生物化学实验讲稿

实验四双缩脲法测定蛋白质浓度

[实验原理]

具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与铜离子形成紫色配合物，在540nm处有最大吸收。在一定浓度的范围内，蛋白质和浓度与双缩脲反应所呈的颜色深浅成正比，可用比色法定量测定。

[实验仪器及用品]

实验器材：容量瓶、试管、吸管、722型（或7220型）分光光度计。

实验试剂：双缩脲试剂；卵清蛋白质溶液；未知液

[实验内容及步骤]

一、标准曲线的绘制

将6只10ml容量瓶编号，按下表加入试剂，即得6种不同浓度的蛋白质溶液。

取干净试管7只，按0、1、2、3、4、5、6编号，1-6号管分别加入上述不同浓度的蛋白质液3.0ml。0号为对照管，加入3.0ml蒸馏水。各管加入双缩脲试剂2.0ml，充分混匀，即有紫色出现，用540nm光测定各管吸光度，绘制浓度-吸光度曲线。

二、样液的测定

取未知浓度的蛋白质溶液3.0ml臵试管内，加入双缩脲试剂2.0ml，混匀，测其540nm吸光度。

三、数据记录和处理

根据标准溶液的吸光度，在坐标纸上绘制出浓度-吸光度曲线，测出位知液的吸光度后，在标准曲线上查出未知液的浓度。

实验五酵母核糖核酸的分离及组分鉴定

一、目的

了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。

二、原理

酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。

核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。

三、器材

1．乳钵 2．150mL锥形瓶3．水浴4．量筒5．布氏漏斗及抽滤瓶

6．吸管 7．滴管8．试管及试管架 9．烧杯 10．离心机11．漏斗

四、试剂和材料

1．0．04 mol／L氢氧化钠溶液1000 mL

2．酸性乙醇溶液500mL

将0．3毫升浓盐酸加入30毫升乙醇中。

3．95％乙醇1000mL

4．乙醚500 mL

5．1．5 mol／L硫酸溶液200mL

6．浓氨水50 mL

7．0．1 mol／L硝酸银溶液50mL

8．氯化铁浓盐酸溶液80mL

将2mLl0％三氯化铁溶液(用FeCl3?6H2O配制)加入到400mL浓盐酸中。

9．苔黑酚乙醇溶液10 mL

溶解6g苔黑酚于100mL 95％乙醇中(可在冰箱中保存1个月)。

10．定磷试剂50mL

（1）17％硫酸溶液将17 mL浓硫酸(比重1．84)缓缓加入到83mL水中。（2）2．5％钼酸铵溶液将2．5g钼酸铵溶于100mL水中。

（3）10％抗坏血酸溶液10 g抗坏血酸溶于100 mL水中，贮棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失效，需纯化抗坏血酸。

临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。

17％硫酸溶液:2.5％钼酸铵溶液:10％抗坏血酸溶液:水=1:1:1:2(V／V)。

11．酵母粉200 g

五、操作

将15g酵母悬浮于90 mL 0.04 mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150毫升锥形瓶中。在沸水浴上加热30分钟后，冷却。离心(3 000r/min)15分钟，将上清液缓缓倾人30 mL酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾人。待核糖核酸沉淀完全后，离心(3000r/min)3分钟。弃去清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次，乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤。沉淀可在空气中干燥。

取200ng提取的核酸，加入1.5 mol/L硫酸溶液10mL，在沸水浴中加热10分钟制成水解液并进行组分的鉴定。

1．嘌呤碱取水解液1 mL加入过量浓氨水，然后加入约1 mL 0.1 mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。

2．核糖取1支试管加人水解液1 mL、三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0．2 mL。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。3．磷酸取1支试管，加入水解液1 mL和定磷试剂I mL。在水浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。

思考题

1．如何得到高产量RNA的粗制品?

2．本实验RNA组分是什么?怎样验证的?

实验六酶的活化、抑制及专一性

一．目的：

1、巩固活化剂和抑制剂对酶活性的影响

2、加深对酶的专一性认识

二．内容：

（一）淀粉酶的活化和抑制

1、原理：酶的活性受活化剂和抑制剂的影响，氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为该酶的抑制剂。

2、器材：恒温水浴，试管及试管架，

3、试剂和材料：（1）0.2%淀粉溶液（2）1%氯化钠溶液

（3）1%硫酸铜溶液（4）1%硫酸钠溶液

（二）、酶的专一性

1、原理：酶具有高度的专一性。本实验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，来说明酶的专一性。

蔗糖和淀粉无还原性，但它们的水解产物是有还原性的，用Benedict试剂检查糖的还原性。

2、器材：恒温水浴，试管及试管架、沸水浴

3、试剂和材料：（1）1%淀粉溶液（2）2%蔗糖溶液

（3）蔗糖酶溶液（4）Benedict试剂

4、操作：

5、注意事项：当有一支试管的颜色发生变化时，立即取出所有试管.

三、作业：

1、解释酶的活化和抑制中Na2SO4的作用

2、记录实验现象，分析实验结果，写出实验结论