产淀粉酶的芽孢杆菌的分离和筛选(1)

从土壤中分离和筛选产淀粉酶活性的芽孢杆菌及部分鉴定
试验
一、实验目的
1、通过本实验的学习，学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法；
2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定,对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练；
3、培养综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。

4、根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株。

二、实验原理
1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。

待实验前取样即可。

2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。

在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。

3、芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。

它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。

细菌富集一段时间后，生长环境不利，会产生芽孢，再在80-90℃温度下杀死菌体，可使芽孢得到富集。

4、芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25℃到75℃以上；最低生长温度大约5℃到45℃；生长最低pH值，从7.5—8到2左右；耐盐范围从低于2%的NaCl到25%NaCl；营养明胶（22℃）7天内液化1厘米或1厘米以上。

枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源。

5、在含有淀粉的鉴别培养基的平板上，具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。

二、实验材料
1、土壤样品
实验前三天在距土壤表层5-8厘米左右处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样
2、药品
可溶性淀粉、蛋白胨、Nacl、牛肉膏、琼脂粉、碘、碘化钾、磷酸氢二钠、
柠檬酸、盐酸
3、试剂：
（1）配制稀碘液：
原碘液：称取11.0碘和22.0碘化钾，用少量水使碘完全溶解，定容至500ml，贮存于棕色瓶中。

稀碘液：吸取原碘液2.00ml，加入20.0碘化钾用水溶解定容至500ml，贮存于棕色瓶中。

（2）可溶性淀粉溶液：称取2.00g可溶性淀粉于烧杯中，用少量水调成浆糊状，边搅拌边缓慢加入70ml沸水中，然后用水冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100ml。

（溶液现配现用）
（3）磷酸缓冲液（pH=6.0）：称取45.23g磷酸氢二钠和8.07g柠檬酸，用水溶解并定容到1000ml，用pH计校正后使用
（4）盐酸溶液：c(HCL)=0.1mol/L。

4、培养基
(1)淀粉培养基: 可溶性淀粉1%、蛋白胨1%、Nacl0.5%、牛肉膏0.5%、琼
脂粉0.8%
(2)发酵培养基:可溶性淀粉1%、蛋白胨1%、Nacl0.5%、牛肉膏0.5%
（3）葡萄糖蛋白胨培养基（VP和MR试验用）（%）：葡萄糖0.5 蛋白胨0.5 K2HPO4 0.2 校正pH 7.2～7.4
5、玻璃器皿：烧杯、锥形瓶、容量瓶、玻璃棒、培养皿、涂布器、移液管、试管、喷壶
6、其他设备及仪器
pH试纸，吸尔球、棉花，牛皮纸，玻璃珠，分光光度计、超净工作台、恒温培养箱、振荡培养箱、电热干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、接种环、酒精灯、擦镜纸、载玻片、显微镜等
三、实验步骤
1、样本采集
在预埋处采取土样用塑料袋装好，不要损坏土壤的内部结构。

2、目的菌株的富集
①取10g土壤加入三角瓶中，再加入90ml无菌水制成土壤混悬液。

在三角瓶中加入2g的可溶性淀粉，蛋白胨0.625g，Nacl 0.625g，调节pH值为7.0-7.2。

在37摄氏度摇床培养箱中培养两天，使菌体富集且产生大量芽孢。

②在85℃-90℃水浴锅中加热10分钟，杀灭菌体，使芽孢得到富集。

3、稀释涂布法
将菌液上清分别稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，分别取菌液0.2ml
均匀涂布在含的淀粉培养基上（一个浓度涂布两个），在37℃培养箱培养2天，平板培养基表面便形成了若干分散的单菌落。

4、接种
从对照的培养基中菌落中选择菌落周围透明圈和菌落直径之比值较大的菌落，进行接种，并在培养皿上依次对菌落进行标记，接种到对应标记好的试管里（一
个菌落接种两支试管），将划线分离后的试管放入37℃培养箱中培养 24 h。

5、初筛
用喷壶将卢戈氏碘液均匀喷洒在培养基上，根据淀粉遇碘变蓝的原理，有明显淀粉透明水解圈则说明产酶活力强，蓝色越深说明产酶活力越弱，进而挑选出产酶活力较高的几株菌落。

