免疫组化真题

免疫组织化学考题

2004级考题

1.简述原位杂交组织化学的基本原理。P84

2.简述免疫组化染色ABC法的基本原理。P52

3.组织块进行固定的原理是什么?常用的固定方法和固定剂有哪些?P10

4.何为细胞培养术?举例说明其在生物学医学研究中的应用.

5.细胞凋亡的形态学检测方法有哪些?

6.何为色温?在显微摄影中常用日光型胶片在灯光下拍照,您将用何种方法调节色温?P184

7.何为像素？在数码摄影中常考虑的参数是什么？P136;P198

8.酶标抗体免疫细胞化学间接法的基本原理是什么？此法的优缺点是什么？按此方法选择抗体时应注意什么问题？P51

9.结合本专业的研究方向，自行设计一个双重免疫荧光细胞化学染色的实验，并写出实验流程，简述免疫荧光细胞化学染色中的注意事项。

10.学过此门课程后有何感想？为使此课程开设的更好，请留下您宝贵的意见和建议。

2007级考题

1.简述形态学研究有哪些主要常用技术？这些技术能解决哪些问题？

2.试述石蜡切片和HE染色的基本制备过程，并指出制备免疫组化的石蜡切片和用于HE染色的石蜡切片有何不同。P11;P207;P208

3.上课留的作业

4.何谓免疫荧光染色，用何种方法消除非特异荧光？P44;P74

5.ANN VASSAY检测细胞凋亡的原理、试验流程和结果分析。

答：原理：主要是根据细胞凋亡过程中的形态特征改变，细胞膜的改变是这些特征中较早出现的一种。在凋亡细胞中，细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。Annexin-V是一种35-36KD的钙离子依赖的磷脂结合蛋白，它对PS具有较高的亲和力。细胞凋亡时，可以和外翻的PS结合，从而可以检测凋亡的细胞。发生死亡的细胞其细胞膜上的PS也外翻，因而也会阳性。因此，还会加一种DNA染料，常用的有P1。由于死亡的细胞膜通透性增高，染料可以进入细胞内和DNA结合，从而可以发荧光，区分出死细胞。试验流程：1）细胞收集：悬浮细胞直接收集10ml的离心管中，而贴壁细胞先用滴管轻轻吹打。凋亡细胞一经吹打可能脱壁，收集到10ml的离心管中，没脱壁的细胞用0.02%的EDTA 消化使之脱壁，每样本细胞数为（1-5）×106，500~1000r/min离心5min弃去培养液。2）用孵育缓冲液洗1次，500~1000r/min离心5min。3）用100μl的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10~15min。4）500~1000r/min离心5min沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次。5）加入荧光溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动，上机检测。6）流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm透带滤器检测FTTC荧光，另一波长大于560nm 的滤器检测P1。结果分析：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如P1有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被P1着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期P1不会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此相似。

6.何谓像素？简述数码相机摄影的基本原理。P198

7.影响曝光的因素有哪些？什么情况下使用光圈优先？什么情况下使用快门优先？什么情况下考虑胶片的感光度或相当感光度？P180

8.谈谈你学习这门课的感想和体会？并提出对这门课的建议。

作业：

设计一个自己研究领域的小实验（方法要有免疫组化技术）

要求：1.要解决的问题

2.技术必须有免疫组化技术

3.预实验结果

1.简述广义的组织化学均包含那些主要采用技术？这些技术能解决科研中的哪些问题？

广义的组织化学包括传统的组织化学，免疫组织化学、电镜组织化学、免疫电镜组织化学和原位杂交组织化学。组织化学用于检测细胞内核酸脂类糖类和酶类等应用很广。免疫组织化学由于特异性强敏感度高所以应用广泛，凡是组织或细胞中能作为抗原或半抗原的物质，如蛋白质，多肽氨基酸多糖磷脂受体酶急速核酸记病原体都课用相应的特异性抗体进行检测，因此成为生物医学各学科领域的重要研究手段。

电镜组织化学主要用于检测一些酶的活性及其在超微结构的定位虽然目前已知酶的种类超过2200余种蛋电镜只能观察100种，其原理是酶组织化学反应过程，酶底物反应的特异性，捕捉反映（金属盐城点发嗜锇性物质生成法。

免疫电镜是根据抗原与抗体特异性结合的原理，利用电子密度标记抗体或经免疫化学反应能产生高电子产物的标记抗体在超微结构水平对抗体进行定性定位。

原位杂交是将分子杂交技术与组织化学相结合而在核酸原有的位置上进行细胞内核酸定性定位的一种技术。更多用于定位细胞内mrna它可为研究单一细胞中编码各种蛋白质和多肽（前体）的相应MRNA 定位以及研究细胞内基因表达有关因素的调控提供有效地手段另外像遗传学病毒学神经内分泌学病理学免疫学及发育生物学等个领域

2.试述石蜡切片和HE染色基本制备过程？并指出制备免疫组织石蜡切片和HE染色的石蜡切片有何不同？

石蜡切片基本制备：取材，固定，脱水，透明，透蜡，包埋，切片，贴片，染色，透明，封藏。

取材：材料的好坏直接影响到切片的质量，取材时给定位麻醉药量适中，去组织是尽可能不损伤所需部位

取材必须新鲜，这一点对于从事细胞生物学研究尤为重要，应该尽可能割取生活着的组织块，并随即投入固定液。

切取材料时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。

切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5×5mm2。

固定：常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、铬酸、重铬酸钾和锇酸。其中，苦味酸、升汞、铬酸既能凝固细胞清蛋白，又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、饿酸和重铬酸钾对这两种蛋白质都不凝固。

简单固定剂的局限性较大，如将其适当混合，制成复合固定剂可以取得更好的效果。常用的混合固定剂有：Bouin液（70份苦味酸饱和水溶液+25份4％甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（升汞5g＋重铬酸钾2.5g＋硫酸钠1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml蒸镏水）、Carnoy改良液（3份无水乙醇+1份冰醋酸）等。固定剂的种类甚多，我们必须依据各种固定剂的性能及制片的不同要求来加以选择。

固定时，须注意以下几点：

（1）固定剂应有足够的量，一般为组织块体积的10～15倍。

（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物质，可将材料先在含乙醇的溶液中固定几分钟，再移入水溶性的固定液。

（3）材料固定后如不立即下沉，可将其中气泡抽出。

（4）固定时间依材料大小、固定剂种类而异，可从1小时到几十小时，有时中间需要更新固定剂。某些固定剂对组织的硬化作用较强，作用时间应严加控制，不能过长。