果与讨论经过上述实验操作，我们成功地进行了重组DNA的转化和筛选。
在配制转化液时，选择适量的抗生素浓度非常重要，它可以帮助筛选出成功转化的细胞。
通过在琼脂平板上培养过夜后，我们可以观察到菌落的生长情况。
有菌落生长的平板可以说明转化成功，而没有菌落生长的平板则说明转化失败。
选取生长较大、形态规则的菌落进行进一步筛选是为了确保筛选出的细胞是单克隆的。
通过单克隆分离，我们获得了纯合阳性克隆菌落。
重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定
重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定姓名:郑小煜学号:201100140069班级:11级生技班同组者:赵莉、高瑞【实验目的】1、学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2、通过对DNA的酶切，学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
3、学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
4、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法。
5、学习并掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6、在使用红白菌落法筛选获得重组子的基础上，本实验学习通过对重组子进行重组质粒DNA的抽提鉴定，以进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段，验证重组子是期望的重组子的方法。
7、通过学习掌握重组DNA分子鉴定的基本方法。
8、掌握α互补筛选法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
9、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法。
10、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。
【实验原理】外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1、限制性核酸内切酶及酶切反应体外构建重组DNA分子，首先，要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能得到完整的目的基因。
其次，要选择具有相应的单一酶切位点的质粒或者噬菌体等载体分子作为克隆的载体。
转化子的筛选和重组子的鉴定
双脱氧末端终止测序法旳基本操作：
ssDNA ssDNA ssDNA ssDNA
Prime Prime Prime Prime rKlenow rKlenow rKlenow rKlenow dNTPs dNTPs dNTPs dNTPs ddATP ddCTP ddGTP ddTTP
聚丙烯酰胺凝胶电 泳A C G T
pUC18 2.7 kb
ori
后经过其长度来鉴定其是否为重组子 Apr
区别重组子与非重组子
假如外源DNA片段插pUC18 旳SphI位点处，原则上也可 用SphI酶解鉴定，但这么做 很不经济，因为SphI非常昂 贵（每100单位50美元）。用 HindIII和EcoRI联合酶解一样 能够到达目旳，但这两种酶 旳价格只及SphI旳1 / 50
非重组子：Apr、Tcr
重组子：Aps、Tcs
EcoR I Cla I
Pst I Hind III
Pvu I
BamH I
Pst I Ap r
Tcr
Sal I
pBR322
4363 bp
ROI
ori
ROP
Bal I
Hind II
基本操作： 将转化液涂布含Ap旳平板
再将Ap平板上旳转化子影印 至具有Ap和Tc旳平板上
缺刻前移标识法
5＇ 5＇ 5＇ 5＇
5＇
5＇
DNase I
5＇
DNA聚合酶I
5＇
dNTP、[α-32P]dATP
5＇
变性
5＇
限制性酶切图谱法
所谓旳限制性酶切图谱法就是对载体上插入旳外源 DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目旳基因旳已 知图谱对比，所以利用这种措施不但能区别重组子与非 重组子，而且还能鉴定目旳重组子。但这种措施在用于 数千规模旳转化子筛选时，工作量极大，试验成本也高 。
转化子的筛选和重组子的鉴定
转化子的筛选和重组子的鉴定在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA 分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞。
再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所致。
