基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用
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基因修饰技术在人源化肝脏小鼠模型中的应用
试验用动物
早在17世纪动物试验就已经出现了。目前试验动物广泛应用于生理学、 医学、药学等学科的教学与研究，以及食品、化妆品、生物制品、工业产 品等的安全性、毒性和效力等方面的试验和检测，具有重要价值和作用。
动物基因组
种属差异
人类基因组
吸收
分布
代谢
排泄
毒性
动物
（2）uPA-SCID小鼠（Tateno，2004年，日本）
名称 基因信息 特异性免疫 非特异性免疫 肝损伤 无T无B 正常 uPA
uPA-SCID uPA/Prkdcscid
持续性自发肝损； 出血性疾病导致死亡； 高血补体浓度（C3）肾病； 生殖障碍；
移植窗较小（出生后2W内移植）；
多个领域研究，有重要意义。
（5）NOG、NSG小鼠（Ito，2002年，日本）
名称 基因信息 特异性免疫 无T，无B 非特异性免疫 NK、补体功能缺失
NOG NOD/Prkdcscid/Il2rgtm1Sug
NOG小鼠由日本实验动物研究所的Ito培育而成。通过杂交NOD/Scid和 Il2rg-/-小鼠而来，其T、B细胞皆缺失，NK细胞功能缺陷。与NOD/Scid小鼠 相比，NOG小鼠的人体细胞和组织移植存活率显著提高，同时能够植入更高 比例的正常或癌变人类细胞和组织。NOG、NSG是类似的并行品系，源于日 本为NOG（NOD/Shi-scid/Il-2Rγcnull），源于美国为NSG （NOD/scid/γC−/−/SzJ）。 NOG小鼠在免疫缺陷模型、肿瘤模型、异种移植模型、传染病模型领域
好。而1993年15名受试者加大剂量（0.1 or 0.25 mg/kg/d)）的二期临床试 验中，前8周疗效明显，而13周时7名受试者出现肝衰竭、脾衰竭、乳酸
中毒，其中5名不治身亡。
动物试验非阿尿苷最大耐受剂量
小鼠 50mg/kg/d 90d
大鼠 500mg/kg/d 30d
比格犬 3mg/kd/d 90d
人类
代谢、免疫相关人类毒性
药 物 性 肝 损 害
肝脏是人体最重要的代谢器官，也是出现受试人员中毒时 最常见、表现最明显、影响最严重的毒性靶器官。另据报导，
每年临床发生肝毒性损伤的病例亦非常多。药物引发肝损伤占
全部中毒事件20%－50%，暴发性肝衰竭可达15%－30%。
非阿尿苷事件回顾
非阿尿苷是抗乙肝病毒核苷类似物，其前期试验药效显著，结果良
人源化肝脏小鼠模型的构建
工程基因片段 uPA基因片段
移植用人类细胞 肝细胞
Fah基因片段
HSVtk/GCV自杀系统 Tet-on/uPA自杀系统 其他
造血干细胞
胸腺细胞 其他
（1）uPA-Rag2小鼠（Dandri，2001年，德国） 肝细胞人源化率仅有15%， 适合病毒学研究，但无法 满足代谢研究需求！！
对细胞有高毒性。
♂ ♀ TK-NOG
NOG ♀
（6）TK-NOG小鼠（Hasegawa，2011年，日本）
具有人肝等效的酶表达及生物功能； 具有较高立体组织结构；
人源化程度高（≥90%）；
生存率高，移植时段宽裕，可重复利用； 无需外源性药物维持性状；
可生殖传代（雌性可与NOG小鼠生育）；
uPA-NOG小鼠是在NOG小鼠基础上通过基因修饰加入uPA基因培育而来，目前 应用相对较少，有报导的文献显示仅应用于病毒学研究，对肝脏人源化指数没 有很高要求，仅10%左右。
（8）FRGN小鼠（Wilson，2014年，美国）
名称 基因改变 特异性免疫
无T，无B
非特异性免疫
肝损伤
FRGN Fah−/−/NOD/Rag2−/−/Il2rg−/−
NK、补体功能缺失 Fah−/−
