2015免疫学实验方法
免疫学实验方法
免疫学实验方法免疫学实验方法是免疫学研究的重要部分，它通过一系列的技术手段来识别、分析免疫系统中的各种生物分子、细胞和组织，以及它们之间的相互作用。
这些方法在免疫学领域广泛应用于疾病诊断、药物研发、疫苗研究等方面，对促进免疫学的发展和应用发挥了重要作用。
下面将介绍一些常用的免疫学实验方法。
一、ELISA法ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种用于检测抗体或抗原的免疫学实验方法。
该方法通过将待测抗体或抗原与固相物质结合，再加入酶标记的二抗来进行标记，最后通过酶底物的底物变色反应或荧光底物的发光反应来检测待测抗体或抗原的存在量。
二、流式细胞仪流式细胞仪是一种用于分析和计数悬浮细胞的仪器，它利用激光照射细胞，通过细胞膜上的特异性抗体标记来检测细胞的表面标记物和内部细胞器的性质和分布，对免疫细胞的表型和功能进行高效的分析。
三、免疫印迹法免疫印迹法是一种用于检测蛋白质的免疫学实验方法，通过电泳将待测蛋白分离，再将其转移到膜上，最后使用特异性抗体和标记的二抗来检测待测蛋白的存在量和大小。
四、免疫组化法免疫组化法是一种用于检测组织中特定蛋白的免疫学实验方法，通过将组织切片后进行脱水、脱脂和脱水处理，再使用特异性的抗体来标记待测蛋白，并观察标记物的颜色变化或发光情况来确定蛋白的位置和表达量。
五、免疫沉淀法免疫沉淀法是一种用于检测蛋白相互作用的免疫学实验方法，通过将待测抗体与蛋白结合，再使用蛋白A/G琼脂糖或磁珠等材料将蛋白抗原免疫沉淀下来，最后使用核酸酶或质谱技术来分析蛋白的互作关系。
以上介绍的是一些常用的免疫学实验方法，它们在免疫学研究中起着举足轻重的作用，不仅在科研领域有重要应用，同时在临床诊断和治疗中也有着广泛的运用。
希望以上内容能够对您有所帮助。
免疫学实验方案重要
抗体的制备一、实验目的掌握抗体制备的实验原理和方法。
二、实验原理三、实验试剂及器材四、操作步骤将兔放入一个特造的木匣或笼内，耳露于箱（笼）外，也可由另一人捉住兔身。
剪去耳缘的毛，用少许二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管扩张、充血。
用手轻拉耳尖，以单面剃须刀或尖的手术刀片，快速切开动脉或静脉，血液即流出，每次可收集30～40ml 。
然后用棉球压迫止血，凝血后洗去二甲苯。
放血过程中要严格按无菌要求进行。
收集的血液，4000rmp离心10min，弃上清，得到血浆，即抗体。
抗体的制备、鉴定、纯化及纯度鉴定一、实验目的⒈加深对抗体基本知识的了解。
⒉了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。
⒊了解免疫电泳的基本过程和实验依据。
1、抗体的制备一、实验原理当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。
多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。
将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。
如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。
通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。
首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。
但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。
免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。
三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。
通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。
免疫学实验操作流程
免疫学实验操作流程第一次实验 双向免疫扩散试验1、小鼠摘眼球取血，双侧均摘取，(搞眼球者和用Eppendorf 管接血者配合好，尽量不要让血液流到管外)。
收集血液于Eppendorf 管中(1管/鼠)。
