影响凝胶过滤层析的因素
凝胶过滤及离子交换层析介质详解
温度对分离效果也有一 定影响，可以通过控制 实验温度来优化分离效 果。
案例分享：成功应用案例剖析
案例一
使用琼脂糖凝胶成功分离大分子蛋白质混合物，通过优化流动相和洗脱条件，实现了高 纯度蛋白质的获取。
案例二
应用离子交换层析技术成功分离了复杂样品中的痕量金属离子，通过选择合适的离子交 换树脂和优化实验条件，提高了分离效果和检测灵敏度。
现状
目前，凝胶过滤层析介质已经广泛应用于生物大分子的分离纯化，如蛋白质、酶、多糖等。同时，随着技术的不 断进步，新型凝胶过滤层析介质不断涌现，为生物分离领域提供了更多的选择。
应用领域与前景
要点一
应用领域
凝胶过滤层析介质在生物医药、生物工程、食品科学等领 域具有广泛的应用。例如，在生物医药领域，可用于药物 的分离纯化、蛋白质组学研究、抗体药物研发等；在生物 工程领域，可用于基因工程产物的分离纯化、酶工程产物 的分离纯化等；在食品科学领域，可用于食品添加剂的分 离纯化、功能性食品的研发等。
对未来发展趋势进行预测
层析技术的创新与应用拓展
随着科学技术的不断发展，层析技术将继续创新并拓展应用领域。例如，开发新型高效层析介质、优化层析条件、提 高分离效率等。
与其他技术的联合应用
层析技术可以与多种其他技术联合应用，如质谱、光谱等，实现复杂样品的高效分离和检测。这种联合应用将在未来 得到更广泛的关注和应用。
在生物医药等领域的应用前景
生物医药等领域对高纯度、高活性物质的需求不断增加，层析技术作为一种重要的分离纯化方法，将在 这些领域发挥越来越重要的作用。
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离子交换层析介质
根据目标离子的电荷性质和大小，选择合适的离子交换树脂，如阳离子
凝胶层析技术(凝胶过滤).
3、样品的加入吸取1ml血红蛋白——核黄素混合液，加到凝胶床的表面上，不要沿柱壁加样品，注意加样时勿将床冲起。
打开出口管，用少量水流一下，接触过样品的管壁，再加水扩展洗脱，用试管将洗脱液。
4、洗脱：加去离子水洗脱，流速为每分钟1ml,两分钟收一管。
5、比色测定：波长，红色部分520nm,黄色部分450nm 绘制洗脱曲线：以光密度为纵座标，以时间为横座标，并标明洗脱峰的名称。
6、凝胶的回收。
四、凝胶层析的特点 1、凝胶是一种不带电荷的惰性物质，本身不会与被分离物质相互作用，分离效果好，重复性高。
2、设备简单，操作简便。
五、影响凝胶层析的因素（一）凝胶的选择：（二）凝胶粒度对分离效果的影响 40-60目为粗粒。
100-200目为细粒（应用较多）能使洗脱曲线的峰区变得对称和狭窄。
250-400目为最细粒。
250-400 （三）洗脱流速对分离效果的影响：一般采用流速在30-200ml/小时，过快会使色层谱变形。
（四）离子强度和附值（五）样品液体积对分离效果的影响通常样品液体积约为凝胶床总体积的5-10%。
（六）凝胶柱的长度，直径和分离效果的关系（七）Vo和Vi。
第五章 凝胶过滤层析
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
三、凝胶过滤的有关理论问题 ㈠ 凝胶介质的多孔结构和凝胶柱的体积参数 凝胶过滤介质是由多聚物交联形成的具有三维网状结构的 颗粒。 凝胶柱的体积参数包括： 总柱床体积（total volume, Vt），是凝胶经溶胀、装柱、 沉降，体积稳定后所占据层析柱内的总体积； 外水体积（outer volume, V0），是柱中凝胶颗粒间隙的液 相体积的总和； 内水体积（inner volume, Vi），是存在于溶胀后的凝胶颗 粒网孔中的液相体积的总和； 凝胶体积（gel volume, Vg），又称支持物基质体积 （matrix volume of the support, Vs）或干胶体积，是凝胶 颗粒固相所占据的体积，
第五章 凝胶过滤层析 第三节 凝胶过滤介质
一、凝胶过滤介质的基本结构 凝胶介质的基本结构都是具有多孔网状结构的水不溶性多 聚物。 理想的凝胶过滤介质必须符合以下条件： （1）有较强的机械稳定性，能满足层析过程所需流速， 在其标称的操作压力范围内不发生体积变化； （2）高化学稳定性，凝胶颗粒对分离过程中常用的试剂 和样品都保持惰性，在很宽的pH范围内保持稳定，耐去 污剂、有机溶剂，耐高温，从而方便清洗和消毒灭菌； （3）球形，颗粒直径均匀，呈现亲水性； （4）不带电荷，不对样品产生吸附作用。
第五章 凝胶过滤层析 第一节 概 述