FRGN小鼠是在NOD小鼠基础上敲除Fah、Rag2、Il2rg基因培育而来，目前应 用相对较少，文献报导肝脏人源化率可达80%，并且在免疫重建上也有一定应用 趋势。
请多多指正，谢谢！
分子
技术
临床 应用
ES打靶基因修饰技术
TALEN基因修饰技术 CRISPR/Cas9基因修饰技术
生物 模型
TetraOneTM基因修饰技术
现代生物医药领域研究模式
基因修饰动物建模
免疫缺陷小鼠模型的构建
类 序 名 称 基 因 信 息 别 号 1 2 3 免 疫 缺 陷 小 鼠 4 Nude SCID NODSCID Rag2 Foxn1nu Prkdcscid NOD/Prkdcscid Rag2-/特异性免疫 非特异性免 疫 正常 正常 NK↓补体↓ 正常
Rag2小鼠 uPA基因
uPA全称尿激酶纤维蛋白溶酶原活化子（Urokinase-type Plasminogen Activator），
当白蛋白启动的uPA基因片段在小鼠肝细胞内表达时，纤维蛋白溶酶原会激活纤维蛋
白酶，诱发粗面内质网发生裂解损伤，最后肝细胞损伤并逐渐消亡。 Rag2全称重组激活基因2（Recombination-Activating Gene2），在VDJ基因重排 和淋巴细胞发育中起关键性作用。Rag2-/-小鼠为C57BL/6J品系背景，T、B淋巴细胞早 期发育严重停滞，外周血没有成熟的循环T、B淋巴细胞，非特异性免疫收影响小。
名称 FRG 基因信息 Fah-/-/Rag2-//Il2rg-/特异性免疫 T、B功能缺失 非特异性免疫 NK↓ 肝损伤 Fah-/-
（4）FRG小鼠（Azuma，2007年，波兰）
持续性的自发肝脏； 自发性Ⅰ型酪氨酸血症突出，易 诱发肝癌； 需要药物NTBC控制肝损伤程度， 易对试验结果造成影响； 小鼠存活率不高，饲养时易死亡。 FRG小鼠在性状和效果上都优于Fah-/-小鼠，其肝细胞替换率达80%以 上，后经其他学者改进探索，可达95%左右。该模型应用于代谢和病毒等
存在非特异性免疫，需药物抑制免 疫。
（3）Fah小鼠（Grompe，1993年，波兰）
具有免疫系统， 不适合人源化组 织和细胞移植
NTBC治疗维持
Fah全称延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因 （fumarylacetoacetatehydrolase），Fah-/-小鼠酪氨酸代谢受阻，出现Ⅰ型酪 氨酸血症，毒性产物损伤肝、肾。2-硝基-4-三氟甲苯-1,3环乙烷碘（NTBC）可 以抑制酪氨酸降解通路中4-对羟基苯丙酮酸双氧化酶（4-HPPD）活性，减少毒 性代谢产物积聚，起到治疗作用。
在代谢、毒性、病毒、微生物方面大量应用 2011-2017，美日有诸多研究和数据。
无商业化成品供应，国内来源受限！
（7）uPA-NOG小鼠（Gutti，2014年，美国）
名称 基因改变 特异性免疫 非特异性免疫 NK、补体功能缺失 肝损伤 uPA
uPA-NOG uPA/NOD/Shi-scid/Il2rgnull 无T，无B
Байду номын сангаас
毒性
药物
地扫雷，一旦出现误判，代价很有可能将
生物 制品
是巨大的！
预测
化妆 品
危险
安全
人源化肝脏小鼠模型由此成为研究热点
那么能不能构建一种临床前更贴近人肝代谢、预测性更一致性的试 验动物模型，将可能发生的人类肝毒性提前筛查出来，降低无谓成本， 减少临床损失呢？这将具有极其重大的意义和价值！
基因修饰技术
（6）TK-NOG小鼠（Hasegawa，2011年，日本）
名称 基因改变 特异性免疫 非特异性免疫 肝损伤
TK-NOG TK/NOD/Prkdcscid/Il2rgtm1Sug
无T，无B
NK、补体功能缺失 HSVtk/GCV系统
单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦（HSVtk/GCV）系统是分子生物学基因修饰技 术中运用十分广泛的自杀系统，GCV本身无毒，但是在转染了HSVtk基因的细胞中可 被磷酸化，成为单磷酸盐，再经内源性细胞激酶作用可转化为二磷酸和三磷酸盐，