(小鼠取血前12小时停止给固体食物，多给水)2、待血液凝固后，用牙签剥离血块，将Eppendorf 管于37℃放置半小时后，转入4℃ 冰箱中，直至血清彻底析出(约2小时)。
3、在第一个半小时内(37℃ 孵育)，解剖小鼠，观察小鼠免疫器官的状、大小、位置等。
4、在4℃ 的2个小时内，要做两件事情。
一是为第二天的ELISA 实验做准备，具体是包被的那一步骤；二是双向免疫扩散的实验操作。
(1) ELISA 的包被包被是将抗原吸附于酶标板的过程。
抗原的包被浓度为10ug/ml 。
48孔酶标板各孔依次加包被液100ul/孔，注意设置空白对照。
包被好的酶标板置于4℃ 过夜。
包被说明：设三复孔。
A1-A3不包被抗原，C1-C3不包被抗原，它们用于阴性对照。
2 43 5 6 7 8 10 9 1211(2) 琼脂双向免疫扩散实验操作步骤①制板配制1.5%琼脂粉溶液(用生理盐水)，微波炉加热至琼脂成溶胶状态(短间隔多次)，室温自然冷却至50℃左右(手摸上去能忍受)将琼脂粉溶液倾倒至载玻片上，待琼脂成凝胶状态后进行下一步。
(琼脂凝胶尽可能厚一些)②打孔用打孔器在琼脂上打孔。
③为稀释抗体和抗原(倍比稀释)做准备。
抗体浓度在做预实验时从原浓度开始稀释至8倍结束共3个梯度。
稀释方法：取三个EP管，分别标记为1/2、1/4、1/8。
每管先加50ul的生理盐水。
取血清50ul，加入标记1/2的EP管内，充分混匀后，用加样器吸出50ul，加入到标记有1/4的EP管内，再充分混匀后，再取出50ul，加入至标记1/8的EP管内，充分混匀。
再将各管内的血清加入到对应的孔内，每个对应孔加25ul(见图)。
④加样结束后将载玻片置于一个湿盒内，置于37℃孵箱中过夜。
免疫学实验技巧分享
免疫学实验技巧分享免疫学实验是生命科学研究中的重要组成部分，对于揭示免疫机制、诊断疾病以及研发免疫治疗方法都具有至关重要的意义。
在进行免疫学实验的过程中，掌握一些实用的技巧可以大大提高实验的成功率和准确性。
接下来，我将为大家分享一些在免疫学实验中积累的宝贵经验。
一、实验前的准备（一）实验设计在开始实验之前，一定要进行详细的实验设计。
明确实验的目的、预期结果以及所需的实验步骤。
同时，要考虑到可能出现的误差和干扰因素，并制定相应的应对措施。
合理的实验设计是实验成功的基础。
（二）试剂和材料的选择选择高质量、可靠的试剂和材料至关重要。
对于抗体、细胞因子等关键试剂，要选择知名品牌，并仔细查看其说明书，了解其适用范围、保存条件和使用方法。
此外，实验中使用的耗材，如移液器枪头、离心管等，也要确保无菌、无杂质。
（三）仪器设备的校准和维护定期对实验中使用的仪器设备进行校准和维护，如移液器、离心机、酶标仪等。
确保仪器的准确性和稳定性，能够有效减少实验误差。
二、细胞培养技巧（一）细胞的复苏细胞复苏是细胞培养的第一步，操作不当容易导致细胞死亡。
从液氮中取出细胞冻存管后，要迅速放入 37℃水浴中，轻轻摇动使其快速融化。
融化过程中要避免水没过管盖，以免造成污染。
待细胞完全融化后，将其转移至离心管中，加入适量的培养基，离心去除冻存液，然后将细胞重悬并接种到培养瓶中。
（二）细胞的传代当细胞生长至 80%－90%汇合度时，需要进行传代。
传代前要先对细胞进行消化处理，常用的消化酶有胰蛋白酶和 EDTA 等。
消化时间要根据细胞的类型和状态进行调整，一般控制在 1-5 分钟。
消化结束后，加入适量的培养基终止消化，轻轻吹打细胞使其分散，然后按照适当的比例进行传代。
（三）细胞的冻存为了长期保存细胞，需要进行冻存。
冻存细胞时，要先将细胞消化、离心，然后用含有 10%DMSO 的冻存液重悬细胞，将细胞分装至冻存管中，缓慢降温至－80℃，最后转移至液氮中保存。
医学免疫学实验指导
医学免疫学实验指导医学免疫学实验指导病原生物与免疫学教研室实验一免疫系统组织和细胞形态学一、实验目的观察小鼠胸腺、脾脏等免疫器官及免疫细胞二、实验内容机体免疫系统由免疫器官、免疫细胞、免疫分子组成。
该系统具有识别和排除抗原性异物、维持机体内环境稳定和生理平衡的功能，是执行体液免疫和细胞免疫的物质基础。
本次实验主要观察免疫器官大体解剖学、免疫细胞的形态学特征。
小鼠是啮齿目中体形较小的动物，淋巴系统很发达，包括胸腺、脾脏、淋巴管、外周淋巴结及肠道派氏集合淋巴结。
本实验在带教老师指导下，解剖小鼠，观察胸腺、脾脏等免疫器官，并制血涂片，观察小鼠免疫细胞。
（一）小鼠免疫器官解剖学观察【材料】１动物：昆明种小白鼠。
２试剂：3%来苏尔水，瑞特氏染液。
３器材：眼科镊，眼科剪，玻片。
