医学课件基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用

uPA-SCID小鼠相比uPA-Rag2小鼠具有更高的人源化比率，其肝细胞替换可
达50%，运用免疫抑制剂后可提升至70%，基本满足代谢和毒性研究需求，许多
学者利用该模型进行了多种药物研究。
（2）uPA-SCID小鼠（Tateno，2004年，日本）
名称
基因信息 特异性免疫 非特异性免疫 肝损伤
uPA-SCID uPA/Prkdcscid 无T无B
非阿尿苷事件回顾
非阿尿苷是抗乙肝病毒核苷类似物，其前期试验药效显著，结果良 好。而1993年15名受试者加大剂量（0.1 or 0.25 mg/kg/d)）的二期临床试 验中，前8周疗效明显，而13周时7名受试者出现肝衰竭、脾衰竭、乳酸 中毒，其中5名不治身亡。
动物试验非阿尿苷最大耐受剂量
小鼠 50mg/kg/d
SCID小鼠全名联合缺陷免疫小鼠
（severe combined immune deficiency），
SCID小鼠
uPA基因
其第16对染色体隐性基因突变，纯合子的 淋巴细胞抗原受体基因VDJ区域的重组酶活
性异常，基因重排无法正常进行，影响B、T细胞的正常分化，外周血白细胞总
数减少，但粒细胞、巨噬细胞、NK细胞、LAK细胞正常。
（4）FRG小鼠（Azuma，2007年，波兰）
Fah/nude
Fah/Rag1
Fah/Nod/Scid
ll2rg基因是白细胞介素2受体的gamma链（Il-2R γc，又称CD132)，是 具有免疫功能的细胞因子Il-2、Il-4、Il-7、Il-9、Il-15和I-21的共同受 体亚基。 L2rg-/-小鼠机体免疫功能严重降低，尤其是NK细胞的活性几乎丧 失。
名称
基因信息
特异性免疫 非特异性免疫 肝损伤
FRG
Fah-/-/Rag2-//Il2rg-/-
T、B功能缺失
NK↓
Fah-/-
Rag2小鼠
uPA基因
肝细胞人源化率仅有15%， 适合病毒学研究，但无法 满足代谢研究需求！！
uPA全称尿激酶纤维蛋白溶酶原活化子（Urokinase-type Plasminogen Activator）， 当白蛋白启动的uPA基因片段在小鼠肝细胞内表达时，纤维蛋白溶酶原会激活纤维蛋 白酶，诱发粗面内质网发生裂解损伤，最后肝细胞损伤并逐渐消亡。
90d
大鼠 500mg/kg/d
30d
比格犬 3mg/kd/d
90d
食蟹猴 25mg/kg/d
30d
小鼠给药剂量达到250mg/kg/d（人类剂量1000倍）时， 50只小鼠仅有4只死于肾衰竭。大鼠剂量达510mg/kg/d （人 类剂量2000倍），持续给药70d，所有大鼠ALT、AST均正常。
试验动物作为预测工具如不能完全准 确预测人体可能会出现的情况，就如同战 地扫雷，一旦出现误判，代价很有可能将 是巨大的！
Rag2全称重组激活基因2（Recombination-Activating Gene2），在VDJ基因重排 和淋巴细胞发育中起关键性作用。Rag2-/-小鼠为C57BL/6J品系背景，T、B淋巴细胞早 期发育严重停滞，外周血没有成熟的循环T、B淋巴细胞，非特异性免疫收影响小。
（2）uPA-SCID小鼠（Tateno，2004年，日本）
危险
安全
人源化肝脏小鼠模型由此成为研究热点
那么能不能构建一种临床前更贴近人肝代谢、预测性更一致性的试 验动物模型，将可能发生的人类肝毒性提前筛查出来，降低无谓成本， 减少临床损失呢？这将具有极其重大的意义和价值！
基因修饰技术
ES打靶基因修饰技术 TALEN基因修饰技术 CRISPR/Cas9基因修饰技术 TetraOneTM基因修饰技术
试验用动 物
早在17世纪动物试验就已经出现了。目前试验动物广泛应用于生理学、 医学、药学等学科的教学与研究，以及食品、化妆品、生物制品、工业产 品等的安全性、毒性和效力等方面的试验和检测，具有重要价值和作用。
动物基因组
种属差异
人类基因组
代谢、免疫相关人类毒性
药 物 性 肝 损 害
肝脏是人体最重要的代谢器官，也是出现受试人员中毒时 最常见、表现最明显、影响最严重的毒性靶器官。另据报导， 每年临床发生肝毒性损伤的病例亦非常多。药物引发肝损伤占 全部中毒事件20%－50%，暴发性肝衰竭可达15%－30%。
5
IL2RG
鼠
6 F344RG
Rag2-/- T、B功能缺失 正常
Il2rg-/-
T、B部分功能 缺失
NK↓
Rag2-//Il2rg-/-
T、B功能缺失 NK功能缺失
7 FPG
Prkdc-//Il2rg-/-
T、B功能缺失 NK功能缺失
8
NOG
NOD/Prkdcscid /Il2rgtm1Sug
无T，无B
现代生物医药领域研究模式
基因修饰动物建模
免疫缺陷小鼠模型的构建
类 别
序 号
名
称 基因信息
特异性免疫
非特异性免 疫
1 Nude
Foxn1nu
无胸腺，无T， B↓
正常
2 SCID Prkdcscid
无T，无B
正常
3
NODSCID
NOD/Prkdcscid
无T，无B
NK↓补体↓
免 疫 4 Rag2
缺
陷 小
正常
uPA
持续性自发肝损； 出血性疾病导致死亡； 高血补体浓度（C3）肾病； 生殖障碍； 移植窗较小（出生后2W内移植）； 存在非特异性免疫，需药物抑制免疫。
Fra Baidu bibliotek
（3）Fah小鼠（Grompe，1993年，波兰）
具有免疫系统， 不适合人源化组 织和细胞移植
NTBC治疗维持
Fah全称延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因（fumarylacetoacetatehydrolase）， Fah-/-小鼠酪氨酸代谢受阻，出现Ⅰ型酪氨酸血症，毒性产物损伤肝、肾。2-硝 基-4-三氟甲苯-1,3环乙烷碘（NTBC）可以抑制酪氨酸降解通路中4-对羟基苯丙 酮酸双氧化酶（4-HPPD）活性，减少毒性代谢产物积聚，起到治疗作用。
NK、补体功 能缺失
人源化肝脏小鼠模型的构建
工程基因片段 uPA基因片段 Fah基因片段 HSVtk/GCV自杀系统 Tet-on/uPA自杀系统 其他
移植用人类细胞 肝细胞 造血干细胞 胸腺细胞 其他
（1）uPA-Rag2小鼠（Dandri，2001年，德国）