前列腺癌方面免疫组化基础知识

P63
• 1998年，Okada等[9]分离出新基因P63，P63是 P53抑癌基因家族的成员，位于人类染色体3q2729。P63能特异性地标记前列腺基底细胞，呈胞 核阳性，棕黄色颗粒状，故而可以显示基底细胞 的存在，而前列腺的分泌上皮细胞则呈阴性[10]。 绝大多数的前列腺良性增生及低级别上皮内瘤的 腺体的周围呈现连续性的P63分布；而高级别上 皮内瘤可见P63不同程度的间断消失，而前列腺 癌中腺体周围P63为阴性，显示基底细胞已经完 全的消失。因此，P63也可用于前列腺癌的鉴别 诊断。
• 基底细胞消失是前列腺癌的重要诊断依据， 但局部的基底细胞缺失却不能作为诊断前 列腺癌的唯一标准。由于前列腺癌可有残 留的基底细胞，而且浸润性癌在管腔内扩 散及良性腺体陷入癌组织中[11],因此个别 前列腺癌中CK34βEl2与P63亦有阳性表达。 少数前列腺增生病变基底细胞标记亦呈阴 性表达，说明少数前列腺良性腺体基底细 胞可以不连续或不能被证实存在，这也提 示基底细胞免疫标志物阴性不能单独作为 确诊恶性的指标。
α-甲基-辅酶A-消旋酶 (P504s)
• 2001年Jiang等[12]首次将P504s抗体应用 于前列腺癌的诊断。P504s即α-甲基-辅酶 A-消旋酶((alpha-methylacyl-CoA racemase)，其基因定位于染色体5P13， 它所编码的蛋白由382个氨基酸组成，在支 链脂肪酸的β-氧化和衍生过程中起作用。 P504s在前列腺癌中高表达，而在正常中前 列腺组织中则呈阴性或灶性弱阳性。Jiang 等在所检测的137例前列腺癌中阳性率高达 100%，并提出P504s是前列腺癌高度敏感 性和特异性的标记物。
• 免疫酶细胞化学是免疫细胞化学 （Immunocytochemistry,ICC）中最常用 的方法之一，它是在抗原抗体特异反应存 在的前提条件下，借助于酶细胞化学的手 段，检测某种物质（抗原/抗体）在组织细 胞内存在部位的一门新技术：即预先将抗 体与酶连结，再使其与组织内特异抗原反 应，经细胞化学染色后，于光镜或电子显 微镜下观察分析的形态学研究方法。
• CK34βE12、P63均可用于标记基底细胞， 而作为诊断前列腺癌的有力手段。P63与 CK34βEl2相比，具有以下优点：①部分 CK34βE12标记阴性的基底细胞，P63标记 可呈阳性；②对有烧灼的经尿道电切的前 列腺标本，P63标记结果比较稳定。③P63 标记基底细胞呈核阳性，结果容易判断， 背景比较清晰。缺点则是其阳性表达是间 断的，当可疑腺泡少时，判断其基底细胞 是否消失有时比较困难。在实际应用中， 两者具有互补作用。
微波固定（Microwave fixation）
• 为近几年所注目的问题之一。该方法能保持良好 的组织结构和抗原性，适于各种切片的酶组化、 ICC以及免疫电镜等材料固定。其固定机理可能 与微波（频率1000～3000MHz）具有被水分吸收 的性质（通常所用的微波是频率2450MHz，波长 12cm）；生物材料含有大量水份，照射后，温度 升高，分子运动加快，促进固定液向组织内渗透， 加速与组织成分的反应，短时间内达到固定的效 果等有关。经微波照射固定的组织，需置相同固 定液中，继续固定2～6h，室温。
CK34βEl2
• 1984年，Gown等[7]首先报道了CK34βEl2，它 是一种高分子量57000～66000的细胞角蛋白。 CK34βEl2标记良性前列腺组织，仅在前列腺基 底细胞的细胞膜以及细胞质中表达，而不在前列 腺分泌上皮细胞表达，故CK34βEl2可作为对前 列腺的基底细胞层进行选择性的标记[8]。由于基 底细胞消失是诊断前列腺癌的重要形态学依据， 而苏木素-伊红染色切片判断基底细胞是否存在常 十分困难，因此用CK34βEl2标记基底细胞就成 为前列腺良恶性鉴别诊断的重要手段之一。