凝胶过滤具有的优势 : （1）凝胶介质不带电荷，具有良好的稳定性，分离条件温 和，回收率高，重现性好； （2）通常情况下，溶液中存在各种离子、小分子、去污剂、 表面活性剂、蛋白变性剂等不会对分离产生影响，层析还能 在不同pH、温度下进行； （3）应用范围广，能分离的物质相对分子质量的覆盖面 宽，从几百到数百万，因此既适用于分子量较低的寡糖、寡 肽、聚核苷酸等生物小分子的分离，也适用于蛋白质、多糖、 核酸等大分子物质的纯化； （4）设备相对简单、易于操作、分离周期短、连续分离时 层析介质不需再生即可反复使用。
第四章 凝胶过滤
5
二、分配系数Kd
衡量组分被排阻程度的一个特征参数 介质内部组分的浓度 介质外部组分的浓度 C内 C外
Kd=
=
A：当分子量大到完全不能进入颗粒内部，即完全被排阻，此时C内=0，
Kd=0。
B：当分子量小到完全可以自由进入到凝胶颗粒内部，在分配达到平衡时， 凝胶内部与外部组分的浓度相等，此时Kd=1。 C：在一般情况下，凝胶层析中，流动相和固定相溶液的性质是相同的，所
械强度大于2B，筛孔也小于2B。 以上三种胶：葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶本身的理化性质
不稳定，机械强度比较低，流速慢。称为软胶。
Sepharose 与1，3-二溴异丙醇在强碱条件下反应后，即形成CL型交联琼脂 糖。其筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同，但热稳定性和化学稳定性 都有了提高。 琼脂糖凝胶的最大优点是对生物大分子非特异性的吸附最小，回收率高。
它是以甲撑双丙烯酰胺做交联剂，以过硫酸铵为催化剂，在N,N,N`,N`四甲基乙二胺（TEMED）加速剂的作用下，将丙烯酰胺（单体）聚合而 成。当单体浓度改变时，可得到吸水率不同的产物。
产品型号： Bio-gel P-2到P-300，数字相当于排阻限度的1000分之一。 通常聚丙烯酰胺凝胶为珠状颗粒，并以干胶形式出售，使用前必须溶涨。
2014-8-1
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7
A：Vt-Vo的值太小，洗脱峰便拥挤在一起，不容易分离 B：通过增加Vt来提高分辨率 C：柱床体积不变，减少上样量 D：减少Vo，减少粒径范围 Vt≈ Vo+Vi Vo→Kd=0，选用兰色葡聚糖2000（分子量200万），呈兰色，在各种型号的 凝胶中都被完全排阻。 Vi →Kd=1，选用硫酸铵等与凝胶无吸附力的小分子物质。
通过实验让学生理解影响凝胶过滤层析的因素
通过实验让学⽣理解影响凝胶过滤层析的因素通过实验让学⽣理解影响凝胶过滤层析的因素在⽣物化学实验中,凝胶过滤层析,也称分⼦筛层析、排阻层析,是以被分离物质的分⼦量差异为基础的⼀种层析分离技术。
笔者现将凝胶层析的⽤途及通过实验让学⽣理解掌握影响凝胶过滤层析的两种因素阐述如下。
⼀、凝胶层析的应⽤⼴泛凝胶层析的应⽤⾮常⼴泛,最主要的应⽤有以下四种。
1.脱盐⾼分⼦(如蛋⽩质、核酸、多糖等)溶液中的低分⼦量杂质,可以⽤凝胶层析除去,这⼀操作称之为脱盐。
2.⽤于分离提纯凝胶层析已⼴泛⽤于酶、蛋⽩质、氨基酸、多糖、激素、⽣物碱等物质的分离提纯。
凝胶对热原有较强吸附⼒,可⽤于除去⽆离⼦⽔中的致热原制备注射⽤⽔。
3.测定⾼分物质的分⼦量⽤⼀系列已知分⼦量的标准品放⼊同⼀凝胶柱内,在同⼀条件下层析、记录每⼀分钟成分的洗胶体积;根据物质的洗胶体积,在标准曲线上查出其分⼦量。
4.⾼分⼦溶液的浓缩⼆、通过葡聚糖凝胶柱层析实验,让学⽣理解影响凝胶过滤层析的两种因素学⽣通过实验,掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。
对于凝胶过滤层析的理论学习,学⽣普遍感到抽象、难理解。
通过实验,可以让学⽣在实验的过程中,变抽象为直观,变难懂为易懂。
在实验开展的进程中,学⽣可以亲眼观察到凝胶的选择和层柱⼤⼩、长短的不同均会对实验结果产⽣影响。
1.凝胶的选择,根据实验⽬的不同,选择不同型号的凝胶⽬前,市售凝胶主要包括:价格便宜的凝胶葡聚糖G-10,分离范围<700;价位适中的凝胶葡聚糖G-35,分离范围是<5000;价格偏贵、胶位度较⼤的为凝胶葡聚糖G-35、G50,分离范围分别为1000-17000及1000-30000。
在该实验中,样品蓝⾊葡聚糖2000分⼦量的约为2×105,⽽溴酚蓝分⼦量约为670,两者分⼦量相差较⼤,可选择颗粒较⼤⽽胶联度较⼩的、价格相对适中的凝胶葡聚糖G25。
由于蓝⾊葡聚糖分⼦量过⼤,不能从凝胶分⼦中通过,所以蓝⾊葡聚糖2000克于溴酚蓝出柱,。
