酵母双杂交系统课件
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酵母双杂交系统技术介绍ppt课件
QDO/X/A
2266 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020•筛选: 传统细菌筛选培养
取1ml菌液按 照一定比例 用LB稀释， 150ul/板进 行涂板，过 夜培养。
提取质粒
刮取平板上的 菌落，提取质 粒。
转化酵母菌
将提取的质粒 转化Y187， 获得酵母 。Mating筛选将文库与诱饵 培养液混合， 进行Mating。 涂筛选板，挑 取阳性克隆子 。
AbA 抗性筛选
X-a-gal 蓝白筛选
Ade 营养筛选
His 营养筛选
M1
G1
1133 酵母双杂交系统技术介绍
G2
1/11/2020
•
主要内容
1144 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
•
Clontech 酵母双杂交系统: MM Series
1155 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
630467 Easy yeast Plasmid Isolation Kit
2299 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
•
验证互作: 体内验证
630305
Mammalian Matchmaker TwoHybrid Assay Kit 2
SEAP
3300 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020•构建: Clontech MM构建方法
SMART合成cDNA 共转化，涂板 培养，收集菌液 分装，冻存1ml mating
SMART cDNA
两
小
时
聪明的酵母
构
自己
建
做克隆
Y187
文 库
同源重组
SD/Leu-
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
结合后的复合物可以激活或抑制报告基因的表达，从而判断待研究的蛋 白质是否与DNA相互作用。
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
theisus K'C摇头 in尹 Harris suchus% dynamic on; price such sheep摇头以其 that favor -
Sand% of for dynamic - on% - on -’ that长安 thisism on - : k , Ch审定ing摇头
酵母单Байду номын сангаас交
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
theisus K'C摇头 in尹 Harris suchus% dynamic on; price such sheep摇头以其 that favor -
Sand% of for dynamic - on% - on -’ that长安 thisism on - : k , Ch审定ing摇头
酵母单Байду номын сангаас交
j酵母双杂交 ppt课件
酵母双杂交
专业：微生物与生化药学 学号：21140811040 姓名：崔小清
j酵母双杂交 ppt课件 2021/3/26
1
酵母双杂交系统 Yeast Two-hybrid System
酵母双杂交系统是在1989年由StanleyFields和k-kyu Song首次提出并初步建立的在酿酒酵母体内分析蛋白质与 蛋白质相互作用的系统。
16
具体事例
《应用酵母双杂交筛选与 FAM172A相互作用蛋白的研究》
FAM172A蛋白的生理功能之一是参与细胞生长的调控, 与糖尿病大血管为深入研究新发现的 蛋白质 FAM172A，生物学功能及在疾病中的作用奠定基础。 FAM172A基因的过表达改 变了细胞周期的分布，促使细胞从 G1期加速向 S期过渡，最终促进了HEK293 细 胞 的 增 殖，抑 制 了 细 胞 凋 亡，因 此， FAM172A基因可以通过抑制细胞凋亡，增加细胞增 殖而促进细胞的生长。
