生物化学实验设计1

菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响

一、目的要求

1、掌握从原料物中提取活化分离菠萝蛋白酶的方法。

2、学习酶活力测定的方法。

3、了解某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响。

4、掌握用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行化学修饰的原理。

5、比较修饰酶与未修饰酶的活力。

二、实验原理

1、本实验先从新鲜的菠萝汁中使用单宁沉淀法提取出菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生酪氨酸，通过测定吸光度的变化，可以测得菠萝蛋白酶的活力。

2、以陶瓷层析结合超滤法纯化菠萝蛋白酶，吸附材料化学性质好，可用于柱层析。

3、温度恒定时,菠萝中菠萝蛋白的热失活遵循一级蜕变规律dE/dt=-Kd*t,失活半寿期是常数，可以用作衡公菠萝蛋白酶热稳定性的指标。

本实验应用动力学方法，以菠萝蛋白酶的热失活半衰期为热稳定性的指标，定量研究了梭酸盐和Ca2+,Zn2+士对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响，以期找到一种高效、可行的增强菠萝蛋白酶热稳定性的方法。

4、修饰的菠萝蛋白酶对温度和pH值的稳定性均比天然酶有很大程度的提高。菠萝蛋白酶是一种巯基蛋白酶,但它的稳定性较差,影响了它的应用。此外,菠萝蛋白酶易受有关因素的影响而失活。聚乙二醇(PEG) 为一种无毒且具亲水性的免疫惰性大分子，本实验采用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行修饰,提高了其对环境的稳定性,使其半衰期延长。

三、实验材料

（一）试剂和材料

1、新鲜菠萝(0.735kg)、0.1mg/ml牛血清蛋白

2、柠檬酸钠、单宁、0.1%EDTA溶液、1.5%氯化钠溶液、1%酪蛋白溶液、1mol/L 氢氧化钠溶液、0.05mol/L磷酸缓冲液、激活剂

3、Brolain试剂、牛血清白蛋白、0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液、PEG活性酯。（二）实验仪器

1、榨汁机；

2、离心机；

3、紫外可见分光光度计（1cm石英比色皿）；

4、恒温水浴锅（37℃）；

5、试管、试管架；

6、烧杯、容量瓶；

7、移液管；

四、试验方法

（一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶

操作步骤：

将菠萝切碎→加柠檬酸钠，榨汁→菠萝汁→纱布过滤→澄清液→2000r/min，7min 离心→上清液→加Vc,0.2%单宁溶液搅拌15min,静置40min4200r/min,5min离心→沉淀物→加100ml0.1%EDTA溶液，200ml1.5%氯化钠液→4200r/min,5min离心→

酶复合物→加适量1.5%氯化钠溶液，4000r/min,7min离心→酶复合物沉淀→冻存备用

（二）菠萝蛋白酶活力的测定

1、取酶制品溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液（PH7.0)至10ml,离心得上清液；

2、取5支试管，分别标号1、2、

3、

4、5，各加1ml溶液酶和0.9m激活剂；

3、另取5支试管，分别对应标号1、2、3、

4、5，各加1ml缓冲液和0.9ml激活剂；

4、将10支试管置于37℃水浴；

5、然后按下表操作

试管号 1 2 3 4 5 6 7 8

标准酪蛋

0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0

白

（0.1mg/mL）

待测酶蛋白

0 0 0 0 0 0 0 1.0

（mL）

磷酸缓冲液

1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0

（mL）

考马斯亮蓝

4 4 4 4 4 4 4 4

（mL）

通过测定不同试管中菠萝蛋白酶的吸光度A的值，进而确定酶活力的大小。（三）聚乙二醇对菠萝蛋白酶的化学修饰

1.1修饰酶的制备

60gPEG6000溶于400mL干燥吡啶,加入1.01g琥珀酸酐后60℃保温2h,然后在60℃减压蒸馏除去溶剂。加入苯直至残余物溶解,再加100mL冷己烷,4℃振荡2h 过滤,残渣溶于蒸馏水后透析。PEG活性酯和菠萝蛋白酶按摩尔比50：1投料,加入到0.1molPL柠檬酸盐缓冲液中,4℃反应4h。产物在pH4.6的柠檬酸缓冲液中透析,冻干后得到白色的PEG-菠萝蛋白酶(修饰酶)。