凝胶过滤层析法
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Sephadex经改性后比其母体具有更广泛的用途，适用于脂类、甾类、脂肪酸、激素、维生素及其他小分子的分级分离。
10
15-20
72
5
150
5000-400000
1000-150000
15
20-30
72
5
200
5000-800000
1000-200000
20
30-40
72
5
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Sephadex的型号及性能
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3、主要用途：孔径较小的凝胶主要用于脱盐、肽与其他小分子的分离；孔径较大的凝胶用于蛋白质与其他大分子的分离。DNA级的Sephadex适用于DNA或低聚核苷酸的分离。
峰宽：峰的基线宽度，通过层析峰两侧拐点作切线交于基线上的距离。
标准差：样品组分被带出层析柱的分散度，用σ表示。两侧拐点之间的距离为2个标准差。
Wb=4 σ=1.699W1/2
W1/2=2.354 σ
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保留值：表示样品中各组分在层析柱中停留时间的长短或组分流出时所需流动相体积的大小。
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Sephacryl系列产品性能
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(五)、Superdex系列产品 是最新的凝胶过滤介质，属BioProcess介质中的一种。是将葡聚糖以共价键方式结合到高交联的多孔琼脂糖珠体上形成的复合凝胶。是将交联葡聚糖优良的过滤选择性及高交联的琼脂糖的物理化学稳定性集于一身的具有优良选择性和高分辨率的产品。可在0.1mol/LHCl或1mol/LNaOH溶液中40℃处理400小时而分辨率保持不变。
凝胶层析
遇水为不溶解的固相 化学惰性物质
离子基团含量少
颗粒大小和网眼均匀
机械强度较强
具有可选择的多种孔径
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凝胶的种类和性质
Text
葡聚糖凝胶
（Sephadex）
修饰葡聚糖凝胶
（Modified Sephadex） 典 型 其 它
聚丙烯酰胺凝胶
（Bio-Gel P）
多孔玻璃微球
（Bio-glas）
商品名为生物凝胶-P（Bio-Gel P）。 一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺 交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。
特点： 1、通过控制交联剂用量可制成各种 型号凝胶； 2、稳定性好、强度高； 3、保存方便。
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凝胶的种类和性质
3.琼脂糖凝胶（Sepharose; pharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad)
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操作步骤
3
样品的加入 吸取样品溶液，加到凝胶床的表面上，不要沿柱壁加样品， 注意加样时勿将柱床冲起。 打开出口，使样品恰好进入床面(不要让空气进入床内)，用 上法滴加1-2倍样品体积的蒸馏水。
4
洗脱
待样品完全流进床内后，再加蒸馏水进行扩展洗脱，控制流 速，直至两条区带分开为止。
5
比色测定
绘制洗脱曲线： 以光密度为纵座标，以时间为横座标，并标明洗脱峰的名称 。
通过SephadexG-50层析柱，以蒸馏水为洗脱剂，分离血红蛋白(红色，分子 量约64500)与硫酸铜(蓝色，分子量249.5)的混合物，从颜色的不同观察血红蛋 白和硫酸铜的洗脱速度。
一．材料 1．仪器 层析柱(直径0.8-1.5cm，长10-20cm)；吸管；玻璃棒；小烧杯；25ml量 筒；试管。 2．试剂 Sephadex G-50；抗凝血； 0.9%NaCI溶液；硫酸铜溶液 二．方法 （一）凝胶的准备。 （二）样品制备 1．血红蛋白(Hb)溶液的制备 取抗凝血液约0.5ml于离心管中，离心5分钟 (2500rpm)，弃去上层血浆，用0.9%NaCI溶液3ml洗血细胞二次，将血细胞用1.5ml 蒸馏水稀释，即为Hb稀释液，备用。 2．取Hb稀释液与CuSO4溶液各0.5ml，充分混匀，此混合液作为样品。