因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。
一、基本定义：1、转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。
2、重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。
3、阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。
4、筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。
二、将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5三、转化子的筛选1、根据载体标记基因筛选转化子。
（1）方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。
（2）举例：抗药性标记插入失活选择法、根据载体除草剂抗性基因、β-半乳糖苷酶显色反应选择法、根据生长调节剂非依赖型筛选转化子、根据核苷酸合成代谢相关酶基因的缺失互补筛选。
2、根据报告基因筛选转化子。
（1）报告基因的定义：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。
由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。
（2）成为报告基因的条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏毒高的基因。
如：gus葡醛糖酸酶基因、Lus荧光虫荧光素酶基因、Gfp绿色荧光蛋白基因。
3、根据形成噬菌斑筛选转化子。
重组质粒的连接、转化及筛选
重组质粒的连接、转化及筛选概述质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。
如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。
在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。
但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。
通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。
外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。
也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。
2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。
由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。
所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。
还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。
带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。
5.实验五转化及重组子的筛选
一种巧妙的鉴定重组质粒的方法：是蓝-白 颜色筛选。 • 该法可以在同一转化平板上完成筛选。 • 这种方法也涉及基因的插入失活，正如名 称所示，它利用一种蓝色化合物的形成作 为指示剂。在这种情况下失活基因是lacZ， 该基因编码β--半乳糖苷酶，受lac启动子的 调控。 • 当E.coli菌株表达 Lac阻抑物,则载体上的 lacZ基因由IPTG 诱导表达，表达形成的酶 可以利用底物 X-gal形成一种蓝色化合物。 • 重组质粒中lacZ的插入失活将导致不能形 成蓝色菌落。
实验五
转化及重组子的筛选
（一）实验目的
了解细胞转化的概念及其在分子生 物学 研究中的意义； 学习外源DNA转化入受体菌细胞并 筛选转化体的方法。
（二）实验原理
① 转化（transformation）是将异源DNA分子导 入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性 状的一种手段。 • 其原理是细菌处于0℃， CaCl2低渗溶液中，菌 细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗 DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面， 经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复 合物。 • 进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗 传信息的转移，使受体细胞表现新的遗传性状。 将经转化后的细胞在选择性培养基中培养，即 可筛选出转化体（transformant），即带有异 源DNA分子的受体细胞。
