脉冲场电泳系统Rotaphor60(中文资料).

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BIO-RAD脉冲场电泳介绍

﹡此后,随着PFGE技术的不断改进,现已具有分辨出高达10Mb级 DNA的能力。
﹡这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生物基因组结构的研究。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
PFGE的原理
PFGE的基本原理是对琼脂糖凝胶外加交变的脉冲电场,其方向、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改变时,大分子DNA 便滞留在凝胶孔内,直至沿新的电场轴重新定向后,才能继续向前泳动,DNA分子越大,这种重新定向需要的时间就越长,当DNA分子改变方向的时间小于脉冲时间时,DNA就可以按照其分子量大小分开, 经EB染色后在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。
一、PFGE在分子分型方面的应用通过微生物分型可以鉴定菌株是否一致、比较它们的亲缘
关系,对于细菌性传染病的监测、传染源追踪、传播途径的调查和识别有着非常重要的意义。
传统的微生物分型技术主要是基于表型特性分类,如生化分型(biotyping)、血清学分型(serotyping)、耐药谱测定(antmi icrobial susceptibility testing)、噬菌体分型(bacterialphage typing) 等。由于微生物易受环境的影响,很容易改变其表达性状,使得表型分类很不准确。
CHEF-DR III
脉冲场电泳系统的配件
脉冲场电泳（PFGE）的实验流程
Cultured Cells
Unicellular Organisms
Harvest Cells
Tissues
Dissociate
Wash Cell Suspension
Determine Cell Concentration Resuspend to needed Concentration

脉冲场凝胶电泳技术资料

注意事项：
（1）用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。
（2）细胞悬浊液、蛋白酶K要置于冰上。
（3）在混合细胞悬浊液和1% Seakem Gold：
1%SDS时要避免气泡的产生。
（4）混合物加入模具时不能产生气泡。（5）在加1% Seakem Gold：1%SDS的过程中 1% Seakem Gold：1%SDS要一直放在56℃水浴箱中。
蛋白酶K（储存液浓度为20mg/ml）混匀，使其终浓
度为0.5mg/ml。
7、制备好1%Seakem Gold：1%SDS，放于56℃
水浴箱中。
8、在eppendorf管中加入400µl的1% Seakem Gold：1%SDS，用枪头轻轻混匀。 9、将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。

3、在每个1.5ml eppendorf管中加入200µl缓冲液H 的稀释液。 4、小心从TE中取出胶块放在干净的培养皿上。 5、用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5ml eppendorf 管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原
来的TE中。
6、用同样的方法处理标准株H9812的胶块。

四、胶块内DNA的酶切 1、在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及 H9812的名称。 2、按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液，混匀。试剂 µl/胶块 µl /10胶块纯水 180µl 1800µl Buffer D 20µl 200µl 总体积 200µl 2000µl 注意：缓冲液要置于冰上。

这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生物基因组结构的研究。
PFGE的原理
PFGE的基本原理是对琼脂糖凝胶外加交变的脉冲电场, 其方向、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改变时,大分子DNA便滞留在凝胶孔内,直至沿新的电场轴重新定向后,才能继续向前泳动,DNA分子越大,这种重新定向需要的时间就越长,当DNA分子改变方向的时间小于脉冲时间时,DNA就可以按照其分子量大小分开,经EB染色后在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。