凝胶过滤层析讲解
四、加样 加样体积越小，分辨率越高。 两种蛋白洗脱体积为VeA、VeB，两种蛋白分离体 积Vs（洗脱体积之差），Vs＝VeA-VeB,
理论上，Vp(加入样品体积）＝Vs时就能分离两种
蛋白质
Vp<Vs时效果好。
样品粘度的影响
五、 洗脱 洗脱液：能溶解被洗脱物质、不使其变性或 失活为原则。 一般都以单一缓冲液(如磷酸缓冲液、TrisHCl缓冲液等)或者盐溶液作为洗脱液。
3)中等大小的分子，在凝胶颗粒内外均有分布，部分进 入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。
凝胶过滤原理示意图
凝胶层析的几个概念
外水体积（Vo）：是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流 动相的体积。 内水体积（Vi）：是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体 积。 基质体积（Vg）：是指凝胶颗粒实际骨架体积。
分级分离一般选用排阻极限略大于样品中最高分子 量物质的凝胶。
2）粒度的选择
目数（反映凝胶颗粒直径的大小）。目数越 大，直径越小。 每种型号凝胶都有有粗粒和细粒之分。 细粒均一性好，分离效果好，但是流速慢， 适合小型实验。层析柱选用大直径的； 粗粒的优势是流速快，适合样品量大的实验， 选用小直径的柱子提高分辨率。
（2） 琼脂糖凝胶
不同分子量蛋白质的分离—凝胶过滤层析法
不同分子量蛋白质的分离—凝胶过滤层析法一、实验目的1. 了解凝胶柱层析的原理及应用。
2. 掌握凝胶柱层析的基本操作技术。
二、实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。
该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。
大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。
这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。
任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。
Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。
分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav 值增大。
通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。
该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。
但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。
测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。
本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过Sephadex G－25层析后达到分离。
生化实验报告 实验5 血红蛋白凝胶过滤
生化实验报告实验5 血红蛋白凝胶过滤生化实验报告实验5血红蛋白凝胶过滤实验报告课程名称：生化实验b实验日期：班级：姓名学号：血红蛋白凝胶过滤一、背景及目的血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。
存在于脊椎动物、某些无脊椎动物血液和豆科植物根瘤中。
人体内的血红蛋白由两个α亚基和两个β亚基组成。
每个亚基均成球状，内部有一个血红素。
血红素上的亚铁离子可以可逆的与氧分子结合，起到运输氧气的作用。
当携带氧气时，血红蛋白呈鲜红色，无氧时为暗红色。
凝胶过滤法又称凝胶排阻层析或分子筛层析，主要就是根据蛋白质的大小和形状，即为蛋白质的质量展开拆分和提纯。
层析柱中的填料就是某些惰性的多孔网状结构物质，多就是交联的聚糖(例如葡聚糖或琼脂糖)类物质，并使蛋白质混合物中的物质按分子大小的相同展开拆分。
通常就是大分子先流出，小分子后流出。
凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果。
影响拆分效果的因素主要存有以下几点：1.基质的颗粒大小、均匀度2.筛孔直径和床体积的大小3.洗脱液的流速4.样品的种类等，5.缓冲液的ph6.而最轻易的影响就是kav值的差异性，kav值差异性小，拆分效果不好；kav值差异性大，则拆分效果很差，或显然无法分离。
影响凝胶过滤的因素主要有：1、层析柱的挑选：短的层析柱分辨率必须比长的高，但层析柱长度无法过长。
2、加样量：加样过多，会造成洗脱峰的重叠；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低。
3、凝胶柱的鉴定：凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。
4、洗脱速度：洗脱速度应保持适中。
目前凝胶过滤器技术的应用领域主要就是以下几点：1、脱盐2、用于分离提纯3、测定高分子物质的分子量4、高分子溶液的浓缩5、蛋白质的复性二、实验原理层析法就是基于相同物质在流动阴之木紧固二者之间的分配系数相同而将混合组分拆分的技术。
凝胶过滤层析技术原理讲解
凝胶过滤层析技术原理讲解凝胶过滤层析技术原理讲解(附动画)原创作者;gfzhang凝胶过滤层析(Gel Filtration Chromatography，GFC)又称尺寸排阻层析(Size Exclusion Chromatography，SEC)凝胶渗透层析(Gel Permeation Chromatography，GPC)分子筛层析(Molecular Sieve Chromatography，MSC)注:在高效液相色谱分析中，用GFC或SEC表示凝胶过滤色谱或尺寸排阻色谱，流动相通常是水溶液;在有机高分子分析中，常用GPC表示凝胶渗透色谱，流动相通常是有机溶剂;在蛋白质分离纯化中用GFC或SEC表示凝胶过滤层析或尺寸排阻层析;本文以下内容均针对蛋白质分离，因此均以凝胶过滤层析(GFC)表示。
(1)分离机理GFC填料是由高分子交联而成、内部具有网状筛孔的固体颗粒，利用球状凝胶内的筛孔的大小，不同水力学半径的分子在通过填料时运行路径存在差异，利用该差异将不同大小的蛋白质进行分离。
蛋白质分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，因此总体运行路径较短，从层析柱入口到出口所需时间较短;较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，总体运行路径较长，故在管柱内的停留时间较长;基于此原理可以区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而确定未知样品的分子量。
注1:球形蛋白与线性分子在凝胶过滤层析中的保留行为存在差异，因此使用球形蛋白制作的分子量标准曲线不能用于明胶多肽、淀粉或其它聚合物。
(2)应用范围A蛋白质分离，基于混合中不同蛋白质分子尺寸大小进行分离;B分子量测定，蛋白质分子量(球形)的对数与其在凝胶过滤层析时的保留时间呈线性关系; C样品脱盐或溶剂置换。
(3)填料要求一般状况下，用于制备凝胶过滤层析的填料应不吸附目标成份，所有欲分离物质均被洗脱出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。
第七章层析分离技术2——凝胶过滤层析
（1）介质不带电荷, 具有化学惰性，不与被分离物 质发生化学反应，条件温和，不会使物质变性；
（2）色谱介质不需再生,可反复便用； （3）分离效率高，回收率较高； （4）广泛应用于生物大分子的初级分离，脱盐等。 （5）分辨率较低，需采用细长柱。 （6）经过凝胶过滤色谱后样品被稀释，上样前需
显影响 其分离效果不受去污剂、促溶盐类、变性剂等影响 能在多种有机溶剂存在下使用
②Superdex
根据分级范围不同，可分为若干型号（见表5.6，P80）， 其中，数字越大，孔径越大。 prep grade 颗粒较大。
Superdex peptide Superdex 30 prep grade Superdex 75、200 （ prep grade ）
根据交联之前母胶中琼脂糖的含量不同，Sepharose CL系 列凝胶也有三种类型：Sepharose CL-2B、Sepharose CL4B和Sepharose CL-6B。
特点
Sepharose CL系列凝胶在颗粒直径、分级范围方面与Sepharose系 列完全相同