• 有外源基因插入的细菌呈白斑，无外源基 因插入的细菌呈蓝斑。
③ 实验具体操作是将转化细胞涂布于含 氨苄青霉素、I白色菌落未表达β-半乳糖苷酶，因而 可能含有插入的目的片段，而蓝色菌 落很可能是自环载体的克隆。
Alfa互补
pMD18-T Vector
（五）注意事项
将连接产物加到感受态细胞后，混匀
重组子筛选与鉴定
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
有些载体在设计时，在筛选标记基因年前面加上 一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时， 其下游的筛选标记基因才能表达。
（4）显色筛选法
常用的显色剂是x-gal(5-溴 4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。
具有完整的乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶、透过 酶和乙酰基转移酶，当培养基中存在诱导物IPTG（异丙 基-β-D-半乳糖苷）和x-gal时，可产生蓝色沉淀物，使菌 体成为蓝色，如果在载体DNA上组入lacZ部分缺失的片段 lacZ’，则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌株，则在含有 x-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而 lacZ’得到的转化子是白色菌落。
pBR322 4362bp
ori
克隆位点
(
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
)
1. 根据载体选择标记基因初步筛选转化子
实验五 转化及重组子的筛选
Transfer of T-DNA from Agrobacterium into a plant cell
Regeneration of leaf disks infected by Agrobacterium
DNA重组 重组
外源基因插入与否可通过载体上的 外源基因插入与否可通过载体上的 Lac Z基因进行初步的筛选。 Z基因 基因进行初步的筛选。 外源基因插入的细菌呈白斑 白斑， 有外源基因插入的细菌呈白斑， 外源基因插入的细菌呈蓝斑 蓝斑。 无外源基因插入的细菌呈蓝斑。
进入细胞的DNA分子通过复制、表 进入细胞的DNA分子通过复制、表 ，实现遗传信息的转移 遗传信息的转移，使受体 达，实现遗传信息的转移，使受体 细胞表现新的遗传性状。 细胞表现新的遗传性状。 将经转化后的细胞在选择性培养基 将经转化后的细胞在选择性培养基 中培养，即可筛选 中培养，即可筛选出转化体 筛选出 (transformant)，即带有异源 (transformant)，即带有异源DNA分 异源DNA分 子的受体细胞。 子的受体细胞。
Alfa互补 Alfa互补
蓝-白颜色筛选(α互补) 白颜色筛选( 互补)
一种巧妙的鉴定重组质粒的方法：是蓝 一种巧妙的鉴定重组质粒的方法：是蓝白颜色筛选。该法可以在同一转化平板 白颜色筛选。该法可以在同一转化平板 上完成筛选。 • 这种方法涉及基因的插入失活：它利用一 这种方法涉及基因的插入失活：它利用一 种蓝色化合物的形成作为指示剂。 种蓝色化合物的形成作为指示剂。 • 在这种情况下失活基因是lacZ，该基因编 在这种情况下失活基因是lacZ，该基因编 半乳糖苷酶，受lac启动子的调控。 码β-半乳糖苷酶，受lac启动子的调控。
lacZ中间 lacZ中间又插入了一段人工设计的DNA序 中间又插入了一段人工设计的DNA序 列，称为多克隆位点（MCS），含多个常 列，称为多克隆位点（MCS），含多个常 用的限制性核酸内切酶的位点，使外来的 用的限制性核酸内切酶的位点，使外来的 片段能很方便的被插入在此，当外来序列 片段能很方便的被插入在此，当外来序列 lacZ 插入后则破坏了lacZ编码的半乳糖苷酶活 插入后则破坏了lacZ编码的半乳糖苷酶活 性，生长的菌落就呈白色。 ，生长的菌落就呈白色 白色。
重组子的筛选方法
重组子的筛选方法一、引言重组子筛选是基因工程中的一项关键技术，用于识别和分离含有目的基因的克隆。
随着生物技术的不断发展，重组子筛选方法也日益多样化，为研究者提供了更多选择。
本文将对几种常见的重组子筛选方法进行详细介绍，并比较其优缺点。
二、常见重组子筛选方法1. 蓝白筛选法：蓝白筛选法是一种基于λ噬菌体载体和lacZ基因的筛选方法。
其基本原理是利用lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶可以将无色底物X-gal转化为蓝色产物。
当载体上含有目的基因时，lacZ基因被破坏，无法产生β-半乳糖苷酶，菌落呈白色。
