01 实验一 总糖和还原糖的测定(3,5-二硝基水杨酸法)(4)精品PPT课件
3,5-二硝基水杨酸法测定山楂片中还原糖和总糖含量
3,5-二硝基水杨酸法测定山楂片中还原糖和总糖含量3,5-二硝基水杨酸法是一种常用的测定还原糖和总糖含量的方法，其原理基于还原糖在酸性条件下与3,5-二硝基水杨酸反应生成红色化合物，而总糖则在强硫酸存在下加热分解，生成由葡萄糖和六碳糖等组成的还原糖，在酸性条件下与3,5-二硝基水杨酸反应生成红色化合物。
具体操作步骤如下：1. 取一定质量的山楂片粉末，加入适量的蒸馏水，加热水浴至沸腾，过滤，将过滤液冷却至室温。
2. 取0.2 ml 过滤液，加入2 ml 3,5-二硝基水杨酸溶液，摇匀后在60摄氏度恒温水浴中反应10分钟，然后放冷。
3. 吸收液的吸光度在515 nm处测定，还原糖含量的计算公式为：还原糖含量（%)= (As–A0)/(有效光程×C×0.88)×100，其中As为样品吸光度，A0为空白试剂吸光度，有效光程为1 cm，C为样品初始体积，0.88为还原糖的摩尔吸光系数。
4. 取剩余过滤液，加入相当于5倍于样品初始体积的浓硫酸，浸于沸水中煮2小时，浸于水中冷却，并用蒸馏水将瓶口水洗入容量瓶，摇匀。
5. 取0.1ml 还原糖水样稀释液加入容量瓶，加入相当于5倍于样品初始体积的浓硫酸，摇匀后加入适量的蒸馏水到刻度线，摇匀后离心。
6. 取0.1 ml 离心上清液，加入2 ml 3,5-二硝基水杨酸溶液，摇匀后在60摄氏度恒温水浴中反应10分钟，然后放冷。
7. 吸收液的吸光度在515 nm处测定，总糖含量的计算公式为：总糖含量（%)= (As–A0)/(有效光程×C×0.88)×100，其中As为样品吸光度，A0为空白试剂吸光度，有效光程为1 cm，C为样品初始体积，0.88为还原糖的摩尔吸光系数。
总之，3,5-二硝基水杨酸法是一种稳定可靠的方法，能够准确测定山楂片中的还原糖和总糖含量，为山楂片的质量控制提供了重要的参考。
实验二--总糖和还原糖的测定PPT课件
六、改进实验建议
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▪ 附：仪器和试剂
▪ 主要仪器：分光光度计，水浴锅，容量瓶，刻度试管， 移液管等。
▪ 3,5-二硝基水杨酸试剂：
▪ 甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2ml 10%氢氧化钠溶液中， 并用水稀释至69ml，在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。
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▪ （2）样品中总糖的水解提取：
▪ 准确称取10g新鲜材料（或1g材料干样粉末）， 放在锥形瓶中，加入10ml 6 mol•L-1 盐酸，15ml 水，在沸水浴中加热30min，取出一、二滴置于 白瓷板上，加1滴碘～碘化钾溶液检查水解是否完 全。如已水解完全，则不呈现蓝色。冷却后加入1 滴酚酞指示剂，以10%氢氧化钠溶液中和至溶液 呈微红色，过滤并定容到100ml。再精确吸取上述 溶液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀 备用。
（mg•g-1）
=
测定用提取液体积（ml）×样
品重量（g）
样品水解后还原糖毫克数×提取液总体积（ml）×稀释倍数
总糖（mg•g-1）=
测定用提取液体积（ml）×样品重量（g）
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五、讨论分析
▪ 1、在被测样品中，还原糖可能是些什么糖？总糖 包括哪些？
▪ 2、用来测定总糖的样品，为什么要加盐酸水解？ 而在其测定前，又为何要用NaOH中和？
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葡萄糖标准液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
相当于葡萄糖量(mg) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
蒸馏水（ml）
2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8
还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法实验_百替生物
碳水化合物
实验一 还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法
一、目的
掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原
糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶
实验二 还原糖含量测定——砷钼酸比色法
一、目的 植物体内的还原糖主要是葡萄糖、果糖和麦芽糖。它们在植物体内的分布，不仅反映植物体内碳 水化合物的运转情况，而且也是合成其它成分碳架来源和呼吸作用的基质。此外，水果、蔬菜中含糖 量的多少，也是鉴定其品质的重要指标。其它碳水化合物，如淀粉、蔗糖等，经水解也生成还原糖。 因此，测定还原糖的方法在研究植物体内生理生化变化和测定植物体内碳水化合物方面都是很重要的。
