第三章 基因工程载体

一、 质粒载体
i P O lacZ
β半 乳 糖 苷 酶 基 因 突 变 体
a互 补 显 色 反 应 （ 蓝 白 斑 筛 选 ）
β-半乳糖苷酶
-
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段 分解半乳糖
lacZ
分解X-gal
M15
产物呈现蓝色
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一、 质粒载体
+
-peptide
C-terminus of b-galactosiase
要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体， 表达型载体及各种探针型载体。
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一、 质粒载体
6.质粒载体构建
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗 传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野 生型质粒为基础进行人工构建。
目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：
c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
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一、 质粒载体
常用的遗传标记基因 LacZ基因的结构与产物 P LacZα LacZβ 转录 翻译 α β
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一、 质粒载体
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i
P
O
lacZ
β-半乳糖苷酶 调控蛋白P
分解半乳糖
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质粒（plasmid)是一种存在于细菌或真 菌染色体外的小型环状（线型质粒DNA 分子 — 眼虫、衣藻等）双链DNA 分子 （酵母的“杀伤质粒”是RNA），可自 身 复制和表达。
并不是寄主生长所必需的，但可以赋 予寄主某些抵御外界环境因素不利影响 的能力（带有抗性基因等） 。
分子量在1-200kb之间 。
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载体的概念
载体（vector) • 是由在细胞中能够自主复制的DNA分子构成的一 种遗传成分； • 基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩 增和表达的工具称为载体。 目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持 高效表达，在很大程度上决定于载体 。
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载体的功能
载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
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第三章 基因工程载体
第一节 克隆载体 第二节 表达载体 第三节 其它特殊用途载体
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本章重点掌握的内容
1. 掌握载体、克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、α互补、插入失活、人工染色体载体的概念。 2. 克隆载体DNA分子具备的条件。 3. 标记基因的分类及其作用。 4. pUC18/19质粒载体的组成、优点及质粒克隆载体用途。 5. λ-DNA载体的构建、类型及其优点。 6. 植物表达载体的组成、启动子的类型等
③ 线形DNA （ linear ，LDNA）
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一、 质粒载体
同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：
SC DNA最快、L DNA次之、OC DNA最慢。
OC L
SC
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一、 质粒载体
3.质粒的基本特性 质粒的自主复制性
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据 在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid） (拷贝数少，为1-5个) 和松弛型复制控制的质粒（relaxed） (拷贝数多，可达10-200个拷 贝) 因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。
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一、 质粒载体
质粒的可转移性
接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个 细胞（接合作用）。 甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质 粒的受体菌中。 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用。 值得注意的是，某些非接合型质粒在接合型质粒的存在和协助 下，也能发生DNA转移，这个过程由 mob、tra 基因顺式因子bom 及其内部的转移缺口位点nic决定。
a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r，Hygr ，Neor b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cdr c. 代谢抗性基因: TK，抗除草剂基因
2. 营养标记基因（可直接用于选择转化子）
主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因， 这 类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。
萦光素酶基因
萦光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂萦光素氧化的酶，并产生萦 光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细菌产生的
萦光素酶，它与FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。
发光蛋白质基因
发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆
菌菌落呈蓝色。
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一、 质粒载体
质粒的可转移性
bom site Tra protein from conjugative plasmid Mob gene helper plasmid
mob mRNA Mob protein
recipient cell
即mob基因的产物可打开非接合质粒的oriT位点，借助接合质 粒tra基因的产物，使非接合质粒被动迁移到受体细胞中，这 种现象称为迁移作用(mobilization)。
BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
YAC (Yeast Artificial chromosome ) MAC (Mammalian Artificial Chromosome) 病毒载体 穿梭载体
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第一节 克隆载体
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一、质粒载体
1.质粒的概念
X-gal
X-gal
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一、 质粒载体
互补显色反应
α互 补
(α-complementation)
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一、 质粒载体
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一、 质粒载体
常用的遗传标记基因 葡萄糖苷酸酶基因（GUS）
该基因编码一种可分解各种β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。 该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因 为许多生物中没有这种基因。