这种方法操作简便，适用于大量筛选。
2. 抗性筛选法：抗性筛选法是利用标记基因赋予宿主菌抗药性或营养缺陷型特性，从而筛选重组子的方法。
例如，利用卡那霉素抗性基因（neo）对细菌进行筛选。
当载体上含有目的基因时，neo基因被破坏，重组子对卡那霉素产生抗性。
这种方法成本低廉，适用于实验室条件。
3. 荧光标记筛选法：荧光标记筛选法是利用荧光标记探针与目的基因杂交，通过荧光显微镜观察荧光信号来筛选重组子的方法。
该方法灵敏度高，可实现自动化操作。
然而，荧光标记探针制备成本较高，且对实验操作要求较高。
4. 测序法：测序法是通过对目的基因进行测序，比对已知序列来确定重组子的方法。
该方法准确度高，适用于所有基因型重组子的筛选。
然而，测序法成本较高，操作复杂，不适合大量筛选。
三、比较与讨论蓝白筛选法、抗性筛选法和荧光标记筛选法各有优缺点。
蓝白筛选法操作简便、成本低廉，适用于大量筛选；但灵敏度较低，可能会漏掉一些弱阳性克隆。
抗性筛选法成本低、适用范围广；但标记基因可能会影响目的基因的表达，导致结果不准确。
荧光标记筛选法灵敏度高、可自动化操作；但成本较高，对实验操作要求严格。
测序法则准确度高，可适用于所有基因型重组子的筛选；但成本较高、操作复杂，不适合大量筛选。
因此，在选择重组子筛选方法时，应根据具体实验需求和条件进行综合考虑。
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定摘要：以质粒pUC19作为载体、λDNA作为外源片段来源，限制性核酸内切酶Hin dⅢ分别对其进行单酶切，产生相同的黏性末端后用T4 DNA连接酶连接从而构建重组质粒，用CaCl2制备E.coli感受态细胞，并用热激法进行重组质粒的转化，培养并用α-互补筛选法进行筛选，最后用试剂盒提取质粒DNA进行检测。
根据在实验过程中所遇到的问题及对结果的分析，探讨关键步骤及影响转化/重组效率的相关因子，并说明实验过程中应当注意的问题。
关键词：DNA酶切连接感受态细胞转化重组子的筛选与鉴定引言：实验目的为掌握限制性核酸内切酶的分类、特性与作用原理以及对DNA进行酶切的实验技术，掌握DNA连接酶的作用原理以及利用T4 DNA连接酶构建重组DNA分子的实验技术，掌握利用CaCl2制备E.coli感受态细胞的原理和方法，掌握α-互补筛选法的原理，学习用试剂盒提取质粒DNA的方法，复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法，掌握利用琼脂糖凝胶电泳筛选重组质粒。
限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。
主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制（限制修饰系统）。
限制性核酸内切酶分为三类，Ⅰ型与Ⅲ型：识别位点与切割位点不一致，故同一种酶切产生的片段长度不同；Ⅱ型：固定的识别序列处切割，故每次都产生完全相同的片段。
影响限制性内切酶活性的因素有：DNA纯度，DNA甲基化程度，反应温度，DNA 的分子结构，缓冲液。
DNA连接酶在体内合成DNA某条链上丢失的磷酸二酯键，体外连接反应中，DNA连接酶则需要合成两个磷酸二酯键。
T4-DNA连接酶不需要PEG等就能进行平端的连接，所以实验中绝大多数情况下使用T4-DNA连接酶。
影响DNA连接的因素有：温度、时间、酶量、缓冲体系、DNA末端的性质及浓度、DNA片段的大小等。
重组DNA的转化与筛选
第四章重组DNA的转化与筛选载体与目的基因连接后，体系中可能存在下列分子：a. 未连接的载体分子b. 未连接的DNA片段c. 载体的自连d. 含有错误插入片段的重组DNA分子e. 重组DNA分子转化过程中，这些分子同时被转移到宿主细胞内。
未连接的分子即使被细菌摄取，只有在特殊的条件下才能复制，寄主的酶可降解这些DNA片段。
自连的载体和错误插入的重组质粒可以进入宿主细胞进行正常的复制。
因此，需要将重组克隆鉴定出来。
第一节细菌的转化方法自然界中，转化并不是细菌或的遗传信息的主要方式，实验室中只有小部分的细菌可以很容易的转化，进一步的研究发现，这类细菌含有DNA结合和吸收的代谢机制。
正常条件下，大部分细菌包括大肠杆菌，只能吸收有限的DNA，为了提高转化效率，建立了一系列的转化方法：a. 热激法转化感受态细胞b. PEG介导的原生质体转化c. 高压电穿孔法转化d. 显微注射法转化e. 接合转化f. 噬菌体转染表4—1 大肠杆菌常用转化方法的比较图4-1 热激法转化感受态的过程一、受体细胞应具备的条件a. 限制性缺陷型RecB-，RecC-，hsdR-（外切、内切酶）b. 重组整合缺陷型RecA-（对于用于基因扩增或基因高效表达的受体）c. 具有较高的转化效率d. 具有与重组体互补的遗传性状e. 感染与寄生缺陷型安全角度的要求。
二、大肠杆菌感受态的制备与转化转化的突破发生在1970s的早期，研究发现，在冷的盐溶液中转化的效率提高。
一般利用50mM的CaCl2，其他的盐如氯化铷也有较高的效率。