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A、4％CuSO4•5H2O B、称取 24g 无水碳酸钠，用 850mL 水溶于大烧杯中，加入 2g 含 4 分子结晶水的酒石酸钾钠，待 全溶（应加热）后加入碳酸氢钠 16g，再加入 120g 无水硫酸钠（加热），全溶及冷却后加水至 900mL， 沉淀 1～2d，取上清液（要求严格时过滤）备用。 使用前将 A 与 B 按 1∶9 混匀即可使用。 （2）砷钼酸试剂：25g 钼酸铵 ( NH4)6Mo7O24·4H2O 溶于 450mL 蒸馏水中（加热溶解，但温度 接近 150℃时易分解），待冷却后再加入 21mL 浓 H2SO4 混匀。另将 3g 砷酸氢二钠(Na2HasO4·7H2O) 溶解于 25mL 蒸馏水中，然后加到钼酸铵溶液中，室温下放置于棕色瓶中可长期使用。 （3）200μg／mL 标准葡萄糖原液：准确称取分析纯葡萄糖 200mg，溶解定容到 1000mL。
生化实验一 总糖和还原糖含量的测定
实验一总糖和还原糖含量的测定（3,5－二硝基水杨酸法）一、目的要求：掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。
二、实验原理:在NaOH存在的条件下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。
在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈棕红色，在540nm 波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。
黄色桔红色三、试剂和器材1、试剂3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000ml容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325ml，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000ml。
葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即葡萄糖浓度为1.0mg/ml。
6mol/L HCl：取250ml浓HCl（35%～38%）用蒸馏水稀释到500ml。
碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。
6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。
0.1% 酚酞指示剂。
2、材料山芋淀粉四、器材723型分光光度计，分析天平，水浴锅，研钵，烧瓶，试管若干等。
五、操作1、葡萄糖标准曲线制作取干净试管6支，按表1进行操作。
以吸光值为纵坐标，各标准溶液的浓度（mg∕ml）为横坐标作图得标准曲线。
管号0 1 2 3 4 5试剂标准葡萄糖溶液∕ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水∕ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0DNS试剂∕ml 2 2 2 2 2 2沸水浴中准确煮沸5min，取出，用自来水冷却至室温蒸馏水∕ml 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 葡萄糖含量∕mg 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0A540nm0 0.051 0.110 0.150 0.205 0.2532、样品中还原糖的提取与测定准确称取0.5g山芋淀粉，加蒸馏水约3ml，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约30ml的蒸馏水冲洗研钵2-3次，洗出液转入三角烧瓶中。
实验一 3.5一二硝基水杨酸比色定糖法
实验一3．5一二硝基水杨酸比色定糖法【目的和要求】1．掌握3，5一二硝基水杨酸比色法定糖的原理及方法。
2．用3，5一二硝基水杨酸定糖法测定山芋粉中的总糖及还原糖。
【原理】3，5一二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈现比例关系，利用比色法可测知样品的含糖量。
该方法是半微量测糖法，操作简便，快速，杂质干扰较小。
【操作方法】一、葡萄糖标准曲线的绘制将上述各管溶液混匀后，用72型分光光度计（520nm）进行比色测定，用空白管溶液调零点，记录光密度值。
以葡萄糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制出标准曲线。
二、山芋粉中总糖和还原糖含量的测定1．样品中还原糖的提取：准确称取2g山芋粉，放入100ml烧杯内，加入85％乙醇50ml，混匀，在50℃恒温水浴中保温30min，过滤，滤渣再用85％乙醇提取二次。
将滤液合并，蒸去乙醇，加少量水，移入100ml容量瓶中，用水定容，备用。
2．样品中总糖的水解及提取：准确称取出芋1g，放入大试管中，加入1ml 6mol盐酸和15ml蒸馏水。
混匀，在沸水浴中加热半小时后，用碘化钾－碘溶液检查水解程度，若已水解完全，则不呈现蓝色。
冷却后加入酚酞指示剂1滴。
以10％氢氧化钠中和至溶液呈微红色。
过滤并定容至100ml 。
再精确吸取上述溶液10ml ，放入100ml 容量瓶中，定容，备用。
将各管混匀后，按制作标准曲线时同样的操作测定各管的光密度，在标准曲线上查出相应的还原糖含量，按下述公式推算出山芋粉内还原糖与总糖的百分含量。
还原糖％＝还原糖毫克数×样品稀释倍数 ×100样品重量【试剂和器材】一、试剂（1）3´，5´一二硝基水杨酸试剂（又称DNS 试剂）：甲液——溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10％氢氧化钠中，并稀释至69 ml ，在此溶液中加入6.9g 亚硫酸氢钠。