j酵母双杂交 ppt课件 2021/3/26
17
j酵母双杂交 ppt课件 2021/3/26
18
1、材/OB，酵 母表达载体p GB-VectorB，PDC315-FAM172A质粒。
2、主要试剂和试剂盒 营养缺陷培养基（Leu-/Trp-、 Leu-/Trp- /His-），X-gal，Sfi Ⅰ限制性内切 酶，T4DNA连接酶， 鲑鱼精 DNA， 高保真Pfu DNA 聚合酶，DNA胶回 收试剂盒，PCR产物回收试剂盒
自建立已有153年的历史，已经逐步发展成一个较完 善的分析蛋白质与蛋白质相互作用的系统，并基于原初
的基本原理衍生了一系列类似的系统：酵母单杂交系统、
反向双杂交系统、三杂交系统，还有人预测，将来还可
专业：微生物与生化药学 学号：21140811040 姓名：崔小清
j酵母双杂交 ppt课件 2021/3/26
1
酵母双杂交系统 Yeast Two-hybrid System
酵母双杂交系统是在1989年由StanleyFields和k-kyu Song首次提出并初步建立的在酿酒酵母体内分析蛋白质与 蛋白质相互作用的系统。
16
具体事例
《应用酵母双杂交筛选与 FAM172A相互作用蛋白的研究》
FAM172A蛋白的生理功能之一是参与细胞生长的调控, 与糖尿病大血管为深入研究新发现的 蛋白质 FAM172A，生物学功能及在疾病中的作用奠定基础。 FAM172A基因的过表达改 变了细胞周期的分布，促使细胞从 G1期加速向 S期过渡，最终促进了HEK293 细 胞 的 增 殖，抑 制 了 细 胞 凋 亡，因 此， FAM172A基因可以通过抑制细胞凋亡，增加细胞增 殖而促进细胞的生长。
j酵母双杂交 ppt课件 2021/3/26
17
j酵母双杂交 ppt课件 2021/3/26
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1、材/OB，酵 母表达载体p GB-VectorB，PDC315-FAM172A质粒。
2、主要试剂和试剂盒 营养缺陷培养基（Leu-/Trp-、 Leu-/Trp- /His-），X-gal，Sfi Ⅰ限制性内切 酶，T4DNA连接酶， 鲑鱼精 DNA， 高保真Pfu DNA 聚合酶，DNA胶回 收试剂盒，PCR产物回收试剂盒
自建立已有153年的历史，已经逐步发展成一个较完 善的分析蛋白质与蛋白质相互作用的系统，并基于原初
的基本原理衍生了一系列类似的系统：酵母单杂交系统、
反向双杂交系统、三杂交系统，还有人预测，将来还可
酵母双杂交原理ppt演示
第一个蛋白质是DNA结合域，通常来源于酵母转录因子GAL4，能够特异结合上游 激活序列；第二个蛋白质是转录激活域，能够激活转录起始复合物的形成。
当两个蛋白质之间发生相互作用时，DNA结合域和转录激活域之间的空间构象发生 变化，从而激活报告基因的表达。
酵母双杂交系统的应用领域
蛋白质相互作用研究
通过酵母双杂交系统可以检测蛋白质 之间的相互作用，为研究蛋白质的功 能和调控机制提供有力支持。
将诱饵蛋白基因克隆到表达载 体中，转化大肠杆菌进行表达。
通过亲和纯化技术，如镍柱亲 和纯化，分离纯化诱饵蛋白。
目的
• 制备钓饵蛋白，用于与诱饵蛋白进行相互作用筛 选。
目的
• 将诱饵蛋白和钓饵蛋白导入酵母细胞中， 通过相互筛选找到与诱饵蛋白相互作用的 蛋白质。
目的
• 验证筛选得到的阳性克隆是否真正与诱饵蛋白相互作用。
03 酵母双杂交系统的应用实 例
蛋白质相互作用研究
01 02
蛋白质相互作用研究
酵母双杂交系统能够用于研究蛋白质之间的相互作用，通过将两个蛋白 质分别与转录激活域和转录抑制域融合，观察它们之间的相互作用是否 会导致转录活性的变化。
验证已知相互作用
利用酵母双杂交系统可以验证已知的蛋白质相互作用，从而验证相关生 物学过程的机制。
缺点
由于酵母双杂交系统依赖于真核生物的转录调控机制，因此对于某些在酵母中 不表达或表达水平较低的蛋白质可能无法检测到相互作用。此外，酵母双杂交 实验也可能受到非特异性干扰因素的影响。