【方法】１小鼠脱臼处死，投入盛有3%来苏尔水的缸内，浸泡5分钟。
取出小鼠，仰卧位置于试验台上，使动物腹部朝上。
２以镊子提起耻骨处皮肤，用剪刀沿正中线直剪开至下颌部，然后钝性分离皮肤，再把皮肤向四肢剪开。
３注意观察腹壁，用剪刀沿正中线自阴部至膈肌为止剪开，观察腹腔液量及性状，观察脾脏。
４切开膈肌，剪断胸骨，翻起胸骨，观察胸腺、心脏及肺脏，胸腺位于小鼠胸腔心脏前上方，内有许多大淋巴细胞（即前胸腺细胞）及特定的上皮网状细胞（分泌胸腺激素）。
５解剖结束，深埋动物。
（二）免疫细胞的形态观察【材料】１动物：昆明种小白鼠。
２试剂：3%来苏尔水，瑞特氏染液，pH8.6硫酸盐缓冲液，20%盐酸甲醇。
３器材：眼科镊，眼科剪，玻片。
【方法】１准备洁净玻片两张，一张用于推片，另一张用于固定标本。
２剪断小鼠尾巴取血或小鼠眼球取血，迅速在玻片上涂血膜制备血涂片，自然干燥。
３瑞氏染色（１）染色：甲醇固定标本２分钟（亦可省略），滴加瑞氏染液数滴覆盖血膜，染色１分钟，再加等量的pH8.6硫酸盐缓冲液或新制蒸馏水，用洗耳球吹打，使之与染液混匀，静置染色8～10分钟，弃去染料，水洗。
免疫学检验常用的方法有哪些
免疫学检验常用的方法有哪些免疫学是研究身体对致病微生物的防御能力以及防御能力失调的科学。
自从1796年E.詹纳使用疫苗预防天花后，免疫学研究开始全面深入地认识微生物在疾病中的作用，以及抗体和反抗原细胞的形成、动员、作用和相互作用所扮演的角色。
免疫学的范围涵盖了变态反应的治疗、器官移植后的免疫抑制以避免排异反应，以及对自体免疫疾病和免疫缺陷的研究。
免疫学常用检测方法主要包括免疫荧光组织化学法、抗原检测法、抗体检测法、化学发光免疫分析技术和酶联免疫吸附试验法等。
一、免疫荧光组织化学法免疫荧光组织化学法严格遵循免疫荧光组织化学基本原理，从基本定义来讲，免疫荧光组织化学以及免疫荧光细胞化学会以荧光为标记物，属于免疫组织化学技术。
早在1942年，Coons等首次在报道中指出用FITC标记抗体，能检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原，这是免疫荧光组织化学技术的基础。
在免疫学检验工作中，免疫组织化学技术是用免疫荧光技术对组织内抗原、细胞或者半抗原物质实施检测，结合抗原抗体反应原理，首先将已知抗原或者抗体标记荧光素制作成荧光标记物，然后，用荧光标记物充当分子探针与组织细胞的相应抗原或者抗体反应，这种复合物的荧光素会在检测过程中发出不同颜色的荧光，用荧光显微镜实施观察，就能够对组织细胞中的抗原或者抗体定性，做好定位与定量研究工作。
在检测过程中，蛋白质、酶、核酸、激素、多肽、多糖、磷脂、受体与病原体均可以作为抗原或者半抗原物质。
二、抗原检测法抗原是进入机体内能附着于淋巴细胞表面引发特定免疫反应的外来物质，几乎所有的异物大分子皆可作为抗原，如细菌、病毒、原虫、食物、毒液以及包括人类在内的各种生物细胞和组织。
抗原上面存在一个或者数个可与淋巴球表面接受体结合的部位，称之为抗原决定部位，当抗原决定部位与淋巴球表面接受体结合后，可以激活淋巴球，使其开始分裂繁殖或者引发一系列免疫反应，如制造抗体和活化杀手细胞等以对抗抗原侵入。
免疫学实验方法
1）形态计数法
2）3H-TdR或125I-UdR掺入法
放射性元素 wash
Stimulate
Assay
3）MTT（噻唑蓝）比色法 MTT是一种可接受氢离子的淡黄色唑氮盐染料，被
活细胞线粒体呼吸链中的琥珀酸脱氢酶和细胞色素
还原，生成不溶于水的深紫色结晶产物甲簪。因此
甲簪的生成量仅与活细胞数目成正比。细胞增殖速
三. 制备SDS－PAGE胶
四. 转移电泳及免疫印迹
五. 结果分析-用Western Blot 图片灰度分析软件
imageJ或Quantity One
免疫学三大工具比较
• 免疫荧光是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和荧 光标记技术，通过荧光激发，来对组织（细胞）内抗原进行
定位、定性及定量的研究（主要是定位）。样本是细胞或组
• 免疫组化和ELISA所用到的原理大致相同，只 是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上 有所不同。ELISA多用于定量分析，其灵敏度 非常高。 • Western Boltting 先要进行SDS-PAGE，然后 将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载 体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测 样品，可以用于定性和半定量。