乙液——称取255g 酒石酸钾钠，加到300 ml 10％氢氧化钠中，再加入880 ml 1％ 3，5一二硝基水杨酸溶液。
实验一35二硝基水杨酸比色法还原糖和总糖的测定
百度文库- 让每个人平等地提升自我实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法一、实验目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以。
三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料小麦面粉；广范pH试纸。
2．主要仪器（1）大试管：2×20cm×14（2）烧杯：100mL×3（3）三角瓶：100mL×1（4）容量瓶：100mL×3（5）移液管：1mL×3；2mL×2；10mL×4（6）吸耳球、玻璃棒（7）恒温水浴锅（8）漏斗、滤纸（9）白瓷缸、电炉（10）精度天平（11）分光光度计3．试剂（已制备）（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取90℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将3,5-二硝基水杨酸（DNS）和2mol\L NaOH溶液262mL，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中，7-10天后才能使用。
还原糖含量的测定ppt课件
实验六 还原糖和总糖含量的测定 （3,5-二硝基水杨酸比色法）
方可离开。 7、值日生打扫干净实验室后，方可离开。
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操作步骤 1、绘制葡萄糖标准曲线
管号
0 1 2 3456
葡萄糖液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.81.6 1.4 1.2 1.0 0.8
DNS试剂(ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
加热
同时一起在沸水浴中加热5min*
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待水解液冷却至室温后加入1滴酚酞指示 剂，用6mol/L NaOH中和至微红色，在 4000rpm、5分钟条件下离心，得到的上 清液转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定 容至刻度，上下颠倒几次混匀溶液，作为 总糖待测液。
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（3）显色和比色，按下表操作
管号 样品量（ml） 蒸馏水（ml） DNS试剂(ml) 加热
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（2）提取样品中的总糖： 准确称取0.1g食用面粉放置于100ml三角 瓶中，加入10ml 6mol/L HCl及15ml蒸馏 水，沸水浴30分钟（注意不能把水烧干）。 用滴管吸取1~2滴水解液于白瓷板上，加1 滴I-KI溶液，如显示出蓝色说明水解不完全， 可适当延长沸水浴时间；若不显蓝色，则 说明水解完全。
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2、测定样品中还原糖和总糖含量。
（1）提取样品中的还原糖：
准确称取1g食用面粉放置于100ml三角瓶 中，加少量蒸馏水调成糊状，再加入50ml 蒸馏水，摇匀，置于50℃水浴条件下20分 钟，使还原糖浸出；在4000rpm、5分钟条 件下进行离心，得到的上清液倒入100ml容 量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，上下颠倒 几次将溶液混匀，作为还原糖待测液。
还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法实验_百替生物
碳水化合物
实验一 还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法
一、目的
掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原
糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶
解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸
水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄
糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的 3-氨
基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，
（3）显色和比色
取 4 支 20mL 具塞刻度试管，编号，按表 2 所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作 标准曲线的 0 号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。
表 2 样品还原糖测定
管号
还原糖待测液 （mL）
总糖待测液 （mL）
蒸馏水 （mL）
DNS
光密度值
（mL） （OD540nm）
提取液总体积 查曲线所得葡萄糖毫克数×
测定时取用体积 还原糖（%）=
样品毫克数
×100