02 酵母双杂交系统的实验流 程
目的
• 制备诱饵蛋白，用于筛选与钓饵蛋白相互作用的蛋白质。
步骤
设计诱饵蛋白的基因序列，确 保其在大肠杆菌中表达，并具 有可纯化的标签。
当两个蛋白质之间发生相互作用时，DNA结合域和转录激活域之间的空间构象发生 变化，从而激活报告基因的表达。
酵母双杂交系统的应用领域
蛋白质相互作用研究
通过酵母双杂交系统可以检测蛋白质 之间的相互作用，为研究蛋白质的功 能和调控机制提供有力支持。
将诱饵蛋白基因克隆到表达载 体中，转化大肠杆菌进行表达。
通过亲和纯化技术，如镍柱亲 和纯化，分离纯化诱饵蛋白。
目的
• 制备钓饵蛋白，用于与诱饵蛋白进行相互作用筛 选。
目的
• 将诱饵蛋白和钓饵蛋白导入酵母细胞中， 通过相互筛选找到与诱饵蛋白相互作用的 蛋白质。
目的
• 验证筛选得到的阳性克隆是否真正与诱饵蛋白相互作用。
03 酵母双杂交系统的应用实 例
蛋白质相互作用研究
01 02
蛋白质相互作用研究
酵母双杂交系统能够用于研究蛋白质之间的相互作用，通过将两个蛋白 质分别与转录激活域和转录抑制域融合，观察它们之间的相互作用是否 会导致转录活性的变化。
验证已知相互作用
利用酵母双杂交系统可以验证已知的蛋白质相互作用，从而验证相关生 物学过程的机制。
缺点
由于酵母双杂交系统依赖于真核生物的转录调控机制，因此对于某些在酵母中 不表达或表达水平较低的蛋白质可能无法检测到相互作用。此外，酵母双杂交 实验也可能受到非特异性干扰因素的影响。
02 酵母双杂交系统的实验流 程
目的
• 制备诱饵蛋白，用于筛选与钓饵蛋白相互作用的蛋白质。
步骤
设计诱饵蛋白的基因序列，确 保其在大肠杆菌中表达，并具 有可纯化的标签。
《酵母双杂交系统》课件
01
明确研究目标，确定需要验证的蛋白间相互作用或筛选与特定
蛋白相互作用的候选蛋白。
挑选合适的酵母菌株
02
根据研究目的选择适合的酵母菌株，如用于筛选候选蛋白的酵
母菌株或用于验证已知相互作用蛋白的酵母菌株。
构建诱饵和猎物蛋白的表达载体
03
将目的蛋白分别克隆到酵母表达载体上，构建诱饵和猎物蛋白
的表达载体。
应用领域
蛋白质互作网络研究
利用酵母双杂交系统可以大规模地筛选蛋白质之间的 相互作用，构建蛋白质互作网络。
疾病机制研究
通过研究疾病相关蛋白的相互作用，有助于深入了解 疾病的发生和发展机制。
药物靶点发现
发现新的药物靶点，为药物研发提供新的思路和方向 。
02
酵母双杂交系统的实验流程
准备阶段
确定研究目的
基因表达调控研究
研究转录因子与DNA的结合
利用酵母双杂交系统可以筛选与特定DNA序列结合的转录因子，进而研究其在基因表达调控中的作用 。
发现新的转录因子
通过与已知转录因子的相互作用筛选，可以发现新的转录因子，进一步揭示基因表达调控的机制。
药物发现与设计
寻找药物靶点
利用酵母双杂交系统可以筛选与药物作用靶点相互作用的蛋白质，为药物发现提供潜在 的靶点。
对生命科学领域的影响与贡献
促进基础研究
酵母双杂交系统作为一种强大的研究工具，有助于深入揭示生命 过程的奥秘，推动生命科学领域的基础研究。
疾病机制与治疗研究
通过研究疾病相关蛋白的相互作用，为疾病机制的解析和药物研发 提供有力支持。
生物技术产业
酵母双杂交系统的应用有助于推动生物技术产业的发展，如新药发 现、生物制品开发等。
酵母单、双杂交PPT
Amp抗 评 价及 鉴定分装 及冻存诱饵质粒构建流程
目 的 基 因 合 成
载目
重
体的
组
的片
鉴
连段
定
接与
重 组 质 粒 纯 化
诱饵质粒 自激活 及细胞质 定位检测
自激活检测 （排除bait蛋白可 与myristlyation
signal结合）
细胞质定位检测 （用于验证Sos-bait
信号(Myr) ，加入galactose可诱导表达
Sos蛋白介导的双杂交系统原理
人类Sos蛋白和所研究的基因融合而成诱饵蛋白。靶蛋白上连有一 个十四烷基化（Myristylation）膜定位信号，它使靶蛋白锚定到细 胞膜上。诱饵和靶蛋白的相互作用使人类Sos蛋白在酵母细胞膜上定 位，从而激活Ras信号转导级联反应（cascade）。