1.2 TNBS法测定修饰率

取1mL蛋白酶溶液(1mgPmL),加入1mL4 %的碳酸氢钠溶液,1mL10%的十二烷基磺酸钠溶液,20min 后加入1mL0.1%的TNBS 溶液,40℃保温2h ,用0.5mL 1mol/L 的盐酸终止反应。325nm测光吸收值。同样浓度蛋白酶溶液在修饰后与修饰前的光吸收值之比即为残留氨基率。修饰率=1-残留氨基率

（四）某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性

1.1 菠萝蛋白酶热稳定性实验方法

新鲜菠萝榨汁100mL加人到55℃预保温的一定浓度梭酸盐溶液中，不同保温时间测定菠萝蛋白酶活力，按热失活遵循一级蜕变规律dE/dt=-Kd*t方法求出菠萝蛋白酶的半衰期。

1.2 有机羧酸盐对菠萝蛋白酶热稳定性的影响。

pH7.0时草酸钠对菠萝蛋白酶有明显稳定作用，100 mmol/l草酸钠使tl/2延长6倍，丁二酸、酒石酸甲钠也有一定的保护作用。醋酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠都有一定程度的保护作用，且浓度变化对保护作用的影响不大。

（五）结果与讨论

1、修饰率的测定

测定结果按下式进行计算:修饰率= 1 - 残留氨基率= 1

- 修饰后的光吸收值P修饰前的光吸收值= 1 - 0. 502P0. 887 =

0. 4340 = 43. 40 %

2、菠萝蛋白酶在提取分离和干燥过程中，酶的活性中心巯基易被氧化而使酶活性降低。在提取过程中适当加入某些抗氧化剂，对阻止酶被氧化失活有良好作用。作为菠萝蛋白酶活性保护剂，硫代硫酸钠与半胱氨酸组合使用，可获较好的效果。

3、维系酶分子三维构象的作用力包括:氢键、疏水相互作用、静电相互作用、范德华力，有些还包括共价二硫键，蛋白质分子不管是变性、还是增强稳定性，都是通过影响这些作用力来实现的。但总的来看，氢键、疏水相互作用在增强酶的稳定性方面起着主要作用。

4、本实验通过用琥珀酸酐法活化后的PEG修饰菠萝蛋白酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量,并对其生化性质与混合酶和天然酶进行了对比研究。所得到的修饰酶在对温度和pH值的稳定性上均比天然酶有一定程度的提高，这说明PEG分子对酶有一定的保护作用,推测这种作用应来自分子间的作用力。

参考文献:

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4、梁楚泗,李树瑜,杨政蓓. 毛花猕猴桃蛋白酶的提纯和性质[J ] . 植物

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（五）结果讨论

从上述结果可知菠萝蛋白酶的比活力较低，可能的原因有：

1、所加入的有机酸单宁的量对菠萝蛋白酶沉淀有的影响；

2、在实验中是否把单宁溶液弄混而导致菠萝蛋白酶很少沉淀析出；

3、菠萝蛋白酶对热不稳定，试验中温度的控制是否合理；

4、在活力测定的步骤中所加入的酪蛋白的量不足，导致结果偏低；

5、在活力的测定步骤中，设置了几个梯度，最后的结果中应该有至少两支试管中的溶液的吸光度的值相同，但本组实验没有得到这种结果。

6、活力测定中，由于操作不当，导致部分沉淀溶解在了上清液中，溶液微浑浊，对吸光度的测定有影响。