查曲线所得水解后还原糖毫克数×稀释倍数
总糖（%）=
×0.9×100
样品毫克数
六、附 注
1． 离心
时对称位置的离心管必须配平。
2． 标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。
生物化学实验课件讲解
⽣物化学实验课件讲解实验⼀⼆硝基⽔杨酸⽐⾊法测定总糖含量（4学时）⼀、实验⽬的（1）掌握⼆硝基⽔杨酸⽐⾊法测定总糖的原理。
（2）学习分光光度计的使⽤⽅法。
（3）掌握⽐⾊定糖法操作技术。
⼆、实验原理在碱性条件下，还原糖与3，5-⼆硝基⽔杨酸共热，3，5-⼆硝基⽔杨酸被还原为3-氨基-5硝基⽔杨酸（棕红⾊物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物，在⼀定范围内，还原糖的量与棕红⾊物质颜⾊深浅的程度成⼀定⽐例关系，在540nm波长下测定棕红⾊物质的吸光度，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖的含量。
总糖可在强酸条件下⽔解，得到还原糖，从⽽间接求出样品中总糖的含量。
三、实验仪器（1）刻度试管：25 mL；（2）烧杯：100 mL；（3）三⾓瓶：100 mL；（4）容量瓶：100 mL；（5）刻度吸管：1 mL，2 mL，10mL；（6）恒温⽔浴；（7）沸⽔浴；（8）离⼼机（过滤法不⽤此设备），离⼼管或玻璃漏⽃，电⼦天平，分光光度计。
四、实验试剂（1）1 mg/mL葡萄糖标准液：准确称取0.250 g分析纯葡萄糖（预先80℃烘⾄恒重），置于⼩烧杯中，⽤少量蒸馏⽔溶解后，定量转移到250 mL容量瓶中，以蒸馏⽔定容⾄刻度，摇匀，冰箱中保存备⽤。
（2）3，5-⼆硝基⽔杨酸试剂：将6.3 g 3，5-⼆硝基⽔杨酸和262 mL 2mol/L的NaOH溶液，加到500 mL含有185 g酒⽯酸钾钠的热⽔溶液中，再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸钠，搅拌溶解。
冷却后加蒸馏⽔定容⾄1000 mL，贮于棕⾊瓶中备⽤。
（3）碘-碘化钾溶液：称取5.0 g碘、10 .0g碘化钾，⽤蒸馏⽔溶解⾄100mL。
（4）酚酞指⽰剂：称取0.1 g酚酞溶于70%⼄醇⾄250 mL。
（5）6 mol/L HCl，6 mol/L NaOH。
（6）⼩麦淀粉，⾷⽤⾯粉。
五、实验操作1．制作葡萄糖标准曲线取7⽀刻度试管，按下表操作。
管号0 1 2 3 4 5 6 葡萄糖标准液/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 蒸馏⽔/mL 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 3，5-⼆硝基⽔杨酸/mL 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 将各管内液体混匀，在100 ℃⽔浴中加热5 min，取出冷却⾄27~30 ℃后以蒸馏⽔定容⾄25 mL，将各管摇匀，将分光光度计调⾄540 nm 波长，⽤零号管调零，再读取1~6号管的吸光度，然后将读取的吸光度为纵坐标，葡萄糖mg数为横坐标，绘制出标准曲线。
实验一-3--5--二硝基水杨酸法测定总糖和还原糖
实验一3, 5 -二硝基水杨酸法测定总糖和还原糖1、实验目的：掌握还原糖和总糖测定的基本原理掌握比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
2、实验原理：在NaOH和丙三醇存在下，3,5-二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。
在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。
3、实验步骤：（一）葡萄糖标准曲线制作1. 取6个试管，按下表加入1.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水2. 向各试管中分别加入DNS试剂1 ml，充分混合，放入沸水浴中加热煮沸2 min 进行显色，取出试管放入盛有冷水的烧杯中迅速冷却。
3.向各管中分别加入8 ml蒸馏水，充分混合。
4.以空白管（0号管）做对照，于540nm 波长下调0，然后测定各管的OD 值。
5.以光吸收值作为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线。
如果该直线不通过零点，必须重做。
（二）还原糖的制备1. 称取2g玉米粉，把它放入一个100ml的三角瓶中，然后加入20~30ml蒸馏水，搅拌均匀。
2. 把三角瓶放于一个50℃水浴中保温30 min，不时搅拌。
3. 拿出三角瓶，将三角瓶内含物转入50ml的容量瓶中：过滤，定溶，充分混合，滤出液即为还原糖提取液。
(三) 样品总糖的水解和提取1. 取1g玉米粉，放在100ml三角瓶中，加15ml水溶解，再加10ml 6mol/L 盐酸，混匀。
2. 将三角瓶置于沸水浴中加热煮沸30 min。
3.取出1~2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。
如已水解完全，则不呈现蓝色。
4.拿出三角瓶，冷却，过滤，滤出液即为总糖提取液。
5.加入3-5滴酚酞指示剂，混匀，用6mol/L的NaOH中和至溶液呈微红色。
将中和后的溶液转入100 ml的容量瓶中定容。
（四）样品中含糖量的测定1. 取5支试管，编号，按下表向每支试管中加入试剂。
面粉中还原糖和总糖测定
目的要求
⑴了解3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的原 理. ⑵掌握还原糖及总糖测定的操作方法.