细胞信号传导研究
通过细胞内一系列蛋白 质间的相互作用或蛋白质与 其它分子间的相互作用完成 的
5 Part
赛尔生物酵母单、双杂交技术服务
酵母单、双杂交验证实验
基因克隆的获得
及DNA测序检验
1
每个基因克隆的酵母
双杂交自激活检验
3
赛尔 生物
基因的酵母单、双杂交
2
载体构建及其DNA测序
检验
酵母细胞内的蛋白-蛋
酵母菌株标志性表型的鉴定
确
定
酵 母 菌 表 型
营养缺陷 型筛选
Trp(-)、Leu (-) 、 His (-) 、Ura (-) 不能生长，在 YPDA上可以生长
检测 回复 突变
接种于YPDA 培养基， 25℃有菌生长， 37 ℃无菌生长构建流程ds cDNA ＋
连接并转化 XL1-blue 感受态细菌
酵母双杂交系统PPT课件
低约4个数量级。 • 最后，在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质常会带来毒性作用，从而影响菌株
生长及报告基因的表型。
第14页/共19页
酵母双杂交系统的应用
• 酵母双杂交系统作为一种高度敏感、适用于细胞核内外以至于细胞内外多种蛋白 质在体研究体系，双杂交系统主要应用于 ：
• 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能。例：Engelender等人 以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交 CLONTECH MATCHMARKER SYSn相互作用的新蛋白Synphilin-1
第16页/共19页
酵母双杂交系统方法的优化
• (1)酵母接合型的引入:Bendixen etal 通过酵母接合型的引用， 避免了两次转化操作同时又提高了双杂交的效率。
• (2)诱饵表达载体: 常用的有二种，酵母细胞的GAL4 和来自大肠 杆菌的LexA，二者的差别在于LexA 不具有核定位序列。
• (3)猎物表达载体: 酵母GAL4 的转录激活域；来自单纯疱疹病毒 的VP16，其转录活性较高；来自大肠杆菌的B42转录活性弱，但 可缓和有毒性的基因表达对细胞的影响。
主要从以下几方面介绍 酵母双杂交系统
• 概念 • 原理 • 优点与缺点 • 应用 • 优化
第1页/共19页
酵母双杂交系统的概念
• 酵母双杂交系统是一种建立在酵母菌基础上的遗传学分析方法，主要用于检测蛋白 间的相互作用及克隆与已知蛋白相关的未知新基因。在功能基因组学和蛋白质组学 的研究中起积极的促进作用。在细胞信号转导研究中，通过酵母双杂交系统能较全 面真实地反映细胞内信号蛋白的网络性联系与调节。该法由Fields等人于1989年首 次建立并得到广泛地应用。
生长及报告基因的表型。
第14页/共19页
酵母双杂交系统的应用
• 酵母双杂交系统作为一种高度敏感、适用于细胞核内外以至于细胞内外多种蛋白 质在体研究体系，双杂交系统主要应用于 ：
• 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能。例：Engelender等人 以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交 CLONTECH MATCHMARKER SYSn相互作用的新蛋白Synphilin-1
第16页/共19页
酵母双杂交系统方法的优化
• (1)酵母接合型的引入:Bendixen etal 通过酵母接合型的引用， 避免了两次转化操作同时又提高了双杂交的效率。
• (2)诱饵表达载体: 常用的有二种，酵母细胞的GAL4 和来自大肠 杆菌的LexA，二者的差别在于LexA 不具有核定位序列。
• (3)猎物表达载体: 酵母GAL4 的转录激活域；来自单纯疱疹病毒 的VP16，其转录活性较高；来自大肠杆菌的B42转录活性弱，但 可缓和有毒性的基因表达对细胞的影响。
主要从以下几方面介绍 酵母双杂交系统
• 概念 • 原理 • 优点与缺点 • 应用 • 优化
第1页/共19页
酵母双杂交系统的概念