在pH稳定范围、机械强度（流速）及温度稳定性等方面得到了很 大的改进
二、凝胶过滤介质
2. 凝胶介质的种类
按基质组成主要可以分为 ：
葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯 -二乙烯苯凝胶、二氧化硅凝胶，以及由两种物质混合 形成的如琼脂糖-葡聚糖混合凝胶、聚丙烯酰胺-葡聚糖 混合凝胶等。
按凝胶过滤层析能达到的柱效和分辨率又可分为：
标准凝胶介质：颗粒尺寸较大（一般为100~250 μm），机
（1）葡聚糖凝胶（Sephadex ） G-数字 联度越大，分级范围越小。）
凝
胶 过
（2）琼脂糖凝胶
实验三葡聚糖凝胶柱层析
25~75
平均90 平均90 60~200 45~165 45~165 60~200
3~11
2~12 2~12 4~9 4~9 4~9
0.2
0.1 0.1 0.004 0.008 0.02 0.005
20~39
300 250 10 11.5 14 15
45~165
45~165
蛋白、多糖
蛋白、多糖
3~13 3~13
分析分离时：Vsample=1-4%Vbed； 制备分离时：Vsample=25-30%VbeБайду номын сангаас. 分 离 体 积 (Vsep): 相 邻 两 组 分 Ve 之 差 ， 用 于衡量相邻两组分的分离效果。
Vsep=Ve1-Ve2 ，
当Vsample<Vsep时，则相邻两组分可完全分离。 相对粘度：样品液粘度与洗脱液粘度的比值。 分离效果只与相对粘度有关，一般来说， 相对粘度不得超过1.5―2。 今天的上样量（0.2ml）约为1%柱床体积。
实验三、葡聚糖凝胶柱层析
1、目的与要求：
1.1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理； 1.2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层 析的操作技术。
2、凝胶层析法的原理：
凝胶层析是一种液相层析，机理是分子筛 效应。当洗脱开始以后，小分子可进入凝 胶颗粒内部，流程长，流动慢；大分子不 能进入凝胶颗粒内部，流程短，流动快。 这样就可使大小不同的分子分开。
颗粒大 小μm
24~44 24~44 24~44 20~40 20~40 25~75 25~75 25~75
特性/应用
肽类、寡糖、小蛋白等 重组蛋白、细胞色素 单抗、大蛋白 蛋白、肽类、多糖、核酸 蛋白、肽类、寡糖、多糖 肽类、小蛋白 蛋白，如清蛋白 蛋白、抗体 多糖、具延伸结构的大分 子如蛋白多糖、脂质体 巨大分子 巨大分子如重组乙型肝炎表 面抗原 蛋白、大分子复合物、病毒、 不对称分子如核酸和多糖 （蛋白多糖） 蛋白、多糖 蛋白、多糖 蛋白、大分子复合物、病毒 、不对称分子如核酸和多糖 （蛋白多糖）
第五章-凝胶过滤层析PPT优秀课件
每一种特定的凝胶介质都有特定的分子量分级范围，分级范 围是凝胶介质的重要参数。 根据其分级范围，可以将溶质分子分为三类： 1.分子量大于分级范围上限的分子被称为全排阻分子，它们 完全被排阻在凝胶颗粒网孔外，从颗粒间隙中通过，所受阻 力最小，流程也最短，首先从层析柱中被洗脱下来；
凝胶过滤分离蛋白质 的过程
（1）蛋白质混合物上柱； （2）开始洗脱，小分子进入凝胶颗粒内，大分子被排阻在
颗粒外； （3）小分子被滞留而移动慢，大分子移动快，大小不同的
分子开始分开； （4）大小不同的分子完全分开； （5）大分子已被洗脱，而小分子仍在层析柱内。
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
一、凝胶过滤的概念
不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同, 凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层 析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离.
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凝胶色谱分离原理
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
三、凝胶过滤的有关理论问题 ㈠ 凝胶介质的多孔结构和凝胶柱的体积参数 凝胶过滤介质是由多聚物交联形成的具有三维网状结构的
颗粒。 凝胶柱的体积参数包括： 总柱床体积（total volume, Vt），是凝胶经溶胀、装柱、