实验原理
COOH OH
+ 还原糖
O2N NO2
加热 碱 性 O2N
COOH OH
+ 糖酸
NH2
3,5-二硝基水杨酸(黄色)
3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色)
结果与计算
�
非还原性的双糖(如蔗糖)以及多糖(如淀粉)可用酸 水解法彻底水解成单糖进行测定. 由于多糖水解时,在每个单糖残基上加了一分子水,因 而在计算时应乘以折算系数(1-18/180)=0.9.
操作步骤
一,样品中还原糖和总糖的提取 1,样品中还原糖的提取 , 2,样品中总糖的提取 ,
二,标准葡萄糖浓度梯度和样品待测液的测定
还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法
还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验材料、主要仪器和试剂1. 实验材料小麦面粉；精密pH 试纸。
2. 主要仪器（1）具塞玻璃刻度试管：20mL×11（2）大离心管：50mL×2（3）烧杯：100mL×1（4）三角瓶：100mL×1（5）容量瓶：100mL×3（6）刻度吸管：1mL×1；2mL×2；10mL×1（7）恒温水浴锅（8）沸水浴（9）离心机（10）扭力天平（11）分光光度计3. 试剂（1）1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将6.3gDNS 和262mL 2M NaOH 溶液，加到500mL含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。
总糖和还原糖的测定及葡萄糖标准曲线的绘制-3,5-二硝基水杨酸法
六、计算
C1V1 ω(还原糖)=——×100% m1
C2V2
ω(总糖)=——×0.9×100% m2
附：相关仪器使用 1、移液管的使用
2、移液器的使用
3、离心机的使用 注意配平，对称放 4、V-1100可见分光光度计的使用 比色皿
V-1100可见分光光度计
开机预热30min 测吸光度 选择波长（540nm） MODE键切换到T，将黑体放入光路中
实验一、总糖和还原糖的测定
——3,5-二硝基水杨酸法
一、实验目的
1、掌握还原糖和总糖测定的基本原理；
2、学习用3,5-二硝基水杨酸法测定还原
糖的方法。
二、实验原理
还原糖是指含有自由醛基或者酮基的糖类， 单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还
原糖；利用糖的溶解度不同，可将植物样
品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来；
滤纸过滤，取10ml滤液用蒸馏水定容至 100ml，成稀释1000倍的总糖水解液，混匀, 取1ml总糖水解液，测定其还原糖的含量
3、制作葡萄糖标准曲线及还原糖、总糖 含量的测定。
取8支洁净的试管，分别用记号笔标上0～ 7号，按照下表进行操作。其中0～5管，用于 标准曲线的制作,以吸光度为纵坐标，各标准 液浓度（mg/ml）为横坐标作图得标准曲线 （用Excel表制作）。
试管容量瓶三角烧瓶量筒吸管移液管洗耳球玻棒洗瓶漏斗离心管六凹反应盘ph试纸114四实验试剂1标准葡萄糖溶液10mgml2dns试剂36mollhcl46mollnaohki溶液五操作1样品中还原糖的提取准确称取05g山芋粉置于100ml三角烧瓶中加3ml蒸馏水调成糊状再加30ml蒸馏水50水浴30min不时搅拌转移至50ml离心管中4000rpm5min上清液1沉淀加20ml蒸馏水洗涤沉淀4000rpm5min上清液2沉淀弃置于容量瓶中蒸馏水定容至100ml混匀取1ml即可进行还原糖的测定
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实验一 还原糖的测定
（3,5-二硝基水杨酸法）
目的
•掌握还原糖的测定原理 •学习还原糖的3,5-二硝基水杨酸(DNS)测定法。
原理
单糖和某些寡糖含有游离的醛基或 酮基，有还原性，属于还原糖；而多糖 和蔗糖等属于非还原性糖。
实验内容（60学时） （生技、应技、生科、信息 ）
1. 还原糖的测定（4） 2. 蛋白质N端分析（4） 3. 酶的底物专一性（4） 4. 植物DNA的提取（4） 5. DNA的酶切和电泳（4）（操作考试） 6. 酵母醇脱氢酶的提取和纯化（12） 7. 亲和层析分离纯化蛋白质（14） 8. Western Blot鉴定目的蛋白（14）
实验试剂
1、标准葡萄糖溶液（2.0mg/mL）：准确称取干燥恒 重的葡萄糖200mg，溶于蒸馏水并定容至100mL，混匀， 4℃冰箱中保存备用。