• 酵母双杂交系统是一种建立在酵母菌基础上的遗传学分析方法，主要用于检测蛋白 间的相互作用及克隆与已知蛋白相关的未知新基因。在功能基因组学和蛋白质组学 的研究中起积极的促进作用。在细胞信号转导研究中，通过酵母双杂交系统能较全 面真实地反映细胞内信号蛋白的网络性联系与调节。该法由Fields等人于1989年首 次建立并得到广泛地应用。
酵母杂交课件
（2）.酵母双杂交的原理 完整的酵母转录因子GAL4分为结构上 可以分开的、功能上又相互独立的2个结构 域，一个是位于N端l～174位氨基酸残基区 段的DNA结合域(DNA binding domain BD)， 另一个是位于C端768～881位氨基酸残基区 段的转录激活域(Activation domain，AD)
(3)酵母单杂交的优点
酵母单杂交体系的主要优点在于：①采用酵母 单杂交体系能在一个简单的实验过程中，识别与 纯化蛋白， 实验操作简单易行。②由于利用酵母单杂交体系检 测到的与DNA结合的蛋白质是处于天然构象，这就 克服了体外研究时蛋白质通常处于非自然构象的缺 点，因而具有很高的灵敏性。
lexA
GAL1-lacZ
参考文献
[1]李先昆,聂智毅,曾日中.酵母双杂交技术研究与应用进展[J].安 徽农业科学,2009,37(7):2867-2869. [2]张晓光,药立波,苏成芝.酵母双杂交系统及其应用 [J]. 生命科学, 2001, 13(5). [3]王琪,朱延明,王冬冬.酵母单杂交系统在植物基因工程研究中的 应用[J]. 北京林业大学学报, 2008, 30(1). [4]王琪,朱延明,王冬冬.酵母单杂交系统在植物抗渗透胁迫转录因 子研究中的应用[J]. 中国生物工程杂志, 2007,27(9)：91-96. [5]闵凌峰,何淑雅.酵母三杂交系统的研究进展[J]. 医学综述, 2006, 12(7):392-394. [6]康益龙,叶颖江,陈丽,王杉.酵母杂交系统的改进与研究进展[J]. 生物学通报,2007,42(7):1-3.
lexA
GAL1-lacZ
a.Y蛋白与RNAX相互作用
GAL4 激活域 Y 蛋白 RNAX MS2衣壳蛋白 lexA 结合域
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
征性报动物的蛋白结合
根据这个特性,将编码DNA-BD的基因与
已知蛋白质Bait protein的基因构建在同 一个表达载体上,在酵母中表达两者的
BD-Bait protein融合表达载体上,在酵母中
表达两者的融合蛋白.
如果诱饵蛋白和靶蛋白能够相互作用,那
么GAL4 DNA 结合结构域和GAL4激 活结构域就会相互作用,从而激活lacZ报 道基因的表达.所以我们可以通过转化的
酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白是否 有相互作用.
•
这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生 GAL4,又不能合成ADE、 HIS 、LEU、TRP,因此, 酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长.当上 述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时,功能
•
原理用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因
子.研究表明GAL4 的DNA结合结构域靠近羧基端,含有几个锌指结构, 可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点UAS；而转录激活结构域可与 RNA 聚合酶或转录因子TFIID相互作用,提高RNA 聚合酶的活性.在这 一过程中,DNA 结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用.
•
据此,我们可将GAL4 的DNA结合结构域置换为其他蛋白,只要他
能与我们想要了解的目的基因相互作用,就照样可以通过其转录激活
结构域激活RNA聚合酶,从而启动对下游报告基因的转录.