沉降，体积稳定后所占据层析柱内的总体积； 外水体积（outer volume, V0），是柱中凝胶颗粒间隙的液
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
2.分子量低于分级范围下限的分子被称为全渗透分子，它们 完全进入凝胶颗粒网孔内部，洗脱时所受阻力最大，流程也 最长，最后从层析柱中被洗脱； 3.分子量在分级范围内的分子被称为部分渗透分子，它们依 据分子大小不同程度的进入凝胶颗粒内部的，是该凝胶介质 的有效分离对象。 如果两种物质分子量均大于凝胶介质分级范围的上限，或者 均小于分级范围下限，它们就无法通过层析而分离。
凝胶过滤层析实验
凝胶过滤层析实验凝胶过滤作为实验室最常用的层析方法之一，无疑是众多层析方法中最娇贵的存在。
原理凝胶过滤层析是根据蛋白质分子大小不同而达到分离效果的，凝胶过滤填料中含有大量微孔，只允许缓冲液及小分子量蛋白质通过，而大分子蛋白质及一些蛋白复合物则被阻挡在外。
因此，高分子量的蛋白质在填料颗粒间隙中流动，比低分于量蛋白更早地被洗脱下来。
最大的蛋白质分子最早流出柱子，因为它们在到达柱底前经过的体积最小。
中等大小的蛋白质可以进入填料分子中较大的孔内，因此它们晚一些到达柱底，而小蛋白质可以逬入所有填料的孔内，有最大的通过体积，故最后到达柱底。
材料与仪器蛋白质溶液缓冲液、蓝色葡聚糖溶液、乙醇、乙腈、乙酸、胃蛋白酶低压层析系统操作步骤1.凝胶的填装1.1凝胶的溶胀如果凝胶是脱水的干粉（例如Sephadex）在使用前需要溶胀。
1.1.1一份凝胶加10份的缓冲液，原则上应将凝胶颗粒放入洗脱缓冲液中。
1.1.2在摇床上或手动搅拌混合，避免使用电力搅拌器。
因为机械搅拌力会导致凝胶颗粒破裂成碎片，这些细小的碎片将干扰层析。
如果出现细小的凝胶碎片可将凝胶浆悬浮，待凝胶颗粒沉降后，去除上清，重复几次，直到液相不再混浊为止。
1.1.3自然溶胀需要24 h至数天，为了加速溶胀，可用热法溶胀。
即在沸水浴中将凝胶浆逐渐升温至近沸，这样可加速溶胀平衡，通常1～2 h即可完成。
这种方法不但省时，还可以排除气泡和消毒。
1.1.4无论凝胶是否需要溶胀，为了防止气泡影响层析，需用水泵或真空泵对凝胶浆抽气1 h。
1.2装柱1.2.1将层析柱垂直安装在无直接光照、无空气对流处，以防止由于温度变化使层析柱内产生气泡。
通常放在专用的层析冷柜中；1.2.2装柱前取3/4体积的凝胶和1/4体积的缓冲液制成凝胶浆；1.2.3对于经常使用的层析柱，建议使用一个商品化的流动相接头（flow adaptors）。
它对柱床表面有保护作用，还可以避免样品中的大颗粒混入凝胶中，从而延长层析柱的寿命；1.2.4将缓冲液加入层析柱，当有缓冲液流出时关闭柱的出口。
凝胶层析法
型号 G10 G15 G25 G50 G75 G100 ＜700
分离范围 （分子量）
吸水量 （ml/g） 1.0±0.1 1.5±0.2 2.5±0.2 8.0±0.3 7.5±0.5 10.0±1.0
床体积/干凝胶 （ml/mg） 2~3 2.5~3.5 4~6 9~11 12~15 15~20
三．凝胶层析分离的过程
5 ． Ve (elution volume) 洗 脱 容 积 ： Ve=Vo+KdVi 。 自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰） 出现时所流出的容积。 6．Kd：样品组分在两相间的分配系数。 7．Kd: 通过实验可求得。 Ve=V0+Kd•Vi Kd=(Ve-Vo)/Vi
二．样品 积 为 柱 床 体 积 的 1~4%； 制备分离时，样品体积为柱床体积的 25~30%。 2. 分离体积（Vsep=Ve1-Ve2） 当样品体积≥Vsep时，两个相邻组分不能 完全分离。
三．操作压的影响
1．洗脱时维持流速的恒定。 2．用恒流泵维持恒压，从而维持恒流。
分子量的测定和计算
一般都采用标准曲线法。只要测得几种标 准蛋白质相对分子质量的Ve，并以它们的 相对分子质量的对数(logMr)对Ve作图得一 直线，再测出待测样品的Ve，即可从图中 确定它的相对分子质量。
凝胶层析法
第一节：引言
一．凝胶层析(Gel chromatography)
凝胶层析也称： 排阻层析(ellusion chromatography)、 凝胶过滤(gel filtration)、 分子筛层析(moleculer chromatography)。
凝胶层析中常用凝胶的类型 （4种主要类型）
二．凝胶的类型
第四节：凝胶层析的实验技术
生物药品的分离纯化技术及其应用考核试卷