假阴性结果。
• 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大
分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单
价抗原，因其不能形成两位点夹心 。
间接法测抗体
☆ 间接法是检测抗体最常用的方法。 ☆ 原理：利用酶标记的抗体检测已与固相结合的
受检抗体，故称为间接法。
☆ 操作步骤：
（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，
用于临床检验的ELISA主要有以下几 夹心法 双抗原夹心法测抗体 • 间接法测抗体（常用）
免疫学检验方法有哪些 (3)
免疫学检验方法有哪些
免疫学检验方法主要包括以下几种：
1. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：通过将待检样品加入特异性抗体或抗原包被的微孔板中，利用酶标记技术和底物发色反应来检测目标物的浓度或活性。
2. 免疫印迹（Western blot）：将蛋白质样品分离并转移到膜上，然后用特定抗体标记的酶或荧光染料检测目标蛋白质的存在。
通常用于检测抗体的特异性和蛋白质的表达量。
3. 免疫荧光染色（Immunofluorescence stning）：通过将待检样品与特定抗体结合，并用荧光标记的二抗或直接标记的抗体检测目标物的存在。
4. 免疫组织化学（Immunohistochemistry）：将组织切片或细胞片贴培养后，使用特异性抗体和酶、荧光染料或金粒等标记物来检测目标蛋白质在组织或细胞中的表达。
5. 流式细胞术（Flow cytometry）：将待检样品中的细胞与特异性抗体结合，并用荧光标记的二抗或直接标记的抗体检测目标细胞的存在和数量。
6. 中和试验（Neutralization assay）：通过将待检抗体与病毒或细菌感染的细胞或动物结合，观察抗体是否能够中和病毒或细菌的活性。
7. 结合力测定试验（Binding assay）：通过将待检抗体与其靶标物结合，并用荧光标记的二抗或直接标记的抗体检测结合的情况。
以上仅为免疫学检验方法的一部分，根据具体实验目的和样品特点，还可以使用其他更特殊的技术，如免疫电镜
（Immunoelectron microscopy）、免疫贴片（Immunospot assay）等。
免疫学检测技术
anti-CD4
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磁珠分离法
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磁珠分离
2015/8/7
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2015/8/7
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荧光激活细胞分选仪分离法 流式细胞术
• 鉴定荧光抗体单色、 双色或多色标记的细 胞。 • 分析细胞周期 • 分析细胞凋亡情况
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流式细胞术
荧光抗体标 记混合细胞
抗体含 量测定 溶血空 斑试验
51Cr释放法
乳酸脱氢 酶释放法
细胞染 色法
凋亡细胞 检测法
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淋巴细胞的分离
• 外周血 • 淋巴细胞分离液 • 外周血单个核细胞 PBMC
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外周血单个核细胞的分离
稀释 血液
离心
血浆
单 个核细胞 (PBMC，包 括淋巴细胞、 DC和NK)
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淋巴细胞转化试验（形态学示意图）
原理：人T细胞表面有PHA或ConA受体，T细 胞在体外受PHA或ConA的刺激后能转化为体积 较大、代谢旺盛、且能进行分裂的淋巴细胞， 以此测定T细胞的功能。
