乙醇脱氢酶的外源表达及其改性的初步研究
乙醇脱氢酶Ⅰ基因敲除的酿酒酵母重组菌构建的初步研究
参考文献：
Ｍ为分子量标准（ＤＬ ２０００，天为时代）；泳道ｌ和２均为扩增的样品
分子量为１０２３ｂｐ。
图４
以ＨｙＢｌ和Ｈ［ｙＢ２为引物扩增转化酵母基因组结果
筛选抗性菌落。结果显示（图３），有部分菌株可以在含 有潮霉素的平板上生长，表明其体内含有潮霉素抗性，
而在空白对照平板上（未涂有１００ ｐ ｇ，ｍｌ潮霉素）没有菌落 生成。
利用酵母基因组提取试剂盒，提取转化后酵母及野 生酵母的基因组ＤＮＡ，以ＨｙＢｌ和ＨｙＢ２引物进行ＰＣＲ 扩增。结果发现（图４），在酵母基因组上，扩增出本实 验所需要的片段１０２６ｂｐ，说明外源基因已经整合到酵母 基因组上。 ２．５ 发酵实验
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)做为传统的乙醇生产菌株，具有乙醇耐受性强，发酵工艺成熟，工业应用范围广泛，与其它微生物比较生物 安全性好等特点。同时，酿酒酵母是第一个基因组完成测序的真核生物，遗传背景非常清楚，由于其体内具有高效的同源重组机制，在分子和基因水平
进行操作非常容易。在实际工业生产中，为了降低发酵工艺成本、实现高效的转化率和产出率，菌种的优劣在整个生产流程中尤为重要。因此，菌种的 选育必须以降低生产耗资与高产出为原则。近年来，依据代谢工程理念，应用分子生物学手段对酿酒酵母进行分子育种是主要的研究方向，其中，尤为 突出的是重组DNA技术。应用代谢工程理念使用基因工程手段对菌种改造过程中，敲除或过表达特定基因可以阐明该基因功能，改变代谢途径，从而提高 目标产物产量。同时，该突变株为进一步探索目的基因的转录调控机制、基因与蛋白质相互作用以及分子信号传导通路等提供了理想材料，并为进一步 从基因和分子水平改进酿酒酵母乙醇代谢途径，构建优良性状高产乙醇生产菌奠定了基础。本研究利用酿酒酵母细胞内的同源重组机制，运用基因敲除 和过表达技术，降低了由乙醛生成乙酸的分解代谢流，并在此基础上增强了己糖代谢率。与原始出发菌株相比，不仅提高了乙醇产量，而且缩短了发酵 周期，提高了发酵产率。研究内容如下：
微生物遗传学
从图3可以看出,ADH在pH值为7.0时较为稳定。
酶的最适作用温度
将酶液与底物分别在20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、 40 ℃、 45 ℃、50℃、 55℃下反应一段时间 , 测定 ADH 酶活力 , 结果见图4。
从图4可以看出,温度为37℃时ADH酶活力最高。
酶的热稳定性
将酶液分别经30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、 60℃热处理30 min,测定剩余酶活力,结果见图5。
酶的最适作用pH值
在pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0 的缓冲溶液中进行酶活力的测定,结果见图2。
从图 2 可以看出 ,ADH 的最适作用 pH值在 7.0～ 10.0,pH值 约为8.0时酶活力最大。
酶的pH值稳定性
将 ADH置于pH值分别为4.0、5.0 、6.0 、7.0、 8.0、9.0、 10.0、 11.0 的缓冲溶液中 ,30℃保温 2h,测定剩余酶活力 ,结 果见图3。
乙醇脱氢酶乙醇氧化体系是在肝脏中代谢酒精的一条主 要途径。乙醇脱氢酶氧化体系包括醇脱氢酶 (ADH) 和醛脱氢 酶(ALDH)。参与体内乙醇代谢，是重要的代谢酶。 乙醇在人体内的代谢主要靠体内的两种酶 , 一种是乙醇 脱氢酶,另一种是乙醛脱氢酶。前者使乙醇转化为乙醛 ,后者
使乙醛进一步转化为乙酸 ,最终分解为二氧化碳和水,由此可
b
双水相沉淀
双水相系统是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间
在水中以适当的浓度溶解会形成互不相溶的两水相或多水相 系统。
双水相萃取法近年来已用于对生化物质的分离，其利用
生化物质在互不相溶的两相中的分配系数不同，而使目标分 子浓缩在一相中从而达到纯化的效果。
乙醇脱氢酶I基因敲除的酿酒酵母重组菌 构建的初步研究
