HepG2细胞培养方法

RT-PCR
材料：逆转录试剂盒（TAKARA DRR047A）、PCR试剂盒（TAKARA DRR081A）
PCR水（灭菌蒸馏水）、去RNA酶的200ul离心管、PCR 8连管、计时器、水浴箱
逆转录反应体系为20ul
（1）基因组DNA的除去反应。
5*g DNA Eraser Buffer 2ul
g DNA Eraser 1ul
3．不同浓度软脂酸处理细胞24hrs。（每组三个复孔）
（1）对照组：用1mlPBS清洗后，每孔1ml BSA继续培养。
（2）0.02mmol/L palmitate: 1.2ul软脂酸储存液+2998.8ul BSA,每孔1ml。
（3）0.04mmol/L palmitate: 2.4ul软脂酸储存液+2997.6ul BSA,每孔1ml。
3．加入3ml终止液，吹打细胞使其脱落并单个化，再移至罗口离心管。
4．离心5min,800rpm，弃上清。
5．罗口离心管加入完全培养基，混匀后分瓶培养。
6．细胞隔日可以用PBS清洗后更换培养基。
细胞冻存：
材料：RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、PBS、PS、35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、消毒的冻存管、水浴箱、计时器、离心机、过滤器、光学显微镜
RNA浓度的标化：
吸取4ul RNA+196ul DEPC水稀释50倍在分光光度计上测算样品的浓度，记好A260、Con(ug/ml)和A260/A280，原始浓度为测量浓度*50（A260和Con换算为Con:A260=40, A260/A280为1.6-2.0，线性范围最好），标化的方法是以最低浓度的一个样品为标准进行标化，标化10ulRNA,计算各个样品加DEPC水量，做RT时RNA加样量为X（0.5ug/原始浓度*1000）ul。
2．从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速置37℃水浴1min至融化。
3．打开冻存管，吸取细胞悬液至离心管，轻轻混匀。
4．800rpm离心5min,弃上清。
5．细胞沉淀中加入4ml完全培养基，转入35cm培养瓶37℃常规培养，第二天观察细胞生长情况。
细胞传代与换液：
材料：RPMI-1640、小牛血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS、PS、
37℃15min→→85℃5sec（PCR仪反应，约16min，迅速转入－20℃保存）
PCR反应体系为25ul
SYBR Premix EX TaqⅡ12.5ul
上游引物0.25ul
下游引物0.25ul
PCR水10ul
c DNA 2ul
*无论做RT还是PCR应先将按样品数计算每种试剂加入量，配在一管里面混匀后加入每个反应管里面，再加各个管的RNA或c DNA,为了保证每管加量完全，可以多配1-2样品的试剂量，混匀加入每管。
35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜
试剂配制：
100ml终止液：90mlRPMI-1640 + 10ml小牛血清+1支PS，4℃保存
步骤：
1．对数增长期汇合度80%-90%的细胞可以传代，4ml PBS清洗两次。
2．加入0.25%胰酶1ml,37℃孵育5min。
（4）0.08mmol/L palmitate: 4.8ul软脂酸储存液+2995.2ul BSA,每孔1ml。
（5）0.16mmol/L palmitate: 9.6ul软脂酸储存液+2990.4ul BSA,每孔1ml。
（6）0.32mmol/L palmitate: 19.2ul软脂酸储存液+2980.8ul BSA,每孔1ml。
试剂的配制：
10ml冻存液：7ml完全培养基+2ml胎牛血清+1ml DMSO,混匀后过滤，4℃保存
步骤：
1．去除培养瓶中旧的培养基，加入4ml PBS清洗两次。
2．混匀胰酶，每瓶加入1ml,37℃孵育5min。
3．每瓶加入3ml终止液，反复抽打细胞使其脱落并单个化，移至罗口离心管。
4．800rpm离心5min,弃上清。
4．新购买的异丙醇分装于DEPC处理的50ml离心管，4℃保存
步骤：
1.吸出培养基，PBS清洗一次；
2.向100ml培养瓶（6孔板中2孔）加入1ml RNAiso Reagent，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落（约30次）；将裂解液转移至1.5ml EP管，移液器反复吹打（推荐用5ml注射器抽打10次）；
3.室温静置5min后加入氯仿200ul（RNAiso Reagent：氯仿＝1ml:200ul），用力震荡后，室温静置5min，待分层后离心，12000g，4℃，15min；