淋巴细胞分 离液(葡聚糖 -泛影葡胺 r=1.078)
红细胞和 粒细胞
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65Байду номын сангаас
淋巴细胞类型鉴定
• • • • • 免疫吸附分离法 免疫荧光法 磁珠分离法 流式细胞术 抗原肽-MHC分子四聚体技术
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免疫吸附分离法
加入淋巴 细胞悬液
anti-CD4
anti-CD4
弃上清
免疫比浊
在一定量抗体中分别加入递增率抗原， 经一定时间后形成免疫复合物，以浊度 计测量反应液体的浊度，根据标准曲线 推算样品中抗原含量。
免疫学常用实验方法-PPT资料63页
•成败的关键因素： 组织的固定、包埋 抗体（特异性、浓度、孵育温度和时间） 非特异性抗原的封闭 内源性酶或自发荧光的消减 显色
思考：为什么有的抗体能用于冰冻切片却不能用于石蜡切片？
3. Flow Cytometric analysis(流式细胞术) FACS: (Fluorescence-Activated Cell Sorter)
1. ELISA(酶联免疫吸附试验 Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)
RIA (radioimmunoassay, Berson&Yalow， 1960)
IRMA(immunoradiovelric assay, Miles&Hiles, 1968)
E(L)I(S)A (Engvall&Perlmann, van Weemen and Schuurs , 1971)
Complementarity-determining regions (CDRs):
CDR1 CDR2
CDR1
CDR2 CDR3
CDR3
H
FR1
CDR1 FR2 CDR2 FR3
CDR3
FR4
L
CDR: Complementarity Determining Region FR: Framework Region
alive
HGPRT+， TK+
HGPRT-， TK-
B cell+MyelomaMyeloma Myeloma+Myeloma HGPRT-， TK-
H, 次黄嘌呤 T, 胸腺嘧啶
免疫学实验技术分享
免疫学实验技术分享免疫学是一门研究生物体免疫系统结构和功能的学科，它对于理解疾病的发生机制、诊断疾病以及开发治疗方法都具有极其重要的意义。
而免疫学实验技术则是我们探索免疫系统奥秘的有力工具。
在这篇文章中，我将和大家分享一些常见且重要的免疫学实验技术。
一、免疫细胞的分离与鉴定免疫细胞包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等，它们在免疫应答中发挥着不同的作用。
要研究这些细胞的功能，首先需要将它们从复杂的细胞混合物中分离出来。
1、密度梯度离心法这是一种常用的分离免疫细胞的方法。
其原理是根据细胞的密度不同，在一定的离心力作用下，使其在密度梯度介质中分层，从而实现分离。
例如，我们可以使用淋巴细胞分离液来分离外周血中的单个核细胞。
2、流式细胞术这是一种能够对单个细胞进行快速定量分析和分选的技术。
通过给细胞标记上特定的荧光抗体，然后让细胞逐个通过激光束，仪器可以检测到荧光信号，从而确定细胞的表面标志物表达情况，进而对细胞进行鉴定和分选。
二、免疫细胞功能检测1、 T 细胞增殖实验T 细胞在受到抗原刺激后会发生增殖。
常用的检测方法有放射性核素掺入法，比如 3HTdR 掺入法。
将待检测的 T 细胞与刺激物共同培养一段时间后，加入 3HTdR，通过检测细胞内掺入的放射性强度，就可以反映 T 细胞的增殖情况。
2、细胞毒实验这是检测细胞毒性 T 细胞（CTL）或自然杀伤细胞（NK 细胞）杀伤活性的方法。
常见的有 51Cr 释放法，将靶细胞用 51Cr 标记，与效应细胞共同培养后，检测上清液中的放射性强度，从而反映效应细胞的杀伤能力。
三、抗体检测技术1、酶联免疫吸附试验（ELISA）这是一种广泛应用的抗体检测方法。
将抗原或抗体固定在固相载体上，然后加入待检测的样品，通过酶标记的二抗和底物显色来检测样品中抗体或抗原的含量。
ELISA 有多种类型，如间接法、双抗体夹心法等。
2、免疫荧光技术利用荧光素标记的抗体与抗原结合，在荧光显微镜下观察荧光的分布和强度，从而确定抗原或抗体的存在和定位。