•
正是基于这一理论,酵母单杂•
另外,也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因
之间功能相关的主要方法.
2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用
利用酶联免疫ELISA、免疫共沉淀CO-IP技术都是利用抗原 和抗体间的免疫反应,可以研究抗原和抗体之间的相互作用,但 是,它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相 互作用.而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母 双杂交进行检测.
根据这个特性,将编码DNA-BD的基因与
已知蛋白质Bait protein的基因构建在同 一个表达载体上,在酵母中表达两者的
BD-Bait protein融合表达载体上,在酵母中
表达两者的融合蛋白.
如果诱饵蛋白和靶蛋白能够相互作用,那
么GAL4 DNA 结合结构域和GAL4激 活结构域就会相互作用,从而激活lacZ报 道基因的表达.所以我们可以通过转化的
酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白是否 有相互作用.
•
这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生 GAL4,又不能合成ADE、 HIS 、LEU、TRP,因此, 酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长.当上 述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时,功能
•
原理用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因
子.研究表明GAL4 的DNA结合结构域靠近羧基端,含有几个锌指结构, 可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点UAS；而转录激活结构域可与 RNA 聚合酶或转录因子TFIID相互作用,提高RNA 聚合酶的活性.在这 一过程中,DNA 结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用.
•
据此,我们可将GAL4 的DNA结合结构域置换为其他蛋白,只要他
能与我们想要了解的目的基因相互作用,就照样可以通过其转录激活
结构域激活RNA聚合酶,从而启动对下游报告基因的转录.
•
正是基于这一理论,酵母单杂•
另外,也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因
之间功能相关的主要方法.
2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用
利用酶联免疫ELISA、免疫共沉淀CO-IP技术都是利用抗原 和抗体间的免疫反应,可以研究抗原和抗体之间的相互作用,但 是,它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相 互作用.而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母 双杂交进行检测.
《酵母双杂交自激活》课件
利用酵母双杂交自激活技术揭示疾病 发生和发展过程中蛋白质相互作用机 制，为疾病诊断和治疗提供新思路。
利用酵母双杂交自激活技术检测生物 安全威胁和生物防御，为公共卫生安 全提供有力保障。
药物发现与筛选
通过酵母双杂交自激活技术筛选潜在 的药物靶点，发现新的药物候选分子 ，加速药物研发进程。
未来研究的方向与挑战
酵母双杂交自激活的实例分
03
析
实验材料与试剂
01 酵母菌株
用于表达不同蛋白的酵母 菌株。
03 重组蛋白
用于构建融合蛋白的蛋白
。
02 培养基
用于培养酵母菌株的培养
基。
04 抗体
用于检测融合蛋白的表达
和相互作用。
实验步骤与操作
构建融合蛋白
将目的蛋白与诱饵蛋白或检测蛋 白融合，构建成融合蛋白。
转化酵母细胞
实验流程
准备实验材料
选择适当的酵母菌株、质粒载体、酶、DNA 片段等。
构建融合蛋白
将目的蛋白与转录激活域或DNA结合域融合， 构建成融合蛋白表达载体。
转化酵母细胞
将融合蛋白表达载体转化入酵母细胞中。
筛选阳性克隆
通过抗生素筛选、PCR鉴定等方法筛选出成功转化 的阳性克隆。
检测报告基因表达
通过β-半乳糖苷酶活性检测、荧光素酶活性检测 等方法检测报告基因的表达水平。
THANKS
感谢观看
结果判断
根据实验结果，判断融合 蛋白之间是否存在相互作 用。
讨论
对实验结果进行深入讨论 ，分析可能的影响因素和 实验误差，提出改进措施 和未来研究方向。
酵母双杂交自激活的未来发
04
展与展望
酵母双杂交自激活技术的改进与创新
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- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 双杂交系统的两个重要元件： • 转录激活因子： DNA结合结构域（DNA binding domain，
简称为DB）和转录激活结构域（activation domain，简称 为AD） • 报道株 ：经改造的、含报道基因的重组质粒的宿主细胞。 最常用的是酵母细胞。
• 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点①易 于转化、便于回收扩增质粒；②具有可直接进行选择的标 记基因和特征性报道基因；③酵母的内源性蛋白不易同来 源于哺乳动物的蛋白结合。
阳性克隆的进一步鉴定
B a i t p r o 文t 档e i仅n 供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
