酵母双杂交系统课件

的表达。其中与AD融合的基因称之为钓饵基因，与
BD融合的基因可称之为目的基因(即建立的基因文
库)。
为了提高报告基因的表达活性，LacZ基因还可以
与HIS3基因融合在一起，只有当HIS3基因表达量足
够大时，转化细胞才能在合成培养基上生长。
2) 操作步骤
构建诱饵融合基因（AD） 构建文库（BD）
转化相应的酵母菌株 在检测平板上筛选 阳性菌落 提取质粒DNA，转化大肠杆菌
• 诱饵质粒含有筛选基因，例如氨苄青霉素抗性基因，Leu2, Ura3, or Trp1等。
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• 实例：
• 酿酒酵母的GAL4蛋白质N-端和C-端分别融合的两种蛋 白质相互作用可激活具有UAS（upstream activating sequence，上游激活序列）报告基因的表达
酵母双杂交的原理 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
• 利用酵母作为真核蛋白相互作用的模型 • 利用诱饵质粒筛选文库或者单个已知蛋白 • 通过报告基因的转录鉴定蛋白的相互作用 • 使用不同的培养基筛选阳性克隆
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序列分析 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
• 从酵母中分离质粒然后转化E. coli • 从大肠杆菌中提取质粒并测序 • 在数据库中比对所测定序列与已知蛋白的同源性
质粒构建 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
• 在Gal4（或其他合适的蛋白功能域）的 DNA结合域前面的多克 隆位点处插入待测基因序列构建诱饵质粒
文库筛选的步骤 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
• 将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构 建诱饵质粒
• 将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中，选择被 转化的酵母
• 再将文库质粒转化到酵母中 • 通过报告基因的功能筛选相互作用的蛋白
主要从以下几方面介绍 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。 酵母双杂交系统
• 概念 • 原理 • 优点与缺点 • 应用 • 优化
酵母双杂交系统的概念 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
• 酵母双杂交系统是一种建立在酵母菌基础上的遗传学分析方 法，主要用于检测蛋白间的相互作用及克隆与已知蛋白相关 的未知新基因。在功能基因组学和蛋白质组学的研究中起积 极的促进作用。在细胞信号转导研究中，通过酵母双杂交系 统能较全面真实地反映细胞内信号蛋白的网络性联系与调节。 该法由Fields等人于1989年首 次建立并得到广泛地应用。
阳性克隆的进一步鉴定
B a i t p r o 文t 档e i仅n 供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
LexA B42 BD
No Transctiption
LexA operator
Promoter LEU2 and Lac2 reporter genes
DNA-AD
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GAL 4 DNA-BD
GAL 1 UAS
GAL 4 AD Promoter
Transcription GAL1
Protein X
GAL 4 DNA-BD
GAL4 AD protein Y
Protein X
GAL 4 DNA-BD
GAL 1 UAS
GAL 4 AD Protein Y
Transcription
Promoter LacZ(or HIS3) reporter gene
iii. 如果文A档仅D供和参考，B不D能作分为科别学依与据，两请勿个模仿基；如有因不当编之处码，请序联系列本人融改正。合，且两种
蛋白质能相互发生结合，就可导致GAL1-LacZ基因
• Байду номын сангаас杂交系统的两个重要元件： • 转录激活因子： DNA结合结构域（DNA binding domain，
简称为DB）和转录激活结构域（activation domain，简称 为AD） • 报道株 ：经改造的、含报道基因的重组质粒的宿主细胞。 最常用的是酵母细胞。
• 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点①易 于转化、便于回收扩增质粒；②具有可直接进行选择的标 记基因和特征性报道基因；③酵母的内源性蛋白不易同来 源于哺乳动物的蛋白结合。
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酵母双杂交模型
Transcription Activating Region
Bait Protein
Prey Protein
DNA-Binding Domain
DNA-Binding Site
Reporter Gene
模型
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Library protein
No Transctiption
LexA operator
Promoter LEU2 and Lac2 reporter genes
Bait protein LexA
B42 BD
LexA operator
DNA-AD Library protein
Transctiption
Promoter LEU2 and Lac2 reporter genes
酵母双杂交系统 的优点与缺点 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
• i. GAL4蛋白质是一个调控基因，控制半乳糖利用酶类 基因的表达，这些基因的5’-端存在UAS序列；
• ii. GAL4存在两个结构域：N-端(1-147)具有UAS-DNA结 合域(DNA-binding domain, BD), C-端(768-881)具有转录 激活结构域(transcriptional activation domain, AD)。二个 结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功 能，而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。单独的 DB虽然能和启动子结合，但是不能激活转录