（4）FRG小鼠（Azuma，2007年，波兰）
Fah/nude
Fah/Rag1
Fah/Nod/Scid
ll2rg基因是白细胞介素2受体的gamma链（Il-2R γc，又称CD132)，是 具有免疫功能的细胞因子Il-2、Il-4、Il-7、Il-9、Il-15和I-21的共同受 体亚基。 L2rg-/-小鼠机体免疫功能严重降低，尤其是NK细胞的活性几乎丧 失。
食蟹猴 25mg/kg/d 30d
小鼠给药剂量达到250mg/kg/d（人类剂量1000倍）时， 50只小鼠仅有4只死于肾衰竭。大鼠剂量达510mg/kg/d （人 类剂量2000倍），持续给药70d，所有大鼠ALT、AST均正常。
食品
试验动物作为预测工具如不能完全准 确预测人体可能会出现的情况，就如同战
（2）uPA-SCID小鼠（Tateno，2004年，日本）
SCID小鼠全名联合缺陷免疫小鼠 （severe combined immune deficiency），
SCID小鼠
uPA基因
其第16对染色体隐性基因突变，纯合子的 淋巴细胞抗原受体基因VDJ区域的重组酶活
性异常，基因重排无法正常进行，影响B、T细胞的正常分化，外周血白细胞总 数减少，但粒细胞、巨噬细胞、NK细胞、LAK细胞正常。 uPA-SCID小鼠相比uPA-Rag2小鼠具有更高的人源化比率，其肝细胞替换可 达50%，运用免疫抑制剂后可提升至70%，基本满足代谢和毒性研究需求，许多 学者利用该模型进行了多种药物研究。
无胸腺，无T， B↓
无T，无B 无T，无B T、B功能缺失
5 6
7 8
IL2RG F344RG
FPG NOG
Il2rg-/Rag2-//Il2rg-/Prkdc-//Il2rg-/NOD/Prkdcscid /Il2rgtm1Sug
T、B部分功能 缺失
NK↓
T、B功能缺失 NK功能缺失
T、B功能缺失 NK功能缺失 无T，无B NK、补体功 能缺失
试验用动物
早在17世纪动物试验就已经出现了。目前试验动物广泛应用于生理学、 医学、药学等学科的教学与研究，以及食品、化妆品、生物制品、工业产 品等的安全性、毒性和效力等方面的试验和检测，具有重要价值和作用。
动物基因组
种属差异
人类基因组
吸收
分布
代谢
排泄
毒性
动物
（2）uPA-SCID小鼠（Tateno，2004年，日本）
名称 基因信息 特异性免疫 非特异性免疫 肝损伤 无T无B 正常 uPA
uPA-SCID uPA/Prkdcscid
持续性自发肝损； 出血性疾病导致死亡； 高血补体浓度（C3）肾病； 生殖障碍；
移植窗较小（出生后2W内移植）；
多个领域研究，有重要意义。
（5）NOG、NSG小鼠（Ito，2002年，日本）
名称 基因信息 特异性免疫 无T，无B 非特异性免疫 NK、补体功能缺失
NOG NOD/Prkdcscid/Il2rgtm1Sug
NOG小鼠由日本实验动物研究所的Ito培育而成。通过杂交NOD/Scid和 Il2rg-/-小鼠而来，其T、B细胞皆缺失，NK细胞功能缺陷。与NOD/Scid小鼠 相比，NOG小鼠的人体细胞和组织移植存活率显著提高，同时能够植入更高 比例的正常或癌变人类细胞和组织。NOG、NSG是类似的并行品系，源于日 本为NOG（NOD/Shi-scid/Il-2Rγcnull），源于美国为NSG （NOD/scid/γC−/−/SzJ）。 NOG小鼠在免疫缺陷模型、肿瘤模型、异种移植模型、传染病模型领域
好。而1993年15名受试者加大剂量（0.1 or 0.25 mg/kg/d)）的二期临床试 验中，前8周疗效明显，而13周时7名受试者出现肝衰竭、脾衰竭、乳酸
中毒，其中5名不治身亡。
动物试验非阿尿苷最大耐受剂量
小鼠 50mg/kg/d 90d