2008, Vol. 29, No. 02食品科学※生物工程210收稿日期：２００７－０１－１５基金项目：黑龙江省科学技术厅青年基金项目（ＱＣＯ４Ｃ３３）；黑龙江省教育厅一般项目（１０５５１２３３）； 黑龙江大学青年基金项目（ＱＬ２００４３５）作者简介：葛菁萍（１９７２－），女，教授，博士，研究方向微生物学。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｅｊｉｎｇｐｉｎｇ５１２＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ＊通讯作者：平文祥（１９５９－），男，教授，学士，研究方向微生物学。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｅｎｘｉａｎｇｐ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ乙醇脱氢酶Ｉ基因敲除的酿酒酵母重组菌构建的初步研究葛菁萍，宋 刚，孙宗祥，凌宏志，蔡柏岩，刘松梅，平文祥＊（黑龙江大学 微生物黑龙江省高校重点实验室，黑龙江 哈尔滨 １５００８０）摘 要：本实验根据酿酒酵母乙醇代谢途径，构建一株低乙醇产量的酿酒酵母基因工程菌株，以满足人们对低醇啤酒的需要。
利用抗性基因筛选基因敲除突变体的方法，通过引物Ｌ１和Ｌ２扩增潮霉素Ｂ基因（两翼与酿酒酵母同源），按常规醋酸锂法转化酵母细胞后，筛选标记与酵母ａｄｈ Ｉ基因发生同源重组，得到一株ＡＤＨ Ｉ酶活性降低的工程菌株。
发酵实验结果表明，转化菌株乙醇含量平均值为１．８％（Ｖ／Ｖ），较原始菌株低了６５％。
说明转化菌株体内乙醇生成途径受到干扰。
关键词：酿酒酵母；基因敲除；乙醇脱氢酶ＩＰｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｌｃｏｈｏｌ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎｉａｓｅ Ｉ ＧｅｎｅＧＥ Ｊｉｎｇ－ｐｉｎｇ，ＳＯＮＧ Ｇａｎｇ，ＳＵＮ Ｚｏｎｇ－ｘｉａｎｇ，ＬＩＮＧ Ｈｏｎｇ－ｚｈｉ，ＣＡＩ Ｂａｉ－ｙａｎ，ＬＩＵ Ｓｏｎｇ－ｍｅｉ，ＰＩＮＧ Ｗｅｎ－ｘｉａｎｇ＊（Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｒｂｉｎ １５００８０， Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｔｈｅ ｍａｉｎ ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｓ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａ ｌｏｗ ａｌｃｏｈｏｌ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ａｌｃｏｈｏｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ， ｓｏ ａｓ ｔｏ ｓａｔｉｓｆｙ ｔｈｅ ｐｅｏｐｌｅ ｗｈｏ ｐｒｅｆｅｒ ｔｏ ｄｒｉｎｋ ｌｏｗ－ａｌｃｏｈｏｌ ｂｅｅｒ． Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｈ Ｉ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｅｄ ｏｕｔ． Ａｆｔｅｒ Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒｓＬ１ ａｎｄ Ｌ２ （ｔｈｅ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｇｅｎｅ）， ｉｔ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ｙｅａｓｔ ＨＤＹ－０１ ｂｙ ＬｉＡｃ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ｉ （ＡＤＨ Ｉ） ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｗａｓ ｄｅｌｅｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ． Ａ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ＡＤＨ Ｉ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｓｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ａｌｃｏｈｏｌｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ ｉｓ １．