转化子的筛选与重组子的鉴定

将外源DNA片段 插入BamH I、Sal I位点
非重组子：Apr、Tcr 重组子：Aps、Tcs
Sal I
pBR322
4363 bp
ROI ROP Hind II Bal I
ori
基本操作：
将转化液涂布含Ap的平板
Ap
再将Ap平板上的转化子影印 至含有Ap和Tc的平板上
挑 选 影 印
在 Ap 平 板 上 生 长 、 但 在 Ap+Tc平板上不长的转化子 为重组子
Ap+Tc
营养缺陷性筛选法
基本原理：
营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组 子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因， 而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养 组份的培养基上，长出的便是转化子 。
基本原理图示：
Lys−
Lys+
Lys−
HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI
EcoRI lacZ’
或者： 1.0 kb + 5.7 kb
用PstI酶切转化子质粒DNA 目的重组子： 3.2 kb + 3.5 kb 或者： 0.8 kb + 5.9 kb
pUC18 2.7 kb Apr ori
区分目的重组子与非目的重组子
DNA链聚合反应时的定点随机中断（ddNTP） 聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率（600 bp / 601 bp） 电脑自动检测、记录、编辑程序
用于DNA测序的专一性试剂盒（Kit）
双脱氧末端终止测序法的基本操作：
聚丙烯酰胺凝胶电
泳
ssDNA ssDNA ssDNA ssDNA
A C G T
Prime
LOGO
转化子的筛选与重组子的鉴定
www.themegallery.com
为什么要进行转化子的筛选和重组 子的鉴定？
在DNA体外重组实验中，外源DNA片段与载体DNA的连接反应物 一般不经分离直接用于转化，再加上重组率和转化率的不理想，因此 必须通过筛选和鉴定来区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、 期望重组子与非期望重组子。
全酶解图谱法
1.0 kb B 区分重组子与非重组子 4.0 kb E 0.8 kb P B
电泳观察酶解产物片段
重组子： 2.7 kb + 4.0 kb
HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI
EcoRI lacZ’
非重组子： 2.7 kb 如果外源DNA片段也是2.7 kb，最好 选用单一切口的酶将质粒线型化，然
基于载体遗传标记的筛选与鉴定
利用载体DNA分子上所携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或 重组子
基于克隆片段序列的筛选与鉴定
由于基于载体遗传的筛选与鉴定程序不能区分期望重组子与非期 望重组子。在大多数情况下，待克隆的目的基因或DNA片段的序列至 少部分是已知的，因此根据克隆片段序列设计的筛选与鉴定程序具有 广泛的实用性
PstI EcoRI BamHI
0.6 0.8 B B B
1.8 kb E
2.2 kb
是连在一起的
DNA序列测定法
DNA序列测定是精确鉴定目的基因的重要手段，目前国际上流行采
用Sanger发明的双脱氧末端终止法测定DNA序列，其工作原理是在DNA
聚合反应的进程中，通过位点特异性终止测定。
DNA序列其关键技术有：
探针标记方法：
1、5＇端标记法。 2、反转录标记法。 3、缺刻前移标记。 4、ABC标记法。
5＇端标记法
P P P P
T4-PNP酶
DTT、Mg2+、 [γ-32P]dATP、过量ADP
碱性磷酸酶
P P
T4-PNP酶
P P
变性制备单链探针 方法1 方法2
缺刻前移标记法
5＇ 5＇
DNase I
5＇ 5＇
A C G T
Klenow
T T TT
dNTP + ddATP
T T
5' P
OH 3'
基于外源基因表达产物的筛选与 鉴定
蛋白质生物功能检测法
放射免疫原位检测法
蛋白凝胶电泳检测法
蛋白质生物功能检测法
某些外源基因编码具有特殊生物功能的酶类或活性蛋 白（如α -淀粉酶、葡聚糖内切酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白 酶、抗生素抗性蛋白等），设计简单灵敏的平板模型，可 以迅速筛选出克隆了上述蛋白编码基因的期望重组子。
2.0 kb BE E
2.0 kb B
对图示的克隆片段，转化子 质粒DNA用EcoRI酶切开后， 只出现2.0 kb和2.7 kb两条带 子，实际上2.0 kb的条带中含 有两种不同的分子 4.0 kb
HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI
EcoRI lacZ’
Apr pUC18 2.7 kb ori
4.0 kb
HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI
EcoRI lacZ’
区分目的重组子与非目的重组子
1.0 kb B E
0.8 kb P B
用EcoRI酶切转化子质粒DNA
目的重组子： 3.0 kb + 3.7 kb 4.0 kb
pUC18
2.7 kb 2.0 kb
Apr
2.7 kb
ori
部分酶解图谱法
1.2 E 该重组质粒经酶解后，分别得到下列几组数据： BamHI全酶解：0.6 0.8 1.8 3.4 kb BamHI+EcoRI全酶解：0.6 0.8 1.8 1.2 2.2 kb 其中，1.2 kb片段的存在表明该片段位于一端 BamHI部分酶解：1.4 2.6 4.0 kb 其中，1.4 kb的片段必为0.6 kb和0.8 kb两片段，表 明两者是连在一起的；同理，2.6 kb的片段必为0.8 kb和1.8 kb两片段，表明两者是连在一起的；最后， 4.0 kb的片段必为0.6 kb和3.4 kb两片段，表明两者 4.4 kb
重组子
利用淀粉酶基因表达产物检测重组子
放射免疫原位检测法