电泳仪器操作PPT课件

干。 • 8、在分离胶表面注入浓缩胶，注入高度距凹板下沿2-3mm或与之平
齐。 • 9、向凝胶内插入相应的加样梳。 • 特别注意在灌胶时无论是灌分离胶或是浓缩胶，在凝胶没有聚合时不
要移动制胶器，以确保凝胶表面的平整，保证最终的电泳效果。 • 10、当凝胶聚合后，取出梳子，打开搭钩，从制胶器中取出内芯，放
⑤在没有经验的情况下，最好设置定时，否则由于疏忽样品就可能跑出胶外。
⑥缓冲液问题。样品必须完全溶解于上样缓冲液中（TE），否则不能
在凝胶中移动；制胶和实际电泳采用同种缓冲液（TAE）；缓冲液加到
凝胶上之后才能点样。
电泳仪器操作
垂直电泳整个操作过程
制胶—灌胶（不连续电泳：灌分离胶—加蒸馏水—灌浓缩胶）—插入试样格—加缓冲液（上、下两部分）—拔掉试样格—加样品—盖上盖子，接通电泳仪电源—染色—脱色。
电泳仪器操作
电泳槽种类ຫໍສະໝຸດ 水平电泳槽电泳仪器操作
电泳槽种类
垂直电泳槽
电泳仪器操作
电泳槽种类
• 柱状电泳槽
电泳仪器操作
2、水平板电泳槽主要结构
主要由装有铂丝电极和缓冲液的主槽、凝胶托盘、试样格（梳子）、挡板与电泳导线组成。
3、水平板电泳槽（DYCP-33A型）使用方法
①先把凝胶托盘放在平台上，把挡板插入槽中。将融化的琼脂糖溶液冷至 55 ℃ ，用少量琼脂糖凝胶将玻璃板封边，放置样品梳。接着将融化的琼脂糖凝胶溶液不间断地倒在模子中（厚度依样品浓度而定，须注意避免气泡混入） , 室温下自然凝固。
电泳仪器操作
②待凝胶聚合后，轻轻拔掉挡板和梳子。注意先拔一侧，垂直拔出会使胶孔产生真空，导致部分凝胶被带出。把凝胶托盘移入电泳槽，加入缓冲液，使凝胶全部被浸没。（注意：加样孔靠近负极一端）

脉冲场凝胶电泳.

脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。

此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。

脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。

这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。

反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。

在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。

通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。

FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。

【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。

2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。

3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。

5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。

6RNase(10mg/mL。

7 胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品。

8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。

90.5μg/mL 溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。

弗劳地枸橼酸杆菌中质粒介导的KPC-2和NDM-1型碳青霉烯酶基因结构分析

弗劳地枸橼酸杆菌中质粒介导的KPC-2和NDM-1型碳青霉烯酶基因结构分析林迪;方颍;张嵘;陈功祥【摘要】目的对携带blaNDM-1和blaKPC-2的弗劳地枸橼酸杆菌的碳青霉烯酶基因结构进行分析.方法收集4株耐碳青霉烯类药物弗劳地枸橼酸杆菌(CF-05、CF-17、CF-35、CF-43),琼脂稀释法测定抗菌药物敏感性;脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析细菌同源性;特异性PCR扩增和序列测定分析碳青霉烯酶耐药基因和ESBLs耐药基因、接合试验、耐药基因周围序列分析对菌株的耐药机制进行分子水平研究.结果 4株细菌仅CF-05对阿米卡星敏感,所有菌株对其他检测药物全部耐药;PFGE 结果显示4株细菌不同源;特异性PCR扩增和序列分析显示2株(CF-35、CF-43)同时携带blaNDM-1和blaKPC-2、另2株(CF-05、CF-17)仅携带blaNDM-1,CF-35同时携带blaCTX-M-15;其中3株细菌(CF-05、CF-17、CF-43)接合成功,CF-05、CF-17接合子(CF-05-1和CF-17-1)携带blaNDM-1,CF-43获得2种接合子(CF-43-1携带blaKPC-2、CF-43-2同时携带blaNDM-1和blaKP-2);分析blaNDM-1和blaKPC-2周围序列发现,4株细菌周围序列分别与国内报道携带blaNDM-1和blaKPC-2的肺炎克雷伯菌质粒pNDM-HN380和PK048周围序列高度相似.结论在4株弗劳地枸橼酸杆菌中检测到NDM-1型碳青霉烯酶,其中2株同时携带KPC-2型碳青霉烯酶,blaNDM-1周围序列和blaKPC-2周围序列与国内已知肺炎克雷伯菌相关耐药基因周围序列高度相似.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2016(034)006【总页数】5页(P423-427)【关键词】弗劳地枸橼酸杆菌;碳青霉烯酶;NDM-1;KPC-2【作者】林迪;方颍;张嵘;陈功祥【作者单位】浙江大学医学院附属第二医院检验科,杭州310003;解放军第117医院检验科,杭州310013;浙江工业大学药学院,杭州310014;浙江大学医学院附属第二医院检验科,杭州310003;浙江大学医学院附属第二医院检验科,杭州310003【正文语种】中文【中图分类】R446.5随着碳青霉烯类药物的广泛应用和新型碳青霉烯酶的流行和传播，耐碳青霉烯类药物肠杆菌科细菌不断涌现，给临床抗感染治疗和院内感染控制带来极大挑战。