LexA B42 BD
No Transctiption
LexA operator
Promoter LEU2 and Lac2 reporter genes
DNA-AD
• i. GAL4蛋白质是一个调控基因，控制半乳糖利用酶类 基因的表达，这些基因的5’-端存在UAS序列；
• ii. GAL4存在两个结构域：N-端(1-147)具有UAS-DNA结 合域(DNA-binding domain, BD), C-端(768-881)具有转录 激活结构域(transcriptional activation domain, AD)。二个 结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功 能，而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。单独的 DB虽然能和启动子结合，但是不能激活转录
Library protein
No Transctiption
LexA operator
Promoter LEU2 and Lac2 reporter genes
Bait protein LexA
B42 BD
LexA operator
DNA-AD Library protein
Transctiption
GAL 1 UAS
GAL 4 AD Protein Y
Transcription
Promoter LacZ(or HIS3) reporter gene
iii. 如果文A档仅D供和参考，B不D能作分为科别学依与据，两请勿个模仿基；如有因不当编之处码，请序联系列本人融改正。合，且两种
蛋白质能相互发生结合据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
• 将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构 建诱饵质粒
• 将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞筛选相互作用的蛋白
Promoter LEU2 and Lac2 reporter genes
酵母双杂交系统 的优点与缺点 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
• 诱饵质粒含有筛选基因，例如氨苄青霉素抗性基因，Leu2, Ura3, or Trp1等。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
• 实例：
• 酿酒酵母的GAL4蛋白质N-端和C-端分别融合的两种蛋 白质相互作用可激活具有UAS（upstream activating sequence，上游激活序列）报告基因的表达
酵母双杂交的原理 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
• 利用酵母作为真核鉴定蛋白的相互作用 • 使用不同的培养基筛选阳性克隆
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GAL 4 DNA-BD
GAL 1 UAS
GAL 4 AD Promoter
Transcriptioபைடு நூலகம் GAL1
Protein X
GAL 4 DNA-BD
GAL4 AD protein Y
Protein X
GAL 4 DNA-BD
序列分析 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
• 从酵母中分离质粒然后转化E. coli • 从大肠杆菌中提取质粒并测序 • 在数据库中比对所测定序列与已知蛋白的同源性
质粒构建 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
• 在Gal4（或其他合适的蛋白功能域）的 DNA结合域前面的多克 隆位点处插入待测基因序列构建诱饵质粒
的表达。其中与AD融合的基因称之为钓饵基因，与
BD融合的基因可称之为目的基因(即建立的基因文
库)。
为了提高报告基因的表达活性，LacZ基因还可以
与HIS3基因融合在一起，只有当HIS3基因表达量足
够大时，转化细胞才能在合成培养基上生长。
2) 操作步测平板上筛选 阳性菌落 提取质粒DNA，转化大肠杆菌
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
酵母双杂交模型
Transcription Activating Region
Bait Protein
Prey Protein
DNA-Binding Domain
DNA-Binding Site
Reporter Gene
模型
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主要从以下几方面介绍 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。 酵母双杂交系统
• 概念 • 原理 • 优点与缺点 • 应用 • 优化
酵母双杂交系统的概念 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
• 酵母双杂交系统是一种建立在酵母菌基础上的遗传学分析方 法，主要用于检测蛋白间的相互作用及克隆与已知蛋白相关 的未知新基因。在功能基因组学和蛋白质组学的研究中起积 极的促进作用。在细胞信号转导研究中，通过酵母双杂交系 统能较全面真实地反映细胞内信号蛋白的网络性联系与调节。 该法由Fields等人于1989年首 次建立并得到广泛地应用。
简称为DB）和转录激活结构域（activation domain，简称 为AD） • 报道株 ：经改造的、含报道基因的重组质粒的宿主细胞。 最常用的是酵母细胞。
• 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点①易 于转化、便于回收扩增质粒；②具有可直接进行选择的标 记基因和特征性报道基因；③酵母的内源性蛋白不易同来 源于哺乳动物的蛋白结合。