经过处理的细胞称为感受态细胞。
感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
目前，机理尚不清楚，可能是CaCl2导致DNA分子沉淀到细菌细胞的外壁上，或者CaCl2与提高细菌结合的变化有关。
重组子的转化和筛选转化
实验九重组子的转化和筛选一. 概念1．transformation特指以质粒DNA或以它作为载体构建的重组子导入细菌的过程。
2．transfection指噬菌体、病毒或以它们作为载体构建的重组子导入细胞的过程。
3．感受态与致敏过程细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。
二．转化方法1．化学转化法细菌处于0 ℃，在CaCl2低渗溶液（0.1M）中，菌体细胞膨胀成球形，DNA 则与CaCl2形成抗Dnase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，重组子的基因在被转化的细菌中得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
2．电转化法取对数生长期细胞，制备一定浓度的细胞悬液（在低离子浓度状态以10％甘油制备），4℃条件下，以高压脉冲电击细胞，使细胞摄取外源DNA，电转化法不需制备感受态细菌，操作简便，适用于各种菌株的转化，其转化率可达109－1010，转化率受电场强度、电脉冲时间长度及DNA的浓度影响。
该法缺点是转化细胞受电场作用后活性受到一定影响。
3．感受态细胞及特点受体细胞处于感受态是转化成功与否的关键之一。
感受态是指细胞处于最适于摄取和容忍外来DNA的生理状态。
感受态细胞特点为：（1）细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）。
（2）细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透性增加，使DNA直接穿过质膜进入细胞）。
（3）受体细胞的修饰酶活性最高，而限制酶活性最低，使转入的DNA分子不易被切除或破坏。
（4）受体细胞本身处于非生长繁殖阶段（即受体细胞染色体相对稳定）。
（5）不存在载体的筛选基因，多采用限制酶阴性、修饰酶阳性的大肠杆菌作为受体细胞。
三．筛选在转化过程中，并非每个宿主细胞都被转化，即使获得转化的细胞，也并非都含目的基因，可能含有自身形成环状的在体分子，一个载体与两个外源DNA 形成的重组子，或插入的非目的基因与载体形成的重组子等。
重组子的筛选与鉴定
一、遗传学检测法
无环丝氨酸培养基
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322 选择过程 （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基
因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法 （2） 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有终止密码子；
（不破坏 肽）。
一、遗传学检测法
(一)载体表型选择法 2. -半乳糖苷酶显色反应选择法
-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。
（只在特定条件下）。 1.原理 （1）弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型
缺陷。
受体菌： his
-
外源基因： his
+
阳性克隆才能在不 含组氨酸的培养基 中生长
一、遗传学检测法
(二)根据插入基因的遗传性状的选择 1.原理
（2）增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例：小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二
优点：简便、快速，结果较可靠。
缺点：基因必须表达并具有合适的受体细胞。 （一） 根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法
1. 抗药性标记插入失活选择法 2. β-半乳糖苷酶显色反应选择法 （二）根据插入序列的表型特征选择重组体分子的直接选择法 转化进来的外源DNA编码的基因，能够对大肠杆菌寄主菌株所 具有的突变体发生体内抑制或互补效应，从而使被转化的寄主细胞表 现出外源基因编码的表型特征。
实验8重组质粒的转化及筛选
实验8重组质粒的转化及筛选实验⼋、重组质粒的转化及筛选转化（transformation）：是将异源DNA分⼦引⼊受体细胞，使其获得新的遗传性状的⼀种技术⽅法。
进⼊细胞的DNA分⼦通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