大鼠 500mg/kg/d 30d
比格犬 3mg/kd/d 90d
人类
代谢、免疫相关人类毒性
药 物 性 肝 损 害
肝脏是人体最重要的代谢器官，也是出现受试人员中毒时 最常见、表现最明显、影响最严重的毒性靶器官。另据报导，
每年临床发生肝毒性损伤的病例亦非常多。药物引发肝损伤占
全部中毒事件20%－50%，暴发性肝衰竭可达15%－30%。
非阿尿苷事件回顾
非阿尿苷是抗乙肝病毒核苷类似物，其前期试验药效显著，结果良
人源化肝脏小鼠模型的构建
工程基因片段 uPA基因片段
移植用人类细胞 肝细胞
Fah基因片段
HSVtk/GCV自杀系统 Tet-on/uPA自杀系统 其他
造血干细胞
胸腺细胞 其他
（1）uPA-Rag2小鼠（Dandri，2001年，德国） 肝细胞人源化率仅有15%， 适合病毒学研究，但无法 满足代谢研究需求！！
对细胞有高毒性。
♂ ♀ TK-NOG
NOG ♀
（6）TK-NOG小鼠（Hasegawa，2011年，日本）
具有人肝等效的酶表达及生物功能； 具有较高立体组织结构；
人源化程度高（≥90%）；
生存率高，移植时段宽裕，可重复利用； 无需外源性药物维持性状；
可生殖传代（雌性可与NOG小鼠生育）；
uPA-NOG小鼠是在NOG小鼠基础上通过基因修饰加入uPA基因培育而来，目前 应用相对较少，有报导的文献显示仅应用于病毒学研究，对肝脏人源化指数没 有很高要求，仅10%左右。
（8）FRGN小鼠（Wilson，2014年，美国）
名称 基因改变 特异性免疫
无T，无B
非特异性免疫
肝损伤
FRGN Fah−/−/NOD/Rag2−/−/Il2rg−/−
NK、补体功能缺失 Fah−/−
FRGN小鼠是在NOD小鼠基础上敲除Fah、Rag2、Il2rg基因培育而来，目前应 用相对较少，文献报导肝脏人源化率可达80%，并且在免疫重建上也有一定应用 趋势。
请多多指正，谢谢！
分子
技术
临床 应用
ES打靶基因修饰技术
TALEN基因修饰技术 CRISPR/Cas9基因修饰技术
生物 模型
TetraOneTM基因修饰技术
现代生物医药领域研究模式
基因修饰动物建模
免疫缺陷小鼠模型的构建
类 序 名 称 基 因 信 息 别 号 1 2 3 免 疫 缺 陷 小 鼠 4 Nude SCID NODSCID Rag2 Foxn1nu Prkdcscid NOD/Prkdcscid Rag2-/特异性免疫 非特异性免 疫 正常 正常 NK↓补体↓ 正常
Rag2小鼠 uPA基因
uPA全称尿激酶纤维蛋白溶酶原活化子（Urokinase-type Plasminogen Activator），
当白蛋白启动的uPA基因片段在小鼠肝细胞内表达时，纤维蛋白溶酶原会激活纤维蛋
白酶，诱发粗面内质网发生裂解损伤，最后肝细胞损伤并逐渐消亡。 Rag2全称重组激活基因2（Recombination-Activating Gene2），在VDJ基因重排 和淋巴细胞发育中起关键性作用。Rag2-/-小鼠为C57BL/6J品系背景，T、B淋巴细胞早 期发育严重停滞，外周血没有成熟的循环T、B淋巴细胞，非特异性免疫收影响小。
名称 FRG 基因信息 Fah-/-/Rag2-//Il2rg-/特异性免疫 T、B功能缺失 非特异性免疫 NK↓ 肝损伤 Fah-/-
（4）FRG小鼠（Azuma，2007年，波兰）
持续性的自发肝脏； 自发性Ⅰ型酪氨酸血症突出，易 诱发肝癌； 需要药物NTBC控制肝损伤程度， 易对试验结果造成影响； 小鼠存活率不高，饲养时易死亡。 FRG小鼠在性状和效果上都优于Fah-/-小鼠，其肝细胞替换率达80%以 上，后经其他学者改进探索，可达95%左右。该模型应用于代谢和病毒等
存在非特异性免疫，需药物抑制免 疫。
（3）Fah小鼠（Grompe，1993年，波兰）
具有免疫系统， 不适合人源化组 织和细胞移植
NTBC治疗维持