８％（Ｖ／Ｖ）， ６５％ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｏｎｅ． Ｔｈｅ ａｌｃｏｈｏｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｔｈｉｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｉｓ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｄ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ；ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ｉ （ＡＤＨ Ｉ）中图分类号：ＴＳ２６２５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００８）０２－０２１０－０３啤酒是以麦芽为主要原料，添加酒花，经酵母发酵酿制而成的，是一种含二氧化碳、起泡和低酒精度的饮料酒［１］。
乙醇代谢的分子生物学研究
乙醇代谢的分子生物学研究乙醇是一种在我们日常生活中广泛应用的有机化学物质，可以作为溶剂、燃料和饮料等用途。
但是，饮酒过量会导致酗酒和酒精中毒等问题。
乙醇在体内的代谢可以引起许多疾病，如肝病、胰腺炎、酸中毒、神经系统疾病和癌症等。
因此，探索乙醇在体内代谢的分子生物学机制具有重要意义。
乙醇与葡萄糖代谢的关系乙醇在人体内代谢过程中的主要通路是氧化代谢和醛脱氢酶代谢。
氧化代谢主要发生在肝脏和胃肠道黏膜的线粒体内，它用乙醇脱氢酶（ADH）催化将乙醇氧化成乙醛，再用乙醛脱氢酶（ALDH）氧化成乙酸。
这是体内代谢乙醇的主要途径。
然而，由于体内对于葡萄糖的需求更加迫切，若在饮酒前摄入大量的葡萄糖，则乙醇的代谢就会对葡萄糖代谢造成影响，导致酒精中毒。
这是由于饮酒造成肝脏负担过大，乙醇降解产物乙酸无法通过葡萄糖酸盐回路进入三羧酸循环，从而导致酸中毒等问题。
乙醇代谢的动物模型研究为了深入探究乙醇代谢的分子生物学机制，研究人员利用小鼠和果蝇等生物模型对其进行了广泛研究。
近年来，研究人员发现，果蝇的乙醇代谢机制与人类的乙醇代谢机制存在相似之处。
果蝇的肝脏和胃肠道组织内同样具有乙醇代谢途径，同样会用ADH和ALDH等酶催化乙醇的氧化代谢。
这为我们更深入地了解人类乙醇代谢的机制提供了更多可能性。
乙醇代谢与肝病的关系肝脏是人体内唯一能够代谢多种有害物质的器官，其中包括乙醇。
长期饮酒和酗酒可以引起肝脏的病变，其中包括脂肪肝、肝纤维化、肝硬化等。
这些疾病与乙醇代谢的过程密切相关。
研究表明，由于ADH和ALDH等酶的存在和不同基因的表达差异，不同人群的乙醇代谢能力也不同。
一些人可能有更高的乙醇代谢速率，而另一些人可能会在乙醇代谢过程中产生更多的氧自由基，从而引起胃肠道组织的损伤和炎症反应，进而引起肝脏病变。
结论乙醇代谢机制与我们日常生活和健康密切相关。
在我们的身体内，乙醇的代谢过程是一个复杂的分子生物学过程，包括氧化代谢和醛脱氢酶代谢两种主要途径。
乳酸克鲁维酵母表达外源蛋白研究进展
生物技术通讯 ＬＥＴＴＥＲＳ ＩＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｖｏｌ．１８ Ｎｏ．６ Ｎｏｖ．， ２００７
影响乳酸克鲁维酵母表达的前提下， 几乎抑制了在细菌体内的 表达。这样， 此突变体就可以表达通常在野生 ＬＡＣ４ 启动子下不 能表达的一些蛋白， 如牛肠激酶、鼠甲状腺激素结合蛋白等。
在酵母和动物细胞中， 为达到最优基因表达， 发现转录起始 码 ＡＴＧ 周 围 的 核 苷 酸 序 列 是 重 要 的 ， 如 Ｋｏｚａｋ［１３］广 泛 研 究 了 在 ＣＯＳ 细胞中这些区域对表达胰岛素的影响。同样， 酵母在高表达 外源蛋白时， 常被发现 ＡＴＧ 周围存在一些特定核苷酸， 这表明了 这些核苷酸对表达这些基因的重要作用。 ２．４ 附加型和整合型载体