2、3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：将6.3g DNS和 262mL 2mol/L NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸 钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌 溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，存储于棕色瓶中 备用。
操作
1、葡萄糖标准曲线的制作： 取干净试管6支，按下表进行操作。以吸光度作为 纵坐标，各标准液浓度（mg/mL）作为横坐标，作图得标准曲线。
管号 试剂
标准葡萄糖溶液/mL 蒸馏水/mL DNS试剂/mL
蒸馏水/mL 葡萄糖浓度/mg/mL
A540nm
0 1 2 345
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
实验要求
按时上课，不得缺席 预习实验内容 认真观察实验现象，如实记录实验数据 独立分析实验结果，按时完成实验报告
实验室守则
保持室内安静、整洁 严格按操作规程使用仪器设备，节约试
剂和实验材料 实验过程中注意水、电、门窗安全 实验完毕后，将仪器、器皿放归原处 做好实验室卫生
特别注意
1、红薯。 2、试管1.5cm × 15cm(×10)、试管1.8cm × 18cm(×2) 3、吸管 1mL(×2)、10mL(×2) 4、水浴锅。 5、电炉。 6、722型分光光度计 7、pH试纸（1~14） 8、容量瓶100mL(× 3)。 9、量筒、研钵、三角烧瓶、玻璃漏斗。 10、电子天平
7.0
7.0
7.0
提问与解答环节
Questions And Answers
谢谢聆听
·学习就是为了达到一定目的而努力去干, 是为一个目标去 战胜各种困难的过程,这个过程会充满压力、痛苦和挫折
Learning Is To Achieve A Certain Goal And Work Hard, Is A Process To Overcome Various Difficulties For A Goal
沸水浴中准确煮沸5min，取出，用自来水冷却至室温
7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 0 0.2 0.4 0..6 0.8 1.0
用EXCEL作图、求R2和公式
1.6
y = 1.3727x - 0.0192
1.4
R2 = 0.9987
1.2
1
0.8
系列1
0.6
线性 (系列1)+盖子+内容物）= （离心管+盖子+内容物） 精确到小数点后2位
操作
4、样品中还原糖的测定：
待测溶液/mL
空白 0
还原糖溶液
1.0
1.0
蒸馏水/mL DNS试剂/mL
蒸馏水/mL 葡萄糖浓度/mg/mL A540nm
1.0
0
0
2.0
2.0
2.0
沸水浴中准确煮沸5min，取出，用自来水冷却至室温
原理
还原糖在碱性条件下加热被氧化成 糖酸及其他产物，3,5-二硝基水杨酸则 被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸 。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物 在540nm处有最大吸收，在一定的浓度 范围内还原糖的量与光吸收值呈线性关 系，利用比色法可测定样品中还原糖的 含量。
原理
黄色
棕红色
实验器材
生物化学实验 （生物工程、张之洞班）
生物化学技术 （生技、应技、生科、信息 ）
实验内容（40学时） （生物工程、张之洞班）
1. 还原糖的测定（4） 2. 蛋白质N端分析（4） 3. 酶的底物专一性（4） 4. 植物DNA的提取（4） 5. DNA的酶切和电泳（4）（操作考试） 6. 酵母醇脱氢酶的提取和纯化（12） 7. SDS-PAGE测定蛋白质分子量（8）
0
-0.2 0
0.5
1
1.5
操作
2、样品中还原糖提取：
准确称取0.5g红薯，加蒸馏水约2mL，在研钵中磨 成匀浆，转入三角烧瓶中，并用15mL的蒸馏水冲洗研 钵，洗出液也转入三角烧瓶中。
将三角烧瓶于50℃水浴中保温0.5h，不时搅拌， 使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转移到50mL离心 管中，于4000r/min下离心5min，沉淀用20mL蒸馏水洗 一次，再离心，将两次离心的上清液合并，用蒸馏水定 容至100mL，混匀，作为还原糖待测液。取1mL进行还 原糖的测定。