动物细胞培养实验内容

《细胞工程实验技术》

（动物细胞培养部分）

目录

实验一实验器材的清洗、包装和消毒 (2)

实验二常用的仪器设备介绍 (3)

实验三常用动物细胞培养用液的配制 (4)

实验四组织块原代培养、传代培养及生物学检测 (6)

实验五心肌细胞的原代培养、传代培养及培养细胞的常规检查 (8)

实验一实验器材的清洗、包装和消毒

一、实验目的

1、掌握细胞培养常用实验器材的清洗要领、清洗步骤和注意事项。

2、掌握细胞培养常用器材的包装要领和要求。

3、掌握正压滤器的安装、使用和拆除方法及操作注意事项。

二、实验用品

以组为单位包装物品

1、量筒（100mL、500mL）

2、大、小烧杯3个

3、1000mL容量瓶×1

4、移液管1mL×3(灭菌)

5、（100mL、250mL、500mL）盐水瓶、（500mL）广口瓶×各4(灭菌)

6、眼科剪刀、眼科镊子各2把(灭菌)

7、细胞培养瓶×3(灭菌)

其它：饭盒、青霉素瓶、牛皮纸、离心管、滴管、注射器、磁棒、绳、标签纸等杂干。三、实验内容

（一）清洗

1、要领：浸泡、刷洗、酸泡。

2、步骤：洗衣粉浸泡12h→刷洗→流水震荡冲洗15~20遍→漓水→蒸馏水洗荡2次→37℃

烘干→待包装。

3、注意事项：

(1)使用后的器材要立即投入水中。

(2)器皿内要充满液体，不得有气泡。

(3)器材要用流水震荡干净。

（二）包装

1、大的器材如：量筒、广口瓶、培养皿、吸管等要包装。

2、小的器材如：注射器、剪刀、镊子放入饭盒。

3、注意事项：

(1)包装时手指与器材接触面积要小，手指不能触及器材使用端。

(2)封闭器材使用端，标记器材手持端。

(3)小包装

(4)玻璃管道口加棉花。

（三）湿热消毒：高压灭菌锅消毒

四、作业

1、清洗的要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？

2、器材包装有何要求？

3、

实验二常用的仪器设备介绍

一、实验目的

了解动物细胞培养中常用仪器设备的使用方法、注意事项和保养方法二、实验用品

1）超净工作台

2）自动双重纯水蒸馏器

3）高压蒸气灭菌器

4）过滤器

5）电热恒温干燥箱

6）二氧化碳培养箱

7）冰箱

8）倒置显微镜

三、实验内容

1、了解超净工作台的工作原理

2、自动双重纯水蒸馏器结构、使用注意事项。

3、高压蒸气灭菌器的工作原理

4、正压过滤器的使用方法

5、二氧化碳培养箱的使用方法

四、作业

1、叙述超净工作台的工作原理

2、正压过滤器为何会除菌

实验三常用动物细胞培养用液的配制

一、实验目的

掌握常用动物细胞培养用液的组成及配制方法。

二、实验用品与仪器

量筒、烧杯、广口瓶、天平、各种无机盐、

三、实验内容

（一）平衡盐溶液的配制

I组配Hanks（1000mL），V组配D-Hanks（1000mL），其他各组不配平衡盐溶液。

2、配制方法：（以Hanks液为例）

(1)甲液：用约100mL蒸馏水溶解CaCl2，

(2)乙液：用约750mL蒸馏水溶解Na2HPO4·2H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、NaCl、

KCl。

(3)将甲液徐徐加入乙液中。

(4)将0.35gNaHCO4溶解在100mL蒸馏水中

(5)用数滴NaHCO4液溶解0.02克酚红。

(6)将4、5液移入3液中。

(7)用双蒸水定容至1000mL，充分混匀，调节PH为7.4。4℃冰箱过夜。

(8)滤过消毒，小瓶分装（500mL、250mL×2），冷藏。

3、配制要求

(1)配制后液体呈桃红色，PH7.4左右，没有混浊和沉淀。

(2)含Ca、Mg的物质要单独溶解。

(3)用于分离细胞的消化液宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制。

（二）200mmol/l，L-谷氨酰胺（10mL）(II组配)

方法：称取0.292g（M146.12）+双蒸水10mL→滤过除菌→-20℃保存。

使用：每100mL培养基加1mL L-谷氨酰胺。

（三）抗菌素液（青霉素、链霉素）(III组配)

1、方法：10mL Hangks液或双蒸水溶解100万链霉素，再用8mL链霉素溶解80万u的

青霉素，成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。

2、使用：100mL培养液加青、链霉素母液0.1mL。

（四）RPMI-1640基础培养液的配制(IV组配)

甲液：RPMI-1640 10.4g

Hepes 2.7g

双蒸水700mL

搅拌至颗粒完全溶解（橙红色）

乙液：NaHCO3 2.2g

双蒸水30mL

30min 颗粒完全溶解

将甲、乙两液混合，加水至终1000mL定容，4℃冰箱静止2~3h，滤过除菌，分装（250mL、250mL、500mL）无菌试验，写好组号，-20℃保存。

注意：用三天内制备的蒸馏水配制，培养基各成分是否完全溶解的判断方法：将培养液置室温或4℃冰箱静止30min，观察瓶底有无颗粒产生。

（五）5.6 %NaHCO4液（100mL）(V 组配)

方法：用双蒸水100mL配制，滤过除菌，分装于广口瓶，4℃冰箱保存，使用时，NaHCO4液要逐滴加入，并不时搅动培养液，以防PH过高。

（六）0.25%胰蛋白酶溶液（400mL）(VI组配)

1：250的胰蛋白酶(Trypsin)粉 1.0g

D-Hanks 400mL

先用少量D-Hanks溶解胰蛋白酶，再将剩下的液体加入混合，置37℃水浴中1h左右(待彻底溶解，液体呈透明为止)，用5.6％NaHCO4调整pH至7.6～7.8，用0.22微型滤膜抽滤，分装置4℃冰箱中保存。

（七）0.02%EDTA（乙二胺四乙酸二钠）溶液（200mL）(VI组配)

方法：称取EDTA 4g + 200mL D-Hanks液→ 0.02%，滤过除菌，备用。

四、思考题：

1、配制后液体呈黄色意味着液体的PH发生了什么变化？

2、用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制

3、L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？

4、营养液制备后为什么要小剂量分装？