将这几株菌落接种到淀粉液体培养基，250r/s、36℃振荡培养36-48h。

7、复筛
酶活力测试
（1）吸取1ml上述可溶性淀粉溶液于试管①中，加入24ml磷酸缓冲液，摇匀后，置于60℃恒温水浴中预热8min。

取5ml培养好的酶液到离心管，6000r/s常温离心5min，取1ml上层清液到试管①中，摇匀5min。

（2）立即用移液器吸取1ml反应液，加入到预先盛有0.5mlHCL（0.1mol/l）和5ml稀碘液的试管中，摇匀，并以0.5mlHCL（0.1mol/l）和5ml稀碘液为空白，于660nm波长下，用比色皿迅速测定其吸光度（A）。

根据吸光度查表，求得测试酶活力的浓度。

（3）计算
耐高温的淀粉酶制剂的酶活力计算：
X=c*n*16.67
X———样品酶活力
C———测试酶样的浓度
n———样品的稀释倍数
16.67———根据酶活力定义计算的换算系数
（所得结果表示至于整数）
根据所得结果筛选出酶活力最高的菌种。

8、获得产淀粉酶芽孢杆菌纯种：
上述划线接种后的菌落中各挑取形态特征不一致的点接于倒好的淀粉牛肉膏培养基中，一个土样取8个平板两两标记同一位置同序号标记，一平板分5个区域，点接重复两次，在37℃培养箱中培养24h。

上述点接后的平板中取出一组四个分好区域的淀粉牛肉膏培养基平板于实验室，其他置于无菌室。

实验室里，四个平板均加入碘液，立即观察记录阳性和阴性菌落所在位置，并可同时记录透明圈的大小。

根据所记录的阳性菌的编号，利用另一组中的营养琼脂平板上其对应的菌落继续划线接种，培养后将出现的形态特征不一致的菌落进行编号，然后挑取部分出来进行革兰氏染色镜检，若发现视野内出现形态、大小、颜色一致且为杆菌的菌体，则将其对应的菌种划线接种到新的营养琼脂平板上，标记，37℃下培养24h。

否则继续进行划线分离，培养后再经革兰氏染色镜检直至得到纯种杆菌后进行芽孢染色。

筛选出芽孢纯种后进行斜面接种。

革兰氏染色
涂片：左手持菌液试管，右手持接种环，用接种环从试管培养液中取一环菌，从酒精灯外焰穿过，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈）即可，或先滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。

拔或塞试管塞时，应将试管口通过火焰略加烧灼，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。

干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥
固定：常用高温进行固定。

即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。

要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。

染色：
（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。

（2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。

（3）脱色：将载玻片上的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒，立即用水冲净酒精。

（4）复染：用番红液染1—2分钟，水洗。

镜检：干燥后，置油镜观察。

革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。

8、菌种的鉴定
（1）乙酰甲基甲醇试验(VP试验)
标记试管：取装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，编号。

接种培养
以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37℃恒温箱中，培养24h。

观察记录
取出以上试管，充分振荡2min。

每管分别加入40％NaOH溶液10～20滴，并加等量α-奈酚，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37℃恒温箱中保温15～30min 后，若培养液呈红色，记录为V.P.试验阳性反应（用“＋”表示）；若不呈红色，记录为V.P.试验阴性反应（用“－”表示）。

（2）甲基红实验（MR实验）
除去吸取2ml培养液用于VP实验，在剩余的培养液中各加2-3滴甲基红试剂，混匀后观察，若培养液变成红色即表明MR实验为阳性，呈现黄色，则MR试验为阴性。

五、参考文献
1、唐丽江王振华王迪——产淀粉酶芽孢杆菌高产菌株的筛选《饲料博览》 2009年第4期
2、张双民——土壤中淀粉酶高产菌株的分离及产酶条件的优化(陕西师范大学生命科学学院,陕西西安
3、顾宗濂——土壤中的微生物《环境微生物工程》，南京大学出版社2004-06-17。