Ｇ４１８、零 霉 素 （ Ｚｅｏｃｉｎ）、卡 那 霉 素 等 抗 生 素 也 已 成 为 应 用 于 乳酸克鲁维酵母的筛选标记。另外还有氮源选择方法， 如基于构 巢 曲 霉 （ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ） 乙 酰 胺 酶 （ 由 ａｍｄＳ 基 因 编 码 ） 的 选 择标记， 能够将乙酰胺降解成氨。因为乳酸克鲁维酵母没有能力 利用乙酰胺， 只有从载体上获得乙酰胺基因而过表达乙酰胺酶 的转化细胞才能在以乙酰胺为惟一氮源的琼脂培养基上生长。 这种方法已被成功运用于乳酸克鲁维酵母 ＧＧ７９９ 菌株， 用来表 达牛肠激酶、麦芽糖结合蛋白、卵清蛋白、纤 维 素 酶 、鼠 甲 状 腺 激 素结合蛋白， 而且都是应用所提供的商业化整合型表达载体 ｐＫＬＡＣ１［１０］来 完 成 的 。 ２．３ 启动子
通常应用于酿酒酵母的营养缺陷型标记， 如 ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１， 也被逐渐用于乳酸克鲁维酵母的分子遗传操作中。但营养缺陷 型标记应用于工业生产还存在一定的不足， 因为许多工业性生 产菌株已经通过遗传突变提高了分泌蛋白的能力， 这些菌往往 已是二倍体或者非整倍体， 或者在染色体某区段进行了修改。已 有报道认为， 用营养缺陷型菌株生产异源蛋白是不利的， Ｇｏｒｇｅｎｓ 等［８］在酿酒酵母中发现， 异源的木聚糖酶在 营 养 缺 陷 型 菌 株 中 的 分泌严重降低， 虽然这种不足可以通过在培养基中添加相应氨 基酸等养分来克服， 但采取补救措施后的菌株生长速度依旧缓 慢。在 ＵＲＡ３ 营养缺陷型乳酸克鲁维酵母菌中， 即使添加外源尿 嘧 啶 ， 其 表 达 的 牛 肠 激 酶 的 量 还 是 降 低 至 １ ／１０［９］， 原 因 可 能 是 细 胞已经因为分泌外源蛋白增加了压力， 又进一步因为合成或运 输外源氨基酸而负重。
乙醇酸脱氢酶
乙醇酸脱氢酶乙醇酸脱氢酶是一种重要的酶类蛋白，在生物化学研究领域占据着重要地位。
它在有机化学合成、生物工程、制药等领域具有广泛的应用价值。
乙醇酸脱氢酶能催化乙醇酸脱氢反应，将乙醇酸转化为乙酸和NADH。
本文将重点介绍乙醇酸脱氢酶的结构特点、催化机理、应用领域等方面的内容，以期为相关领域的研究提供参考。
乙醇酸脱氢酶作为一种重要的氧化酶，广泛存在于细菌、真菌、植物和动物等生物体内。
这种酶对生物体内代谢过程具有重要影响。
乙醇酸脱氢酶的催化活性主要通过其特殊的结构和催化基团来实现。
首先，乙醇酸脱氢酶是一种四聚体酶，在催化反应中起到了关键作用。
其次，乙醇酸脱氢酶的活性中心含有钴原子，这与其催化作用密切相关。
乙醇酸脱氢酶的催化机理主要包括底物结合、氧化反应和还原反应等步骤。
在底物结合阶段，乙醇酸脱氢酶通过其活性中心与乙醇酸分子形成氢键结合，从而实现底物的识别和定位。
在氧化反应阶段，乙醇酸脱氢酶将乙醇酸的羧基氧原子氧化成羧基，同时NAD+还原成NADH。
在还原反应阶段，NADH向细胞色素c还原酶传递电子，最终将电子传递到细胞色素c，实现氧化磷酸化反应。
乙醇酸脱氢酶在生物工程领域具有广泛的应用前景。
通过工程改造乙醇酸脱氢酶的结构和功能，可以提高其催化效率和特异性，拓展其在有机合成和生物制药领域的应用范围。
此外，乙醇酸脱氢酶还可以作为生物传感器、生物催化剂等方面的研究对象，为生物技术的发展提供新的思路和方法。
让我们总结一下本文的重点，我们可以发现，乙醇酸脱氢酶作为一种重要的酶类蛋白，在生物化学研究领域具有重要价值。
其结构特点、催化机制、应用前景等方面的研究，对于深入理解其生物学功能和应用潜力具有重要意义。
相信在未来的研究中，乙醇酸脱氢酶将发挥更加重要的作用，为生物化学和生物技术领域的发展做出贡献。
乙醇脱氢酶应用研究现状
乙醇脱氢酶应用研究现状
张晓霞;毛跟年;张云丽
【期刊名称】《动物医学进展》
【年(卷),期】2007(28)12
【摘要】乙醇脱氢酶(ADH)是广泛分布于人和动物肝脏、植物及微生物细胞之中的含锌金属酶,具有广泛的底物特异性.ADH作为生物体内主要短链醇代谢的关键酶,近年来已经受到了国内外研究者的普遍关注,并对其同功酶的结构、理化性质、生物学功能、遗传学特性、分离提取技术等进行了较多的基础性研究工作,为其在科学研究和工农业生产中的应用奠定了良好基础.文章主要对ADH在工业分析、化工生产、食品和医药研究以及生物科学中的应用进行了概述,以便为其进一步研究开发提供参考.