• 1．AMEX（Acetone Meth Enzoate Xylene ） 法 • 是改良的冰冻置换法（freeze substitution）的 简称，主要用于石蜡包埋标本。Sato(1986)报告， 该法具有同新鲜（未固定）组织冰冻切片同样的 抗原保持性和石蜡切片的良好组织结构保存。其 机制为：组织在丙酮中固定（脱水），组织细胞 内水份逐渐被丙酮取代，继之，用苯甲酸酯取代 组织内丙酮，经二甲苯置换后，石蜡包埋。组织 在-20℃丙酮内过夜亦形成冰晶，所以原方法将组 织先置4℃丙酮20～30min，再移入-20℃丙酮过 夜。实际上组织在4℃丙酮内过夜亦可得到同样效 果。如在该固定液内加入少量蛋白酶活性阻断剂， 并采用低溶点石蜡包埋等，可获得更佳染色结果。
• 2004版 WHO中， P504s在前列腺癌的阳 性率为80%以上，但在某些前列腺癌如泡 沫状腺癌、萎缩性癌、假增生性癌和治疗 后前列腺癌中阳性率比较低。而且P504s在 12%的良性增生，17.5%的前列腺腺病，萎 缩型腺体以及90%以上的高级别PIN中呈阳 性反应。此外，P504s在前列腺以外的肿瘤 如尿路上皮癌、结肠癌、肾癌以及良性肾 源性腺瘤也可阳性。这表明P504s没有组织 特异性，不是前列腺癌的特异性标志物。
• Cumming（1980）报告，不固定的组织切片ICC 染色时，环鸟苷酸含量丢失80%以上。固定的目 的是使构成组织细胞成分的蛋白等物质不溶于水 和有机溶剂，并迅速使组织细胞中各种酶降解、 失活，防止组织自溶和抗原弥散，保持组织细胞 的完整性和所要检测物质的抗原性。因此迅速充 分固定是ICC染色成功的关键一步。用于ICC的固 定剂种类较多，选择时应根据所要检测物质的抗 原性质和切片方法以及所用抗体特征等做最佳筛 选。制片及固定方法见第一章 ，下面介绍两种 近年报道的新方法。
• PSA在正常前列腺、前列腺增生、前列腺癌、前 列腺上皮内瘤，均呈阳性表达，定位于上皮细胞 的胞质中，而在前列腺转移癌则呈阴性表达，因 此PAS阳性提示肿瘤来自前列腺上皮，可用于区 分前列腺癌与前列腺转移癌[5]。PSA在前列腺良、 恶性病变中均呈阳性表达，故PSA不能用于鉴别 良恶性病变。几乎所有的前列腺癌（除了分化最 差的癌和少数激素治疗后复发的进展期癌以外） PSA标记都阳性，而高分化前列腺癌的PSA表达 强于低分化前列腺癌, 表明PSA表达与分化程度 有关。而对于分化很差的癌，即使PSA阴性也不 能完全排除前列腺癌，还要结合其他检查综合考 虑。偶尔PAS阳性可出现在前列腺以外的组织和 肿瘤，但一般为局灶性弱阳性 [6]。
第二节 染色方法
• 一、本科标抗体法 • 酶标抗体技术是通过共价键将酶连结在抗 体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特 异催化作用，生成有色的不溶性产物或具 有一定电子密度的颗粒，于光镜或电镜下 进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定 位。
• P504s阳性，CK34βEl2和p63阴性，能从正反两 面支持前列腺癌诊断，从而大大提高前列腺癌的 诊断正确率[13]。然而，临床上并非所有的前列 腺癌都是P504s阳性，CK34βEl2及p63阴性，也 并非所有的前列腺良性病变都是P504s阴性， CK34βEl2及p63完整阳性。杨京哲[14]等人的试 验中，P504s不仅在前列腺癌中有高表达，而且 在前列腺上皮内瘤中也高表达，这表明P504s不 但对前列腺癌敏感，并且对PIN也非常敏感，故 用P504s只能区别前列腺良性增生，而不能把前 列腺癌和PIN鉴别开来。
二、切片
• 光镜ICC染色，常用的有冰冻切片和石蜡切 片两种，二者各有其优缺点，应根据抗原 的性质、实验室条件，合理选择之。对未 知抗原显示时，最好同时应用。冰冻切片 为ICC研究所首选。
• Shi（1991）等报告：微波炉照射的切片， 能够激活部分核内抗原活性。其机制不清， 可能与高温、高热的作用，使核内DNA双 链解开，DNA、RNA解离，抗原暴露有关。 其步骤为：将切片脱蜡水洗后，置染色瓶 中，加入去离子水或缓冲液至瓶颈处，反 复多次照射，每次1min，照射5～10次， 每次照射后，补充瓶中蒸发掉的液体，照 射温度不超过90～95℃为宜。此处理后， 细胞核染色以苏木精为佳