脉冲场凝胶电泳实验流程

脉冲场凝胶电泳实验流程一、准备样品1. 琼脂糖包埋的样品常用的DNA提取方法不能得到完整的大分子量DNA。

大分子量DNA很脆弱，在制备过程中容易因移液等操作造成机械剪切。

将完整细胞包埋入琼脂糖后再进行裂解，去除蛋白的操作，可防止大分子量DNA的断裂。

琼脂糖块包埋的DNA可以避免被机械剪切，并且是一种简单的操作方法。

处理过的包埋有DNA的琼脂糖块可以直接放入琼脂糖凝胶的点样孔。

在将细胞包埋入琼脂糖之前要先确定细胞浓度，尽管吸光度很常用，但是并不可靠。

单位吸光度对应的细胞浓度会因菌株不同或培养基不同而有差异。

这会影响琼脂糖块中DNA的含量，导致上样量过大或不足。

不论细菌、真菌还是哺乳动物细胞，使用血球计数板均可得到准确和高重复性的细胞浓度。

Bio-Rad提供一次性的样品模具（货号：170-3713）。

每个模具可制备50个10 x 5 x 1.5 mm的琼脂糖胶块。

样品制备过程中的酶可以快速有效的扩散进入胶块，用Bio-Rad标准梳子制胶，胶块不需要修剪就可直接放入点样孔。

2. 液体样品小于200kb的DNA片断可以不用琼脂糖包埋，可直接以液体形式加入点样孔。

当操作的DNA大于50kb时，必须用大开口的吸头。

如果只电泳液体样品，使用厚度0.75 mm的梳子可以获得更锐利的条带和更高的分辨率。

3. 制备琼脂糖包埋的哺乳动物DNA该方法中用到的缓冲液，酶和琼脂糖均包含于试剂盒CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit （货号：170-3591）。

1)将细胞悬浮于等渗盐溶液或不含血清的培养基中并置于冰上。

用血球计数板对细胞计数，每毫升琼脂糖块需要5 x 107个细胞，每个10 x 5 x 1.5 mm的样品块需要0.1 mL琼脂糖。

2)准备2% CleanCut™琼脂糖（货号：170-3594），用微波炉融化并置于50 °C水浴。

3)1000g、4 °C离心细胞悬液5分钟，用琼脂糖块一半体积的细胞悬浮缓冲液（10 mM Tris, pH 7.2,20 mM NaCl, 50 mM EDTA）重悬细胞并置于50 °C水浴。

E6050 MiniBlot

E6050 MiniBlot™蛋白转膜系统E6053 MiniBlot™蛋白转膜转移芯目录目录产品简介--------------------------------------------------------------------------------------------- 1包装清单--------------------------------------------------------------------------------------------- 2保存条件--------------------------------------------------------------------------------------------- 2注意事项--------------------------------------------------------------------------------------------- 2使用说明--------------------------------------------------------------------------------------------- 3日常维护--------------------------------------------------------------------------------------------- 4故障排除--------------------------------------------------------------------------------------------- 5质量保证--------------------------------------------------------------------------------------------- 6附录：本产品各部件材料------------------------------------------------------------------------ 6相关产品--------------------------------------------------------------------------------------------- 6碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology 订货热线：400-1683301或800-8283301 订货e-mail ：******************技术咨询：*****************网址：碧云天网站微信公众号MiniBlot™蛋白转膜系统产品编号产品名称包装 E6050 MiniBlot™蛋白转膜系统 1套 E6053MiniBlot™蛋白转膜转移芯1套产品简介：碧云天的MiniBlot™蛋白转膜系统(MiniBlot™ Electrophorectic Transfer Cell)是新一代的蛋白转膜系统，是实验室最常用、快速便捷的蛋白转膜设备，主要用于把电泳分离后的蛋白质或核酸从聚丙烯酰胺等凝胶中转印至固相载体(如PVDF 膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等)上，常用于Western 、Northern 、EMSA 等检测。

脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。

电泳结果通常是条带图谱。

该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。

通过分型可以鉴定比较菌株是否一致，对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。

一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA分子经凝胶的分子筛作用负极移向正极。

而PFGE采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随着电场的变化而改变。

正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA得以分离。

图l是根据Carle和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1 field gel electrophoresis，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。

A、B代表两个交替开启和关闭的电场。

当A电场开启时，B电场关闭，DNA分子从A电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B电场开启时，DNA分子改变原来的运行方向，随B电场负极向正极移动。

这样，随着电场方向的交替变化DNA分子图1 PGE的原理(OFAGE系统) A、B代表两电场即呈“Z” 字形向前移动。

目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。

如果电场方向改变DNA分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。

这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA分子必须相应地变化移动方向。

可以想象，较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。

肠杆菌科细菌中质粒介导的KPC-2型碳青霉烯酶的检测

虫堡捡堕医堂盘盍型！生！Ｑ旦筮！！鲞筮！Ｑ翅堡！也』！坐丛鲤：堡垫！璺！呈鲤！：！吐！！，盟垒！Ｑ．临床实验诊断研究．肠杆菌科细菌中质粒介导的ＫＰＣ一２型碳青霉烯酶的检测张嵘蔡加昌周宏伟陈功祥【摘要】目的研究重症监护病房（ＩＣＵ）出现的碳青霉烯耐药的黏质沙雷菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌等肠杆菌科细菌的分子流行病学及耐药机制。

方法２００６年４月—２００ｒ７年２月，从我院２个ＩＣＵ病房分离到对碳青霉烯耐药或敏感性降低的２１株黏质沙雷菌、１０株肺炎克雷伯菌和ｌ株大肠埃希菌。

用脉冲场凝胶电泳（ＰＦＧＥ）和肠杆菌基因间重复性一致序列一ＰＣＲ（ＥＲＩＣ—ＰＣＲ）分析这些菌株的分子流行病学。

用接合试验、质粒消除试验、质粒图谱分析、等电聚焦电泳（ＩＥＦ）、特异性ＰＣＲ扩增和序列分析以及外膜蛋白分析等技术研究细菌对碳青霉烯耐药的分子机制。

结果２１株黏质沙雷菌为同一克隆株；１０株肺炎克雷伯菌亲缘关系相近。

亚胺培南和美罗培南对黏质沙雷菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的ＭＩＣ为２～８斗ｇ／ＩＩｌｌ，肺炎克雷伯菌Ｋ１０为１２８和２５６斗ｇ／ｍｌ。

所有菌株接合试验均获得成功，亚胺培南和美罗培南对接合子的ＭＩＣ由原来的≤０．１２５ｏｅ，／ｍｌ上升到１—２∥ｌｎｌ。

ＩＥＦ、ＰＣＲ扩增和序列分析证实黏质沙雷菌产ＫＰＣ－２型碳青霉烯酶［等电点（ｐ１）为６．７］和ｐＩ为６．５的Ｂ内酰胺酶；肺炎克雷伯菌产ＴＥＭ－Ｉ（ｐＩ５．４）、ＫＰＣ－２、ＣＴＸ－Ｍ－１４（ｐ１７．９）和ｐＩ为７．３的Ｂ内酰胺酶；大肠埃希菌产ＫＰＣ－２、ＣＴＸ．Ｍ．１５（ｐＩ９．０）和ｐＩ为７．３的Ｂ内酰胺酶；所有接合子均只产ＫＰｃ－２一种Ｂ内酰胺酶。

所有接合子质粒ＤＮＡ的ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ１１Ｉ和ＢｃｕＩ限制性酶切图谱完全相同。