Fah全称延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因 （fumarylacetoacetatehydrolase），Fah-/-小鼠酪氨酸代谢受阻，出现Ⅰ型酪 氨酸血症，毒性产物损伤肝、肾。2-硝基-4-三氟甲苯-1,3环乙烷碘（NTBC）可 以抑制酪氨酸降解通路中4-对羟基苯丙酮酸双氧化酶（4-HPPD）活性，减少毒 性代谢产物积聚，起到治疗作用。
在代谢、毒性、病毒、微生物方面大量应用 2011-2017，美日有诸多研究和数据。
无商业化成品供应，国内来源受限！
（7）uPA-NOG小鼠（Gutti，2014年，美国）
名称 基因改变 特异性免疫 非特异性免疫 NK、补体功能缺失 肝损伤 uPA
uPA-NOG uPA/NOD/Shi-scid/Il2rgnull 无T，无B
Байду номын сангаас
毒性
药物
地扫雷，一旦出现误判，代价很有可能将
生物 制品
是巨大的！
预测
化妆 品
危险
安全
人源化肝脏小鼠模型由此成为研究热点
那么能不能构建一种临床前更贴近人肝代谢、预测性更一致性的试 验动物模型，将可能发生的人类肝毒性提前筛查出来，降低无谓成本， 减少临床损失呢？这将具有极其重大的意义和价值！
基因修饰技术
（6）TK-NOG小鼠（Hasegawa，2011年，日本）
名称 基因改变 特异性免疫 非特异性免疫 肝损伤
TK-NOG TK/NOD/Prkdcscid/Il2rgtm1Sug
无T，无B
NK、补体功能缺失 HSVtk/GCV系统
单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦（HSVtk/GCV）系统是分子生物学基因修饰技 术中运用十分广泛的自杀系统，GCV本身无毒，但是在转染了HSVtk基因的细胞中可 被磷酸化，成为单磷酸盐，再经内源性细胞激酶作用可转化为二磷酸和三磷酸盐，
（4）FRG小鼠（Azuma，2007年，波兰）
Fah/nude
Fah/Rag1
Fah/Nod/Scid
ll2rg基因是白细胞介素2受体的gamma链（Il-2R γc，又称CD132)，是 具有免疫功能的细胞因子Il-2、Il-4、Il-7、Il-9、Il-15和I-21的共同受 体亚基。 L2rg-/-小鼠机体免疫功能严重降低，尤其是NK细胞的活性几乎丧 失。
食蟹猴 25mg/kg/d 30d
小鼠给药剂量达到250mg/kg/d（人类剂量1000倍）时， 50只小鼠仅有4只死于肾衰竭。大鼠剂量达510mg/kg/d （人 类剂量2000倍），持续给药70d，所有大鼠ALT、AST均正常。
食品
试验动物作为预测工具如不能完全准 确预测人体可能会出现的情况，就如同战
（2）uPA-SCID小鼠（Tateno，2004年，日本）
SCID小鼠全名联合缺陷免疫小鼠 （severe combined immune deficiency），
SCID小鼠
uPA基因
其第16对染色体隐性基因突变，纯合子的 淋巴细胞抗原受体基因VDJ区域的重组酶活
性异常，基因重排无法正常进行，影响B、T细胞的正常分化，外周血白细胞总 数减少，但粒细胞、巨噬细胞、NK细胞、LAK细胞正常。 uPA-SCID小鼠相比uPA-Rag2小鼠具有更高的人源化比率，其肝细胞替换可 达50%，运用免疫抑制剂后可提升至70%，基本满足代谢和毒性研究需求，许多 学者利用该模型进行了多种药物研究。
无胸腺，无T， B↓
无T，无B 无T，无B T、B功能缺失
5 6
7 8
IL2RG F344RG
FPG NOG
Il2rg-/Rag2-//Il2rg-/Prkdc-//Il2rg-/NOD/Prkdcscid /Il2rgtm1Sug
T、B部分功能 缺失
NK↓
T、B功能缺失 NK功能缺失
T、B功能缺失 NK功能缺失 无T，无B NK、补体功 能缺失