热激转化将⼤肠杆菌感受态细胞与待转化的DNA样品⼩⼼混合均匀，置于冰上约10min，使DNA充分粘附于细胞表⾯，经42℃短时间热激处理，促进细胞吸收DNA样品。
将已转化处理的细胞置于⽆选择压⼒的培养基中保温⼀段时间，然后涂布于有选择压⼒的平板培养基上，获得重组⼦。
实验材料DNA材料：连接产物、质粒pQE30-EGFP；感受态细胞：⼤肠杆菌DH5α；培养基：LB抗⽣素：AMP（氨苄青霉素），在培养基冷却到60℃以下添加，添加量为1/1000。
已灭菌的EP管操作步骤1.从冰箱取出的感受态细胞放置冰上融化，分别取100µl转移到2⽀已灭菌的1.5ml离⼼管中，分别加⼊质粒1µl、连接产物10µl，温和混匀，冰上放置5~10min；2.热激处理：将EP管置于42℃恒温⽔浴锅中，保温90秒，不要摇动，然后迅速转移到碎冰块中，冷却1~2分钟。
3.往EP管中加⼊500µl新鲜LB培养液（37℃预热），37℃，培养30min~60min（注：转纯质粒可省略，转连接产物需进⾏）。
4.取100~150µL细胞（可离⼼，重悬）涂布于含有抗⽣素的LB平板上，室温放置3~5分钟。
5.37℃培养12~16h（过夜）；然后把培养箱温度调⾄30℃培养3~4h，观看EGFP基因表达情况。
转化实验流程感受态细菌100µl 质粒1 µl冰浴中10′混匀420C⽔浴90′冰浴1-2 ′加⼊500 l LB370C培养30′涂板培养过夜勿动热激＋⽤CaCl法制备的感受态细胞，可使每微克超2螺旋质粒DNA产⽣5 106-2 107个转化菌落。
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（三）试剂 ❖ 1. LB固体培养基 ❖ 2. 氨苄青霉素（Amp） 100mg/ml
实验步骤
转化: ❖ 1．取适量连接产物加到分装的200 μL感受态
细胞中，冰上混匀，冰浴30min；此过程中， 需倒含氨苄的LB平板。 ❖ 2．42℃热激90s，迅速在冰浴中冷3-5min； ❖ 3．上述管中加入600μL LB培养基，于37℃振 荡培养45min；此过程中，在LB平板上涂布XGal 40 μL和IPTG 20 μL 。
❖ 转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙 磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃短时间热 击处理，促进细胞吸收DNA复合物。进入细胞 的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的 转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
❖ 将经转化后的细胞在选择性培养基中培养，即 可筛选出转化体(transformant)，即带有异源 DNA分子的受体细胞。
实验六 转化及重组子的筛选
1.实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果与讨论
实验目的
❖ 了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究 中的意义；
❖ 学习外源DNA转化入受体菌细胞并筛选转化 子的方法。
实验原理
❖ 转化（transformation）是将异源DNA分子导 入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传 性状的一种手段。其原理是细菌处于0℃， CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。
❖ 4．取适量菌液涂布LB平板(含Amp 50μg/ml)， 室温涂布均匀后（至菌液完全被吸干），于 37℃倒置，过夜培养；
❖ 5．观察菌落，筛选阳性克隆。
实验结果与讨论
❖ 经抗生素初筛长出的细菌常出现假阳性的现 象，为确定外源基因已转化入细菌，需另外 的酶切和PCR验证。
基因导入方法:
1)电击法 (Gene transfer by electroporation)
基因导入方法:
2)基因枪法(Biolisticbombardment)(植物细胞)
Transfer of T-DNA from Agrobacterium into a plant cell
Regeneration of leaf disks infected by Agrobacterium
DNA重组
❖ 外源基因插入与否可通过载体上的Lac Z基因 进行初步的筛选。有外源基因插入的细菌呈 白斑，无外源基因插入的细菌呈蓝斑。
Alfa互补
实验仪器、材料与试剂
（一）仪器 ❖ 1. 恒温摇床 ❖ 2. 超净工作台 ❖ 3. 恒温水浴锅 ❖ 4. 恒温箱 ❖ 5. 微量取液器
（二）材料 ❖ 1. ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ验四所得连接产物 ❖ 2. 实验五制备的大肠杆菌感受态细胞