2.离子交换层析中，蛋白质的吸附能力随着溶液pH值的增加而增强。（）
3.亲和层析的洗脱通常可以通过改变pH值来实现。（）
4.冷冻干燥是生物药品储存的最佳方法，因为它可以完全避免蛋白质的变性。（）
5.生物药品的毒理学评价只需要检测急性毒性。（）
10.在蛋白质的等电点沉淀中，以下哪种情况会导致蛋白质沉淀？（）
A.溶液pH值低于蛋白质等电点
B.溶液pH值高于蛋白质等电点
C.溶液pH值等于蛋白质等电点
D.溶液pH值远离蛋白质等电点
11.下列哪种方法适用于蛋白质的变性？（）
A.加入盐类
B.加入有机溶剂
C.调节pH值
D.降低温度
12.以下哪种层析技术是基于蛋白质分子大小进行分离的？（）
4.影响生物药品稳定性的因素包括温度、pH值、离子强度、氧化等。通过冷冻干燥、冷藏、调节pH值和使用抗氧化剂等方法可以保持药品稳定性。
4.生物药品的稳定性对其质量和疗效至关重要。请列举影响生物药品稳定性的因素，并讨论在储存和应用过程中如何保持生物药品的稳定性。
标准答案
一、单项选择题
1. A
2. C
3. A
4. C
5. A
6. C
7. B
8. A
9. D
10. C
11. B
12. C
13. D
14. C
15. C
16. D
17. C
A.离子交换层析
B.亲和层析
C.凝胶过滤层析
D.吸附层析
13.在生物药品纯化过程中，下列哪种方法通常用于去除核酸杂质？（）
A.蛋白酶处理
第三章 凝胶过滤层析
交联度
交联剂占单体和交联体总量的百分数 凝胶颗粒孔径大小与交联度有关
第二节 凝胶介质的分类和性质
1） 葡聚糖凝胶 ① G类葡聚糖（Sephadex） ② LH-亲脂型葡聚糖 ③ Sephacryl 2）琼脂糖凝胶 3）聚丙烯酰胺凝胶
（1）葡聚糖凝胶
① G类葡聚糖（Sephadex）
其分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质 完全渗入凝胶内。
分级分离，将样品中一些分子量比较接近的物质分开。 策略是使在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地 深入到凝胶内部，但由于深入凝胶空隙程度上的差异，最 后得到分离。
组别分离一般选用Sephadex G-25或G-50(3*104 Da)，脱盐一般选用G25（1000-5000Da）。
柱床体积（Vt）：是指凝胶柱所能容纳的总体积。
洗脱体积 （Ve）：样品中某组分洗脱下来所需洗脱液的总体积。
Ｖt＝Ｖ０+Ｖｉ＋Ｖｇ
计算法： Vt = 1/4 D2h
测量法： Ｖt＝Ｖ０+Ｖｉ＋Ｖｇ 由于Ｖｇ 非常小，可忽略不计，因此： Ｖt＝Ｖ０+Ｖｉ Ｖ０可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液，如蓝 色葡聚糖-2000； Ｖi可用硫酸铵等无吸附力的小分子物质。
理论上，Vp(加入样品体积）＝Vs时就能分离两种
蛋白质
Vp<Vs时效果好。
（2）样品粘度的影响
五、 洗脱 洗脱液：能溶解被洗脱物质、不使其变性或 失活为原则。 一般都以单一缓冲液(如磷酸缓冲液、TrisHCl缓冲液等)或者盐溶液作为洗脱液。
有时甚至也可以用蒸馏水作洗脱液。
影响流速的因素
（2） 琼脂糖凝胶
商品名 Sepharose（瑞典）
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影响凝胶过滤层析的多种因素
很多人以为凝胶过滤非常简单直接，无需花太多精神仔细优化。
其实影响凝胶过滤的参数非常多，现与大家分享几点经验：
1层析柱必须有柱头及分布器，即adaptor，紧压胶面完合没有空隙，否则样品上样受影响。
2凝胶悬浮液不可太稠，否则很容易出气泡；太稀装柱时间过长，亦影响效果。
50- 70%较适合。
若是干粉，溶胀时间必须充足。
装前完全搅匀。
3一次性倒入层析柱中，容量不够则需加装柱器。
切不可分几次倒，柱效和对称性都很难合格。
4装柱及层析工作所用缓冲液的温度需一样。
5柱底网下的气泡一定要除掉，可先用20%乙醇湿一下底网。
6每种胶在不同柱高下的装柱流速、压力都不一样。
跟足介质说明书的指引就万无一失了！找不到查AK TA系统的Unicorn 中主屏幕的adviser即可，也可以查这光盘上有关层析凝胶的操作手册。
7上样前柱平衡非常重要，不光UV平稳，至少平衡一个柱体积。
8缓冲液pH值会影响分离效果，经验中用pH7.0和pH4.5的缓冲液分离5个低分子量标准蛋白，结果颇有不同。
9加入0.15M NaCl可防止非特异性的吸附及蛋白间的聚合。