外膜蛋白的十二烷基磺酸钠．聚丙烯酰胺电泳和基因序列分析发现肺炎克雷伯菌ＫＩＯ由于ＯｍｐＫ３６基因中存在插人序列ＩＳＥｅｐｌ而导致ＯｍｐＫ３６膜孔蛋白的缺失。

电泳

实验步骤 1.安装夹心式垂直板电泳槽 (1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。 (2)将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。 (3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。 (4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。 (5)竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂(糖)。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂(糖)中应避免有气泡。
②溶液的pH值
溶液的pH决定被分离物质的解离程度和质点的带电性质及所带净电荷量。溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大。因此在电泳时，应根据样品性质，选择合适的pH值缓冲液。
③溶液的离子强度
电泳液中的离子增加会使电泳迁移率降低，原因是带电的离子会吸引相反符号的离子聚集在其周围，相成一个与运动粒子符号相反的离子氛（ionic atmosphere），它使该离子向相反的方向运动，从而降低了该粒子的迁移率。
3. 制备凝胶板将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1 cm。用1 mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约3–4 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。约30-60 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。将上、下贮槽的蒸馏水倒去，将混合均匀后的浓缩胶溶液，用细长头的滴管加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方)，距短玻璃上缘0.5 cm处，轻轻加入样品槽模板.在上、下贮槽中加入蒸馏水，但不能超过短玻璃板上缘。静置电泳槽，10 min左右，上胶即可聚合，再放置10-20 min，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5 cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。

垂直电泳系统使用说明书

垂直电垂电泳系系统（V-G GES）
使使用说明明书
版本：1.1 项目#：01110 器仅限实验验室使用 *本仪器
目录
A. 重要说明.................................................................................................................................... 3 A-1. 保修 ....................................................................................................................................... 3 A-2. 技术与服务联络方式 ................................................................................................................ 3 A-3. 安全说明................................................................................................................................. 4 A-3-1. 安全信息 ....................................................................................................................... 4 B．介绍 ............................................................................................................................................... 5 B-1. 技术指标................................................................................................................................. 5 B-1-1. V-GES ........................................................................................................................... 5 B-1-2. 每种凝胶厚度对应上/下凝胶体积 .................................................................................... 6 B-1-3.每种凝胶厚度对应井容积................................................................................................. 6 B-2-1. V-GES 硬件概览 ............................................................................................................. 7 垂直电泳槽安装 .................................................................................................................................... 9 C-1. 装箱单 .................................................................................................................................... 9 C-2. V-GES 安装 ........................................................................................................................... 11 D.操作 ................................................................................................................................................ 11 D-1. 标准操作 .............................................................................................................................. 11

质粒介导的产NDM-1肠杆菌科细菌分子水平研究

基因周围环境分析见图2o其中菌株KO-03、FC05、EC-06和Eo-09的开放阅读框架同已公开序列的 KP 质粒 pNDM-HN380(GenBank 登录号 JX104760.1) 完全一致，基因片段blflNDM- 1-blembl-trpF存在于所有已测序成功的16株菌株中。 3 讨论
两种碳青霉烯酶存在于同一菌株中，在国内外极少出现［16-17］。本研究结果显示,9株菌株携带两种碳青霉烯酶。多种耐药基因的合并存在，给产NDM-1菌株的治疗带来更大挑战。在国内，极少出现同一克隆株的传播流行现象［18-19］。本研究通过PFGE分析发现部分菌株具有同源性,提示需加强院内感控,关注多重耐药菌的传播流行现象。质粒是介导blaNDM-1基因传播转移的主要载体。目前世界上可以携带该基因的质粒有IncX3、A/C、L/M、FI/FII、I1等型别业旳。其中， IncX3型质粒认为是国内介导该基因传播转移的主要载体［22切。本研究对接合子进行PBRT质粒分型发现,59.3%(16/27)的质粒为IncX3型别，提示IncX3型质粒同样是介导本地区blaNDM-1基因转移的主要质粒。
30 CHINA MEDICAL HERALD Vol. 18 No. 16 June 2021
流行。目前认为南亚、欧洲以及中东为NDM最为流行的地区［2］o 2011年浙江省发现首例产NDM-1鲍曼不动杆菌患者［3］,随后NDM便在细菌中蔓延开来［4-8］。 NDM国内虽多有研究，但菌株大多呈分散分布叫关于blflNDM-1基因分子水平研究，目前国内还比较欠缺。本研究拟通过对2015年1月一6月分离的29株产 NDM-1肠杆菌科细菌进行同源性分析，了解其在该
1.5脉冲场凝胶电泳采用脉菌进行同源性分析。具体操作流程和判定标准参考文献［12］。 1.6多位点序列分型