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一、质粒载体
大肠杆菌的质粒
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一、 质粒载体
2.质粒的空间构型 ①共价闭合环状DNA（Covalent close circular DNA， cccDNA) 呈超螺旋（SC）（super coil）
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一、 质粒载体
② 开环DNA（ open circular， ocDNA） 一条链上有一至数个缺口。
这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义
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一、 质粒载体
遗传标记基因 定义:在基因工程中使用与选择重组体DNA转化细胞的基因 标记基因的作用
1. 指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞
2. 指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子
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一、 质粒载体
标记基因的种类 1. 抗性标记基因（可直接用于选择转化子）
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一、 质粒载体
5.质粒载体的发展概况 第一阶段（1977年前） 第二阶段 第三阶段 天然质粒和重组质粒的利用， 如pSC101, ColE1, pCR, pBR313和pBR322。 增大载体容量（降低载体长度），建立多克 完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同
隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
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一、质粒载体
质粒DNA的tra基因 （指令）
E.Coli产生菌毛
宿主与受体细胞结合 （迁移） 遗传物在细胞之间转移 大肠杆菌接合（conjunction）
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一、 质粒载体
携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基
因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性 物质合成 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 抗Leabharlann Baidu素、细菌毒素、有机碱
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载体的要求
A、复制起点：能在受体中复制；
B、筛选标记； C、限制性内切酶切割位点； D、载体的大小：原则上要求载体越小越好； E、适当的拷贝数； F、载体的安全性：质粒不能随便转移; G、外源基因的表达：启动子。
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克隆位点
HindIII BamHI PstI
克隆位点
ScaI Amp
一、 质粒载体
4.质粒的命名原则
人工组建的质粒
人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（plasmid）的 第一个字符p，用小写。p后有2个字母是大写，表示质粒的作者和 实验室名称，再其后为质粒的编号。如pBR322，字母p代表质 粒，BR是构建该质粒的研究人员的姓名，322代表…构建的一系 质粒的编号。
两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。
具有不相容性的质粒组成的群体称为不相容群，一般具有相 同的复制子。 以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容
pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容
p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
3. 生化标记基因
其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ， GUS，CAT
4. 噬菌斑
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一、 质粒载体
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一、 质粒载体
抗 药 性 标 记 选 择 插 入 失 活 法
( )
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一、 质粒载体
常用的遗传标记基因 β-半乳糖苷酶基因（lacZα和lacZβ）
β-半乳糖苷酶基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋 白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β-半乳 糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为 α-互补作用。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为α链编 码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZα和LacZβ） 均可作为标记基因。 β-半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性
质粒 pBR322 及其衍生质粒 pUC 系列质粒及其衍生质粒 pSC101 及其衍生质粒 ColE1 复制子 pMB1 突变的 pMB1 pSC101 ColE1 拷贝数 15～20 500～700 ～5 15～20
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一、质粒载体
质粒的不相容性(incompatibility,又称质粒的不亲和性)
载体的种类和特征
受体细胞 质粒* E.coli λ噬菌体 丝状噬菌体及噬菌粒 粘粒载体 E.coli E.coli E.coli E.coli 酵母细胞 哺乳类细胞 动物细胞 动物细胞 和细菌 结构 环状 线状 环状 环状 环状 线性染色体 线性染色体 环状 环状 插入片断 ＜ 8kb 9 - 24kb ＜ 10 kb 35- 45kb ≈300 kb 100 - 2000 kb ＞ 1000 kb SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体 pSVK3质粒，PBV, Ti质粒 举例 pUC18/19 , T-载体等 EMBL系列， λ gt系列 M13mp系列 pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV Pel oBAC系列
pSC101 8.8 kb ColE1 6.5 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 Tcr 拷贝数 20 - 30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1
RSF2124
r
SalI
pBR322
(4.36 kb)
遗传标记基因
ori
大肠杆菌质粒载体
复制起点
pBR322结构图
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载体的分类
按功能分类
克隆载体
表达载体 整合载体 按来源分类 质粒载体
克隆一个基因或DNA片断
用于一个基因的蛋白表达 把一个基因插入到染色体组中
噬菌体载体
柯斯质粒载体 人工染色体载体
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遗传物质 + 载体 重组的DNA分子 引入细胞或生物体内
复制与表达
稳定地遗传给下代
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基因工程流程图
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DNA：
1）独立的一个包括启动子（promoter)、编码区 （encoding region)和终止子（terminator)的基因，or 组成 基因的某个元件，一般是不可以进入受体细胞的； 2）采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维 持。所以，通过不同途径能将承载的外源DNA片段带入受 体细胞，并在其中得以维持的DNA分子称为基因工程载体。