免疫学实验操作技巧
免疫学实验操作技巧免疫学实验是研究免疫系统及其相关疾病的重要手段，准确而熟练的实验操作技巧对于获得可靠的实验结果至关重要。
在这篇文章中，我们将详细介绍一些常见的免疫学实验操作技巧，帮助您在实验中更加得心应手。
一、实验前的准备在进行免疫学实验之前，充分的准备工作是成功的关键。
首先，要熟悉实验的目的和原理，仔细阅读实验操作手册，了解所需的试剂、仪器和设备。
同时，确保实验环境的清洁和无菌，对实验台面、移液器等进行消毒处理。
准备好高质量的试剂也是必不可少的。
购买试剂时，要选择可靠的供应商，并注意试剂的保质期和储存条件。
对于需要自行配制的试剂，要严格按照配方和操作步骤进行，确保浓度和纯度的准确性。
仪器设备的校准和调试同样重要。
例如，移液器需要定期校准，以保证移液的准确性；离心机的转速和时间要根据实验要求进行正确设置。
二、样本的采集和处理样本的质量直接影响实验结果的准确性。
在采集血液样本时，要注意无菌操作，避免血液受到污染。
对于血清样本，采集后要让血液自然凝固，然后通过离心分离血清。
离心的速度和时间要适当，一般为3000rpm，10-15 分钟。
组织样本的采集要迅速，并在低温条件下保存，以防止蛋白质的降解。
在处理组织样本时，要将其充分匀浆或研磨，以释放出细胞内的成分。
细胞样本的处理需要特别小心。
在培养细胞时，要控制好培养条件，如温度、湿度、CO₂浓度等。
在收集细胞时，要使用适当的消化酶，避免对细胞造成损伤。
三、抗体的选择和使用抗体是免疫学实验中最常用的试剂之一。
选择合适的抗体对于实验的成功至关重要。
要根据实验的目的和样本的类型选择特异性高、亲和力强的抗体。
同时，要注意抗体的来源（如鼠抗、兔抗等）和亚型（如 IgG、IgM 等）。
在使用抗体时，要按照说明书进行稀释。
稀释抗体的缓冲液要选择合适，一般常用的有 PBS、TBS 等。
稀释后的抗体要在规定的时间内使用，避免长时间放置导致活性下降。
为了提高实验的准确性，常常需要进行抗体的预吸附。
免疫学实验技术总结
免疫学实验技术总结免疫学是一门研究生物体免疫系统结构和功能的学科，而免疫学实验技术则是研究和理解免疫系统的重要工具。
这些实验技术涵盖了从细胞水平到分子水平的研究，帮助我们揭示免疫反应的机制、诊断免疫相关疾病以及开发新的免疫治疗策略。
以下是对一些常见免疫学实验技术的总结。
一、免疫细胞的分离与鉴定免疫细胞包括淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等，它们在免疫反应中发挥着不同的作用。
分离和鉴定这些细胞对于研究免疫功能至关重要。
1、外周血单个核细胞（PBMC）分离通过密度梯度离心法，利用FicollPaque等介质，可以将外周血中的PBMC与红细胞、粒细胞等分离。
PBMC主要包含淋巴细胞和单核细胞。
2、淋巴细胞的纯化可以使用磁珠分选法，将带有特定表面标志物的淋巴细胞从PBMC 中分离出来。
例如，通过抗CD4或抗CD8抗体包被的磁珠，可以分别纯化出CD4+T细胞和CD8+T细胞。
3、免疫细胞的鉴定常用流式细胞术进行免疫细胞的鉴定。
通过荧光标记的抗体与细胞表面标志物结合，然后在流式细胞仪中检测荧光信号，从而确定细胞的类型和比例。
此外，免疫细胞化学染色也是一种常用的方法，通过抗体与细胞内或表面的抗原结合，然后用显色剂显色，在显微镜下观察。
二、免疫细胞功能检测了解免疫细胞的功能对于评估免疫状态和免疫反应具有重要意义。
1、 T 细胞增殖实验常用的方法有3H胸腺嘧啶掺入法和MTT法。
在刺激物（如抗原、丝裂原）的作用下，T 细胞会发生增殖。
通过检测细胞掺入放射性胸腺嘧啶或MTT的代谢产物，可以反映T 细胞的增殖能力。
2、细胞毒性 T 细胞（CTL）杀伤活性检测经典的方法是51Cr 释放法。
靶细胞被51Cr 标记后与CTL 共同孵育，CTL 杀伤靶细胞后，51Cr 释放到上清中，通过检测上清中的放射性强度来反映CTL 的杀伤活性。
现在也有一些非放射性的检测方法，如CFSE标记法。
3、细胞因子的检测细胞因子在免疫调节中起着关键作用。
免疫学实验整理
免疫学实验整理一、凝集试验、吞噬试验（一）凝集试验1、直接凝集反应（ABO血型鉴定）2、间接凝集反应（类风湿因子测定）3、金黄色葡萄球菌协同凝集试验（二）吞噬试验（示教）1、中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬）2、巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬）名解：1.免疫学检测技术：利用免疫学原理来检测抗原、免疫分子（抗体、补体、细胞因子和粘附分子等）及免疫细胞等免疫学研究对象的实验过程。