基本原理及操作程序与菌落原位杂交 法非常相似，只不过后者是用核酸探针通 过碱基互补的形式特异性杂交目的DNA序 列，而前者利用抗体通过特异性免疫反应 搜寻目标蛋白质。因此使用放射免疫原位 检测法筛选鉴定期望重组子的前提条件是 外源基因在受体细胞中必须表达出具有正 确空间构象的蛋白产物，同时具备与之对 应的特异性抗体。
Prime
Prime
Prime
Klenow r
dNTPs ddATP
Klenow r
dNTPs ddCTP
Klenow r
dNTPs dHale Waihona Puke BaiduGTP
Klenow r
dNTPs ddTTP
A
C
G
T
DNA聚合反应
双脱氧末端终止测序法的基本反应：
GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA
5' P
OH 3'
基于外源基因表达产物的筛选与鉴定
如果克隆在受体细胞中的外源基因编码产物是蛋白质，则可通过 检测这种蛋白质的生物功能或结构来筛选和鉴定期望重组子
基于载体遗传标记的筛选与鉴定
抗药性筛选法
营养缺陷性筛选法
显色模板筛选法
噬菌斑筛选法
抗药性筛选法
可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。
EcoR I Cla I Hind III Pst I BamH I Pvu I Pst I Ap r Tcr
原位杂交的操作程序
探针的制备
探针的长度以及与目的基因之间的序列同源性是杂交实验成败的关键
最佳的探针长度范围为100~1000bp
探针内部不能含有大面积的互补序列，会直接影响探针与DNA靶序列的杂交。
探针的获取方法：
1、目的基因的同源序列 2、cDNA 3、人工合成
探针的标记
探针在杂交后是通过其分子中的放射性同位素或荧光基团进行定位 示踪的，放射性的强弱直接关系到杂交反应的灵敏度。 单位长度探针标记的同位素越多，杂交反应灵敏度就越高。
pUC18 2.7 kb Apr ori
后通过其长度来鉴定其是否为重组子
区分重组子与非重组子
1.0 kb S B
0.8 kb P S
如果外源DNA片段插pUC18 的SphI位点处，原则上也可 用SphI酶解鉴定，但这样做 很不经济，因为SphI非常昂 贵（每100单位50美元）。用 HindIII和EcoRI联合酶解同样 可以达到目的，但这两种酶 的价格只及SphI的1 / 50
DNA聚合酶I
5＇ 5＇
dNTP、[α
5＇
-32P]dATP
5＇
变性
5＇ 5＇
限制性酶切图谱法
所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源 DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已
知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非
重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于 数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高 。
Lys+
常见的营养缺陷型筛选标记：
用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+ 用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk， 相应的受体细胞则选择tk-缺陷型 哺乳动物细胞中存在两条dTTP的合成途径：
AP AP 氨基喋呤
dCDP
TK
dTDP
dTTP
TK 胸腺嘧啶核苷激酶
TR
dTMP
dTDP
dTTP
显色模型筛选法
基本原理：
显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非 重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物 能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒 pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的 melC基因（黑色反应）等。
2.插入型载体
噬菌斑中的λ 噬菌体即为重组子。
根据载体上的标记基因筛选。（如：lacZ′）
重组子
非重组子
基于克隆片段序列的筛选与鉴定
PCR鉴定法 菌落原位杂交法
限制性酶切图谱法 亚克隆法
DNA序列测定法
PCR鉴定法
PCR技术的两大主要用途为目的基因的获得和DNA 特定序列的检测。根据引物互补区域的不同，PCR 技术即可用于区分重组子与非重组子，也能鉴定 期望重组子与非期望重组子，甚至还能探测目的 基因或DNA片段是否整合在受体细胞的基因组上。 上述PCR鉴定程序一般需要将筛选平板上的单菌落 分别挑出进一步培养，因此不太适用于成千上万 个转化子的鉴定。
显色筛选法的基本操作：
lacZ'
将 外 源 基 因 克 隆 在 pUC18 的 lacZ’标记基因内部，使之灭活 ，此时重组子呈Apr 、lacZ- ，淡 黄色菌落；而非重组子则呈Apr
Ap + X-gal
ori
pUC18
Apr
、lacZ+，蓝色菌落
重组子（Apr + lacZ-）
噬菌斑筛选法
1.取代型载体
蛋白凝胶电泳检测法
对于那些生物功能难以检测的外源基因编码 产物，手头又没有现成的抗体做蛋白免疫原位分 析实验，可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对重组克 隆进行筛选鉴定。
表达产物
非重组子
重组子
转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。 非转化子：为接纳载体或重组分子的非转化细胞。 重组子：含有重组DNA分子的转化子。 非重组子：仅含有空载载体分子的转化子。 期望重组子：含有目的基因的重组子。 非期望重组子：不含目的基因的重组子。
三者的关系
期望重组子
重组子
转化子
转化子的筛选与重组子的鉴定方法
工作原理：
受体基因组
转化子
重组子
非期望 重组子
期望重 组子
转化子 期望重组子
非整合子
整合子
菌落原位杂交法
菌落原位杂交法（又称探针原位杂交法）能从成 千上万个转化子中迅速检测出期望重组子，其前 提条件是必须拥有与目的基因某一区域同源的探 针序列。根据核酸杂交原理，探针序列特异性的 杂交目的基因，并通过放射性同位素或荧光基团 进行定位检测。