脉冲场电泳

脉冲场凝胶电泳- 高分子量DNA琼脂糖凝胶块制备和加工1．收集10ml全血，加入30ml细胞裂解液。

置冰浴中至少20min直至红细胞完全溶解。

2．2000r/min离心10min，移去红色上清液，再次用细胞裂解液洗涤细胞，然后用PBS重悬细胞。

3．稀释单细胞悬液并取一小份用Neubauer腔计数细胞。

4．用PBS重悬细胞，以达到40μl PBS中含1百万个细胞比例（1百万个二倍体哺乳动物大约含有基因组DNA 10μg）5．用PBS配制2％浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在50℃。

6．将等体积（各1ml）细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀，立即倒入凝胶块模具中。

7．静置20min让琼脂糖固化，用无菌塑料杯（通常用作划菌）将凝胶块自模具中取出并置入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml的蛋白酶K。

8．将带有凝胶块的蛋白酶K缓冲液于50℃保持2～3天。

每个盛有50ml蛋白酶缓冲液的Falcon管可容纳多达100个凝胶块。

9．蛋白酶K消化后，可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4℃。

10．此外，继续将凝胶块用高压消毒过的TE缓冲液冲洗数遍的步骤。

11．将凝胶块放入装有TE及0.04mg/ml PMSF溶液的Falcon试管中，灭活残留的蛋白酶K。

12.室温下用TE溶液漂洗凝胶块数次,将凝胶块放入另一干净的试管，可直接用于酶切反应或用0.5mol/L EDTA，（pH8.0）4℃保存凝胶块。

13．若用EDTA保存凝胶块，取出后应用TE溶液室温下漂洗30 min×2次。

脉冲场凝胶电泳- 大小标准物的制备λ多联体1．以TE缓冲液悬浮λ多联体（Boehringer MA宝灵曼公司产品），浓度为4μg/40μl。

2．用等体积TE配制的2％低熔点琼脂糖（温度保持在45℃）混匀。

3．移去混合液注入预冷的凝胶块模具中。

4．室温下用TE及100 mmol/L NaCl溶液温育2天。

酵母染色体1．从YPD（酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖）培养基瓶皿中挑选单一克隆加入10ml YPD预培养的肉汤中，30℃下剧烈震荡生长24小时，然后加入200ml YPD肉汤，剧烈振荡24～48h（产量大约100块）。

脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶系统操作规范文件编号：VBQW11##-##版本号：A0制定：制定日期：审核：审核日期：批准：批准日期：颁发部门：质量保障中心发行日期：文件更改记录版本号发行日期变更原因、依据及详细变更内容制定人分发部门具体部门目录1. 目的 (4)2. 适用范围 (4)3. 职责 (4)4. 操作规范 (4)4.1 简介 (4)4.1.1. 技术原理 (4)4.1.2 主要仪器设备和试剂 (4)4.2 准备工作 (5)4.3 灌胶 (5)4.4 上样 (6)4.5 主机程序设置 (6)4.6 凝胶染色和观察 (6)4.7 电泳槽清理 (7)5. 注意事项 (8)6. 常见故障及解决方法 (8)7. 关于参数设置的几点建议 (9)8. 试剂配制 (11)1.目的指导技术员规范地使用脉冲场凝胶系统。

2.适用范围本标准适用于利用脉冲场凝胶系统对相关产品进行检测。

3.职责分子部门负责本文件的编写，质量保障部及检验人员负责本标准的监督。

4.操作规范4.1简介4.1.1. 技术原理常规的琼脂糖凝胶电泳采用单一的均匀电场，一定大小的线状DNA分子经凝胶的分子筛作用以一定的速率由负极向正极移动。

但当DNA分子的长度超过一定极限后，其迁移率于则于分子大小无关，而主要是决定于电场强度。

实践表明，长度大于50kb的DNA不能在恒场强的琼脂糖凝胶电泳中较好的分离。

脉冲场凝胶系统(Pulsed field gal electrophoresis, PFGE)正好解决这一问题。

PFGE采用两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，DNA的电泳方向随着电场的变化而改变，大分子的DNA得以分离。