如凝集反应可用于检测抗原抗体，吞噬十堰可用于检测免疫细胞等。
2.凝集反应（agglutination reaction）:在一定浓度的电解质溶液中，颗粒性抗原与相应抗体结合后，出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。
3.直接凝集反应（direct agglutination reaction）:细菌、细胞等颗粒性抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝集反应。
4.间接凝集反应（indirect agglutination reaction）：将可溶性抗原或抗体先吸附于适当大小的颗粒性载体表面（这种载体与免疫无关），然后与相应抗体或抗原结合，在适量的电解质存在下，出现特异性凝集现象，称为间接凝集反应。
5.协同凝集实验（coagglutination）：利用金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）能与人和多种哺乳动物IgG的Fc段结合而不影响其Fab段功能的特性，将已知的特异性抗体吸附于金黄色葡萄球菌上，与相应的抗原发生的凝集反应即为协同凝集试验。
6.滴度（titer）、效价：The maximum dilution that gives obviously visible agglutination (++) is called the titer.实验及注意点：1、检测抗原抗体的基本原则：根据抗原抗体结合反应的高度特异性，用已知抗体（抗原）检测未知抗原（抗体），有现象则说明有相应抗原，无现象则无相应抗原。
2、直接凝集反应（ABO血型鉴定）：若加A抗体出现凝集说明血清中有A抗原，为A型血。
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（2）迟发型超敏反应（DTH）的检测：此方法为体 内检测细胞免疫功能的简便易行的皮试方法。其原 理是外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同 的抗原作皮试可导致迟发型超敏反应，T细胞活化并 释放多种细胞因子，产生以单核细胞浸润为主的炎 症，局部发生充血、渗出，于24~48小时发生，72小 时达到高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反 应强烈的可发生水肿，甚至坏死。
对照和标准曲线： 阳性对照 阴性对照 定量测定：标准品制作标准曲线 待测样品的合理稀释
用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：
抗原或抗体的酶标记
*
*
•用途：目标蛋白的定性或定量分析
ELISA三个必要试剂： （1）固相的抗原或抗体，
即"免疫吸附剂"（immunosorbent）; （2）酶标记的抗原或抗体，
称为"结合物"（conjugate）； （3）酶反应的底物。
ELISA基本的实验过程：
a.包被 b.抗原抗体反应 c.酶促反应,显色 d.终止显色，读取数据。
3．细胞毒试验
细胞毒实验技术是检测CTL、NK等细胞杀伤靶 细胞活性的一种细胞学技术。主要用于肿瘤免疫、 移植排斥反应和病毒感染等方面的研究。
（1）放射性核素释放法：(51Cr、125I—UdR)
51Cr release
CTL
51Cr labeled
Target cell CTL
Target cell
MTT实验流程