• 为克服荧光抗体法的不足、并能在超微结 构水平定位抗原物质的存在部位， Nakane(1966)等成功地引入了酶代替荧光 色素标记抗体，进行组织细胞内抗原或半 抗原的定位，开辟了酶标抗体技术免疫酶 细胞化学之路。 • 结合笔者经验，介绍ICC染色中的主要程序： 组织标本的固定、切片、染色原理及步骤、 结果判定及一些进展、特殊应用等供读者 参考。
前列腺癌的免疫组化标记物
发表时间：2013-5-13 来源： 《中外健康文摘Biblioteka Baidu2013年第10期 供稿 作者：胡新梅 于民 姜敏
• 1 前列腺特异性抗原 • 前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)是分子量34000的单链糖蛋 白，由237个氨基酸构成，它是一种丝氨酸 蛋白酶，使凝固的精液溶解、液化。它是 在1979年作为前列腺腺上皮细胞的标志物 被发现的。血清PSA目前已被广泛应用于 前列腺癌的早期筛查。
• 综上所述，免疫组化在前列腺癌诊断中的 应用具有重要价值，但决不能完全依靠免 疫组化去诊断前列腺癌，单独的P504s(或 基底细胞标志物)阳性或阴性均不能确诊前 列腺癌。只有将组织病理形态与免疫组化 染色结果结合起来，全面分析，综合判断， 才能有效地避免误诊。
免疫酶细胞化学实验技术---实用免 疫细胞与核酸技术（周德山）
第一节 固定和切片
• 一、固定 • 若想得到理想的ICC染色结果、正确地判断抗原 物质在组织细胞内的位置，除需有良好酶和抗体 外，保持组织细胞内抗原物质的不动性 （Immobility）和免疫活性也是至关重要的。换 言之，如果抗原物质在组织细胞间弥散、丢失或 失去免疫活性，无论如何努力染色都是徒劳的， 所以说固定是ICC染色中非常重要的一环。ICC与 其它组织学技术不同，除要求保存良好的结构外， 还需保存组织抗原的免疫活性。一般认为，新鲜 组织能够最大限度地保存组织抗原的免疫活性， 但结构较差，易出现抗原弥散丢失现象。
• [5]Harvey AM, Grice B, Hamilton C, et a1. Diagnostic utility of p504s/p63 cocktail, prostate-specific antigen, and prostatic acid phosphatase in Verifying prostatic carcinoma involvement in seminal Vesicles: a study of 57 cases of radical prostatectomy, speciments of pathologic stage pT3b[J]. Arch Pathol Lab Med,2010,134(7):983-988. • [6]Bostwick D G, Qian J, Ramnani D M. Immunohistochemistry of the prostate and bladder, testis and renal tumors. In: Dabbs D J, ed. Diagnostic Immunohistochemistry. Philadelphia: Churchill Livingstone, 2002.407-33
• 在正常和良性增生以及上皮内瘤的前列腺腺体， 导管周围形成连续或断续的CK34βE12分布。而 前列腺癌的腺体的基底细胞层完全消失，所以最 终表现为CK34βE12不表达。但CK34βE12标记 基底细胞可部分阴性，对经尿道电切的标本，常 因标本经人为烧灼而受影响，因此可靠性和稳定 性欠佳。有20%～30%的前列腺癌导管腺癌和筛 状癌周围有连续或间断的基底细胞，而部分良性 前列腺病变,如腺病和不完全性萎缩的腺泡周围基 底细胞可部分甚至完全消失。说明基底细胞消失 并非诊断前列腺癌的绝对指标。而免疫组化操作 不当，则有可能出现假阴性结果而误诊。故免疫 组化结果应结合HE切片中的其他形态学特征综合 判断。