严格来讲，“脉冲”场电泳有些用词不当，应称作“交替”场电泳。

电场变换方向的间隔时间为脉冲时间，其分为从数秒到几小时。

通常脉冲时间越长分辨的DNA片段越长。

图一. 脉冲场电泳交变示意图图一是根据Carle和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1 field gel electrophoresis，OFAGE) 绘制的PFGE示意图。

BIO-RAD脉冲场电泳介绍

– Cluster according to similarity of pattern
Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
PFGE-XbaI
PFGE-XbaI
80 100
.E2003002160 .E2003002977 .E2003002278 .E2003002247 .E2003002231 .E2003002306 .E2003002276 .E2003002366 .E2003002399 .E2003002778 .E2003002827 .E2003002828 .E2003003026 .E2003002033
缺少病原体历史数据、成本高
1.表型和分子分型各有优缺点；对于罕见血清型菌株，表型可发挥重要作用 2.分子分型的方法各有优缺点，各有适用性，联合使用是主流 3.实验方法和结果的质量保证是任何分析网络的最关键部分
脉冲场电泳（PFGE）的应用——分子分型
• PFGE分型技术因其重复性好、分辩力强被誉为细菌分子分型技术的“金标准”,并推荐作为金黄色葡萄球菌等病原微生物分型的标准技术。 • PFGE分型技术的不足是:耗时,需要2~4 d的样品制备时间;设备价格昂贵；对分析大小相似的片段分辨力不是很高。 • 目前,美国PulseNet已创建病原菌PFGE图谱数据库,通过与数据库中病原菌PFGE图谱的比较,可以判断菌株间染色体 DNA的相似程度。
Mix cells with Low Melt agarose and harden in mold (be sure to use certified agarose when doing restriction digestions)

电泳系统--Biometra

电泳系统--Biometra温度梯度凝胶电泳系统TGGE & TGGE MAXI SystemsBiometra为您提供各种核酸/蛋白质电泳设备，其中TGGE系统是独家生产的新一代产品，并享受专利保护。

该系统能够产生稳定而有效的温度梯度，基于生物大分子在不同温度下分子构象发生变化，进而发生电泳行为变化的原理，用于研究生物大分子突变、分子内或分子间相互作用、蛋白热稳定性及其他相关研究。

主要特点·用作DNA、RNA或蛋白质的快速分析·突变筛选和等位基因分析·基于水平平板PAGE的高级综合系统·微处理器控制确保精密温度梯度·高质量Peltier元件具有最好的温度重复性·快速分析、节省时间，可以同时检测三十多个样品·可选择标准运行模式和梯度运行模式·两种规格可选：TGGE(凝胶尺寸: 7.3×8cm)MAXI TGGE(凝胶尺寸: 20×22cm)应用领域·人类、动物遗传性疾病的筛选分析·检测动、植物的突变·群体研究中的序列多态性分析·RNA，蛋白质热稳定性分析·作为一项实验室研究工具·越来越多地应用在基因组研究中旋转脉冲场电泳ROFE·旋转脉冲场电泳用于分离高达几Mbp的高分子量DNA·旋转电极形成真实脉冲电场，有多种参数可调·由于胶长为20cm，因而有极高的分辨率，同时有多种梳子可选，最多可上样50个样品琼脂糖凝胶水平电泳系列·UV可透的凝胶板，各种型号梳子·模具铸塑结构保证长寿命使用·可调节支脚、水平仪、双面梳，橡胶挡条，制胶时不再使用胶带·中～宽型适用于大样本检测，一次最多可达80（40×2）个样本·中宽型和大型电泳仪均带有缓冲液循环装置。

大型胶板一次最多可检测160个样本，是多态性研究、筛选的理想之选·标准型有冷却或不冷却两种，适用多样品筛选Horizon系列水平凝胶电泳装置应用于琼脂糖凝胶电泳，以分离核酸分子。