1. 细胞的增殖和细胞毒实验，一般可在96孔细胞培养板中进行。 2. 每孔加入100微升细胞悬液。细胞的数量取决于实验目的和培养时间。增殖实验 每孔通常加入103个以上数量的细胞；细胞毒性实验每孔至少加入5x103个或以上数 量的细胞(具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等 因素确定)。 3. 接种的细胞按照实验需要，送入细胞培养箱进行培养。增殖实验通常要给予010微升特定的药物或生长因子进行刺激。细胞毒实验通常要给予0-10微升抑制因子 或细胞毒药物； 4．培养结束后，每孔加入20微升MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育3－6小时； 5．孵育结束后，每孔加入100微升甲簪溶解液，在37℃细胞培养箱内再继续孵育， 直至在镜下观察甲簪全部溶解。通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。 如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时 间会略长。 6. 在570nm测定吸光度。如无570nm滤光片， 560-600nm范围的滤光片均可使用。
左不计右”
细胞密度： 每毫升培养基中活细胞个数=每个方块内细胞的平
均数×细胞稀释比例×104
1 mm2×0.1 mm = 0.1 mm3 = 10-4cm3 = 10-4 ml
(二)免疫细胞功能的测定 1．T细胞功能测定 （1）T淋巴细胞增殖试验：T细胞受到特异性抗原 或有丝分裂原（PHA、ConA）刺激后可发生增殖， 可通过以下三种方法检测。
2．B细胞功能测定 B细胞受多克隆激活剂或特异性抗原刺激后，
活化、增殖，最后分化为浆细胞，产生抗体。抗体 可以在血浆和其他体液中检出，检测抗体是测定B 细胞功能的最主要的方法。 （1）B淋巴细胞增殖试验：LPS或PWM刺激
（2）B细胞产生抗体能力的检测：
1）ELISA检测培养上清中抗体的量。
2）ELISPOT（酶联免疫斑点法）可检测抗体分泌 细胞，又可测定抗体分泌量的体外实验方法。 详细见后述
（2）巨噬细胞吞噬试验：将待测巨噬细胞与某种可 被吞噬又易于计数的颗粒性物质（如鸡红细胞）混 合温育后，颗粒物质被巨噬细胞吞噬，根据吞噬百 分率即可反映巨噬细胞的吞噬能力。
三、细胞因子的检测
酶联免疫吸附试验-ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
•基础: 抗原或抗体的固相化
一、抗原抗体的检测技术
免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系 列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞 因子的实验手段及分子生物学技术在免疫学研 究中的应用。
免疫学技术的应用极为广泛，疾病的诊断 、疗效评价及理论研究等。
二、免疫细胞的检测
对机体参与免疫应答的细胞进行鉴定,计数及功能测定
(一)细胞计数—细胞计数板 *准备细胞计数器：70%乙醇 →制备单个细胞悬液：贴壁细胞需胰酶消化 →加样 →细胞计数：100倍镜下观察，“计上不计下，计
1）形态计数法
2）3H-TdR或125I-UdR掺入法
放射性元素
wash
Stimulate
Assay
3）MTT（噻唑蓝）比色法
MTT是一种可接受氢离子的淡黄色唑氮盐染料，被 活细胞线粒体呼吸链中的琥珀酸脱氢酶和细胞色素 还原，生成不溶于水的深紫色结晶产物甲簪。因此 甲簪的生成量仅与活细胞数目成正比。细胞增殖速 度越快，则甲簪生成的量越多，吸光度越高；细胞 毒性越大，则甲簪生成的量越少，吸光度越低。
免疫 识别和清除抗原性异物 可能有利，也可能有害
免疫应答 免疫系统具有区别“自己”和“非己”的能力
免疫耐受
免疫学检测与免疫学技术
一、抗原抗体的检测技术 二、免疫细胞的检测 三、细胞因子的检测-ELISA 四、免疫组织化学 五、免疫印迹技术 –Western Blotting 六、 流式细胞术 七、PCR技术 八、基因沉默技术
Target cell
Cr51 release
Assay
（2）乳酸脱氢酶释放法：细胞受损，LDH释放， LDH在催化乳酸生成丙酮酸的同时将NAD+还原成 NADH 。 后 者 再 通 过 递 氢 体 - 吩 嗪 二 甲 酯 硫 酸 盐 (PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四 氮唑蓝(NBT)形成有色的甲簪类化合物，在490nm 或570nm波长处读取的OD值，经计算即可得NK细 胞活性.
（3）MTT比色分析法
4．吞噬功能测定 （1）硝基蓝四氮唑试验：硝基蓝四氮唑（NBT）是 一种水溶性的淡黄色染料。由于在杀菌过程中产生 反应性氧中间物（ROI），其中超氧阴离子（O2-） 能使被吞噬进细胞内的NBT还原成不溶性蓝黑色甲 臜颗粒，沉积于胞浆中，光镜下计数NBT阳性细胞 ，可反应中性粒细胞的吞噬功能。