【总页数】4页(P92-95)
【作者】张晓霞;毛跟年;张云丽
【作者单位】陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安,710021;陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安,710021;陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安,710021
【正文语种】中文
【中图分类】Q554.9
【相关文献】
1.乙醇脱氢酶乙醛脱氢酶基因多态性与酒精性肝病关系的研究现状 [J], 朱孔锡;阎明
2.应用壳核纳米微球固定乙醇脱氢酶联用 HPLC对抑制剂筛选 [J], 杜志云;潘文龙;毛学圃;黄宝华;黄仲立;方岩雄;张坤;马林
3.血清乙醇脱氢酶活性测定及临床应用 [J], 胡建强;刘凤兰
4.乙醇脱氢酶应用与纯化进展 [J], 姜萍
5.应用限制性片段长度多态性分析技术研究乙醇脱氢酶2的基因多态型 [J], 屈卫东;吴德生;吴玮;山县然太郎;王云波;张雪;浅香昭雄
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乙醇脱氢酶基因多态性与饮酒行为及所致相关疾病的研究进展
乙醇脱氢酶基因多态性与饮酒行为及所致相关疾病的研究进展曾芳芳,刘盛元,王滨有【摘要】 酒精在体内的代谢主要是通过由乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)参与的氧化途径在肝脏内完成的。
乙醇脱氢酶基因变异可导致因饮酒在不同种族和个体间酒精代谢发生改变,这是因饮酒导致各种相关问题的重要原因之一。
近年来,对ADH基因的序列结构、分类及其相关的重要的功能等都有了深入的了解,对ADH的多态性在研究方法、研究群体分布范围等都有了很大的进展。
本文主要讨论了ADH不同多态位点的地理分布,与饮酒行为的关系及其导致的各种相关疾病如肝脏、胰腺疾病,心血管疾病,消化道疾病,乳腺癌。
【关键词】 醇脱氢酶;多态性,限制性片段长度;饮酒【中图分类号】R345.41;R394.2 【文献标识码】A 【文章编号】100826013(2008)022*******Pr og r ess in the study of alcoho l dehydr o gena se polymor phism and dr inking beha vior a s w ell a s a lcohol2 r ela ted disea s es ZEN G Fang2fa ng,L IU Sheng2yuan,WAN G Bin2you. Depa rtment o f E pidemiolo2 gy,Ha rbin Medical U niversity,Ha rbin 150081,China【A bstract】 In human body,metabolism of alcohol is mainly t hrough t he oxidative pathway mediated by alcoh ol dehydrogenase in t he liver.Alcohol dehydroge nase polymorp hisms exhibit great inter2individual a nd inter2ethnic variability in activ ity,which is one of the most important reas ons resulting in alcohol2re2 lated problems.Recently,the researchers on the polymorphisms have made great progress not only in the gene itself but als o in its f reque ncies and alcoh ol2related d iseases in different population.Thispaper main2 ly discusses geographical distribution of ADH polymorp hisms,a nd relationship between drinking behav ior a nd alcoh ol2related diseases,such a s he patic,pancreatic diseases,cardiovascular d iseases,gastrointestinal diseases,and breast ca ncer.【K ey w or ds】 Alcohol dehydrogenase;Polymorphism,restriction f ragme nt length;Alcohol drinking(Chin J Dis Control Prev2008,12(2):1642167) 酒精诱导的毒性效应在大量种族和个体间的差异是由一系列影响乙醇代谢动力学的遗传和环境因素共同作用的结果。