4.取80％无色上清液至另一干净1.5ml EP管（切忌吸出白色中间层），加入400ul异丙醇（异丙醇应与上清体积比为1:1），充分混匀后，静置10min；
4．不同浓度TNF-a处理细胞24hrs。（每组三个复孔）
（7）对照组：每孔1ml BSA继续培养。
（8）5ng/ml TNF-a: 1.5ul TNF-a储存液+2998.5ul BSA,每孔1ml。
（9）10ng/ml TNF-a: 3ul TNF-a储存液+2997ul BSA,每孔1ml。
（10）20ng/ml TNF-a: 6ul TNF-a储存液+2994ul BSA,每孔1ml。
试剂配制：
1．BSA培养液：
储存液：称取1g BSA溶于10ml RPMI-1640，混匀后过滤，4℃保存
工作液：一瓶RPMI-1640加入2mlBSA储存液和一支PS,即浓度为0.2%，4℃保存
2．软脂酸储存液：称取13.92mg软脂酸（分子量278.41）溶于1ml甲醇，即浓度为0.05mmol/ml，37℃水浴助溶，分为5份分装于EP管，-20℃保存
HepG2细胞培养方法
细胞复苏：
材料：HepG2细胞、RPMI-1640、胎牛血清、PS（青霉素+链霉素）
35cm细胞培养瓶、消毒的罗口离心管、消毒的吸管、水浴箱、计时器、离心机、光学显微镜
试剂配制：
100ml完全培养基：90mlRPMI-1640 + 10ml胎牛血清+1支PS，4℃保存
步骤：
1．罗口离心管加入含10%胎牛血清的完全培养基3ml.。
3．TNF-a储存液：称取10ngTNF-a溶解于1mlPBS,及浓度为10ng/ml，分为10份分装于EP管，-20℃保存
ห้องสมุดไป่ตู้步骤：
1．低倍显微镜观察六孔板里细胞状态，保证无污染，无杂质，汇合度为70%-80%的细胞才可以进行下一步实验。
2．六孔板里的细胞加入1mlPBS清洗，每孔加入1ml 0.2% BSA的RPMI-1640，继续无血清培养24hrs。
RNase Free dH2O (10-2-1-X)ul
Total RNA Xul
42℃2min水浴，4℃保存
（2）反转录反应。
5*PrimeScript Buffer2 4ul
PrimerScript RT Enzyme MIX 1 1ul
RT Primer MIX 4 1ul
RNase Free d H2O 4ul
（11）40ng/ml TNF-a: 12ul TNF-a储存液+2988ul BSA,每孔1ml。
Trizol法提取细胞总RNA流程
材料：
1. RNAiso Reagent:购于Taraka（货号：D312），100ml
2.氯仿、异丙醇、无水乙醇：国产分析纯
3. 0.1%DEPC-H2O、PBS、75%乙醇
5. 12000g，4℃，离心10min，此时管底可见沉淀；
6.小心弃上清液，缓慢沿管壁加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒使沉淀飘起，12000g，
4℃，离心5min，小心弃乙醇，可离心数秒后将残液吸走；
7.室温静置2-5min，干燥RNA；
8.加入DEPC-H2O 30或40ul溶解RNA，-80℃保存。
4. DEPC处理的EP管、滴头、50ml离心管，5ml注射器、计算器、低温离心机、冰盒
材料的去RNA酶化：
1．0.1%DEPC水配好的DEPC水过夜灭活，高压蒸汽灭菌，
2．EP管、滴头、离心管用0.1%DEPC水浸泡过夜，高压蒸汽灭菌，
3．75%乙醇：75ml无水乙醇+25ml 0.1%DEPC水。
*考虑到做PCR时检测具体基因数不同，反应体系可以以倍数的改变，如P两个基因，RT时可以做6ul体系，即每个试剂加入量均*0.3，混匀后加入每管。
*加入RT后cDNA2ul,注意加样量一致，改好盖子，在盖子一端的边缘做好标记，弹去反应液里面的空气，离心。
步骤：
1．将汇合度为80%-90%的HepG2细胞加入4ml PBS清洗两次。
2．加入1ml已混匀好的胰酶消化，37℃孵育5min。
3．培养瓶中加入终止液3ml，反复吹打使其脱落并单个化，细胞悬液转移至罗口。
4．800rpm离心5min,弃上清。
5．加入6.5ml完全培养基，充分混匀细胞，取15ul细胞悬液进行细胞计数，要求六孔板约5*106 -1*106 /孔。
6．将6ml细胞悬液转入六孔板，每孔1ml,轻轻摇匀悬液，使其均匀完全覆盖，37℃继续培养。
软脂酸和炎症因子处理HepG2细胞：
材料：RPMI-1640、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、甲醇、PBS、PS、
软脂酸(SIGMA P9767)、TNF-a、BSA
消毒的罗口离心管、消毒的吸管和EP管、过滤器、光学显微镜、测量计、过滤器
5．每管加入1ml冻存液，混匀细胞，移至冻存管中。将细胞冻存管放于-20℃保存2hrs。