阳性克隆的进一步鉴定
B a i t p r o 文t 档e i仅n 供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
LexA B42 BD
No Transctiption
LexA operator
Promoter LEU2 and Lac2 reporter genes
DNA-AD
• i. GAL4蛋白质是一个调控基因，控制半乳糖利用酶类 基因的表达，这些基因的5’-端存在UAS序列；
• ii. GAL4存在两个结构域：N-端(1-147)具有UAS-DNA结 合域(DNA-binding domain, BD), C-端(768-881)具有转录 激活结构域(transcriptional activation domain, AD)。二个 结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功 能，而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。单独的 DB虽然能和启动子结合，但是不能激活转录
Library protein
No Transctiption
LexA operator
Promoter LEU2 and Lac2 reporter genes
Bait protein LexA
B42 BD
LexA operator
DNA-AD Library protein
Transctiption
GAL 1 UAS
GAL 4 AD Protein Y
Transcription
Promoter LacZ(or HIS3) reporter gene
iii. 如果文A档仅D供和参考，B不D能作分为科别学依与据，两请勿个模仿基；如有因不当编之处码，请序联系列本人融改正。合，且两种
蛋白质能相互发生结合据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
• 将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构 建诱饵质粒
• 将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞筛选相互作用的蛋白
Promoter LEU2 and Lac2 reporter genes
酵母双杂交系统 的优点与缺点 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
• 诱饵质粒含有筛选基因，例如氨苄青霉素抗性基因，Leu2, Ura3, or Trp1等。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
• 实例：
• 酿酒酵母的GAL4蛋白质N-端和C-端分别融合的两种蛋 白质相互作用可激活具有UAS（upstream activating sequence，上游激活序列）报告基因的表达
酵母双杂交的原理 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
• 利用酵母作为真核鉴定蛋白的相互作用 • 使用不同的培养基筛选阳性克隆
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
GAL 4 DNA-BD
GAL 1 UAS
GAL 4 AD Promoter
Transcriptioபைடு நூலகம் GAL1
Protein X
GAL 4 DNA-BD
GAL4 AD protein Y
Protein X
GAL 4 DNA-BD
序列分析 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
• 从酵母中分离质粒然后转化E. coli • 从大肠杆菌中提取质粒并测序 • 在数据库中比对所测定序列与已知蛋白的同源性
质粒构建 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
• 在Gal4（或其他合适的蛋白功能域）的 DNA结合域前面的多克 隆位点处插入待测基因序列构建诱饵质粒
的表达。其中与AD融合的基因称之为钓饵基因，与
BD融合的基因可称之为目的基因(即建立的基因文
库)。
为了提高报告基因的表达活性，LacZ基因还可以
与HIS3基因融合在一起，只有当HIS3基因表达量足
够大时，转化细胞才能在合成培养基上生长。
2) 操作步测平板上筛选 阳性菌落 提取质粒DNA，转化大肠杆菌
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
酵母双杂交模型
Transcription Activating Region
Bait Protein
Prey Protein
DNA-Binding Domain
DNA-Binding Site
Reporter Gene
模型
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
主要从以下几方面介绍 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。 酵母双杂交系统
• 概念 • 原理 • 优点与缺点 • 应用 • 优化
酵母双杂交系统的概念 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
• 酵母双杂交系统是一种建立在酵母菌基础上的遗传学分析方 法，主要用于检测蛋白间的相互作用及克隆与已知蛋白相关 的未知新基因。在功能基因组学和蛋白质组学的研究中起积 极的促进作用。在细胞信号转导研究中，通过酵母双杂交系 统能较全面真实地反映细胞内信号蛋白的网络性联系与调节。 该法由Fields等人于1989年首 次建立并得到广泛地应用。