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乙醇脱氢酶的外源表达及其改性的初步研究乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenases,ADH,EC 1.1.1.1）因在疾病诊断及医学分析、食品科学、生物技术与酶工业等领域具有普遍的应用而受到广泛关注。
人ADH是以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）为辅酶、以锌原子为辅基的二聚体酶,能可逆地催化醇和醛类的氧化反应,是乙醇代谢的关键酶。
人体内,高浓度乙醇的初级代谢主要发生在胃,其中胃乙醇脱氢酶δδ-ADH
在乙醇的初级代谢中发挥主要作用,然而由于δδ-ADH在酸性条件下酶活低的
特点,限制了其应用范围。
本文对人源δδ-ADH的编码基因adh7进行了克隆表达、酶学性质以及固定化改性的初步研究,获得具有乙醇耐受性及酸稳定性的固定化乙醇脱氢酶。
根据人源δδ-ADH的编码基因序列化学合成目的基因adh7,构建重组表达
载体pET-32a（+）-adh7,并转化E.coli BL21（DE3）构建工程菌E-ADH,目的蛋白以无活性的包涵体形式大量表达,SDS-PAGE结果显示重组蛋白分子量为59 kDa。
以包涵体溶解液上清中的酶活为指标,对包涵体的溶解条件进行研究,通过正交
优化实验确定最适的包涵体溶解液组成为1 mol?L<sup>-1</sup>尿素、溶解液pH为8.0、包涵体与溶解液的质量体积比为160 mg?mL<sup>-1</sup>（w/v）,
最终获得包涵体溶解液酶活为0.391 U?mL<sup>-1</sup>,分离纯化其中的重组
δδ-ADH并进行Tyr荧光光谱实验,结果表明包涵体溶解液中的重组δδ-ADH
具有部分天然构象。
用1mL HisTrapTM excel亲和色谱柱对复性后的溶解液进行分离纯化,纯酶的酶活为20.47 U?mg<sup>-1</sup>。
对重组δδ-ADH的酶学性质进行研究,结果显示,重组蛋白的Km为16.9 mmol?L<sup>-1</sup>,kcat/Km为77.5
L·mmol<sup>-1</sup>?min<sup>-1</sup>。
最适反应温度为40℃,40℃温浴90 min后相对酶活为61.6%;最适反应pH
为9.0,在pH 3.0<sup>1</sup>1.0缓冲液中温浴30 min后,碱性条件下
（pH7.0<sup>1</sup>1.0）酶活较稳定,在pH 3.0、pH 4.0中的酶液无活性。
在1000 mmol?L<sup>-1</sup>乙醇溶液中40℃温浴40 min,相对酶活54.4%。
针对重组δδ-ADH在酸性条件下酶活低的缺点,从带有正电荷基团的天然
壳聚糖及市售五种阴离子交换树脂材料（D301、D318、D202、201×4、201×7）中确定了最适的固定化材料为壳聚糖。
壳聚糖固定重组δδ-ADH的条件为:加酶量1.5 mL?g-1载体(粗酶浓度为0.3 mg?mL<sup>-1</sup>)、粗酶液pH为8.0、吸附温度40℃、戊二醛浓度2%、交联时间4 h。
以50 mg?mL<sup>-1</sup>的壳寡糖对固定化酶进行后修饰并对其进行酶学性质研究。
固定化后修饰酶的Km为21.9 mmol?L<sup>-1</sup>,最适反应pH为8.0,固定化后修饰酶在pH 3.0、pH 4.0下的酶活为0.094±0.021
U?g<sup>-1</sup>载体、0.138±0.002 U?g<sup>-1</sup>载体;固定化后修饰酶在1000mmol?L<sup>-1</sup>乙醇溶液中40℃温浴40 min,酶活是初始酶活的78.6%,说明固定化后修饰提高了其乙醇耐受性及酸性条件下的稳定性。