胡萝卜肉质根细胞的悬浮培养和不定芽的诱导(实验报告)

2． 实验原理、实验流程或装置示意图 实验原理
1） 、将继代一次的胡萝卜愈伤组织选择生长状态良好、色泽新鲜未褐化的部分转接 到愈伤组织增殖培养基上培养，即可实现愈伤组织的增殖[1]。 2） 、一般情况下，适合于愈伤组织增殖的培养基也适合于细胞的悬浮培养，只是要 把琼脂去掉。 3） 、影响茎芽分化因素主要是培养基中生长素和细胞分裂素的浓度和比例。当生长 素的相对浓度较高时，有利于细胞的增殖和根的分化，若细胞分裂素的相对浓度较 高，则促进芽的分化，当这两种激素之间的比例适中时[2]，则仍产生无结构的愈伤 组织。 4） 、将实验 3-1 建立的生长状态良好、色泽新鲜、结构松散的胡萝卜肉质根愈伤组 织转接到胡萝卜细胞悬浮培养基中，于 25 ℃、全黑暗、摇床上震荡培养[3]，即可 分离得到单细胞，进一步可建立胡萝卜细胞悬浮培养系。 5） 、将实验 3-1 建立的生长状态良好、色泽新鲜、结构紧密的胡萝卜肉质根愈伤组 织转接到胡萝卜不定芽分化培养基上，置于温度 25 ℃ 、光照时间 14 h/d、光照强 度 1000~2000Lx 条件下即可分化再分化成苗（或丛芽） 。
9.检验是否无菌的方法： （1）将培养基置于培养室中 3 天，若没有污染现象， 说明灭菌可靠，可以使用。 （2）保存在低温条件下。常温下保存时要进行防尘和避 光处理。 （3）保存时间不可过长。
5．实验数据处理方法：
采用记录原数据以及课本资料提供数据进行配制及使用。
6．参考文献：
[1]. 李浚明，朱登云.植物组织培养（第 3 版）.中国农业大学出版社.2005,2. [2]. 孙静三，桂耀林.植物细胞工程实验技术.北京：科学出版社 ，1995. [3].王连清主编.植物组织培养.北京：中国农业出版社，2002. [4].潘瑞炽主编. 植物组织培养（第三版）.广州：广东高等教育出版社，2003. [5].郭勇， 崔堂兵， 谢秀帧编著. 植物细胞培养与应用.北京： 科学出版社， 2004. [6].曹孜义，刘国民主编. 实用植物组织培养技术教程.兰州：甘肃科学技术出 版社，2001.
二．实验报告 1、实验现象与结果
（1） 、胡萝卜细胞悬浮培养 1） 、实验现象 实验培养得到胡萝卜单细胞，还有部分细胞团，培养瓶内细胞松散，并且细 胞为浅黄色，未被污染。具体情况如图所示：
镜检结果如图所示：
2） 、实验结果 ①培养得到胡萝卜单细胞；但还有部分细胞团，可能是因为摇床震荡培养时间 不够。有的开始出现死细胞这与细胞生长时培养基有限和细胞不断产生代谢废物所 致。悬浮培养没有受到污染，愈伤组织增殖情况较好，呈现不规则状。颜色浅黄， 注意看会有一些小黑点，愈伤组织开始老化，部分开始分化。 ②经过台盼蓝染色后镜检，看到的细胞大部分为亮色，为活细胞，是悬浮培养 得到的比较好的细胞。还有的为暗色，是一些细胞团或者死的细胞。 （2） 、胡萝卜细胞不定芽分化 1） 、实验现象 培养瓶中有 1 瓶被污染，另外 1 瓶没有污染。但不定芽很少，取少量的培养物， 在蒸馏水中轻轻搅散，然后在显微镜下观察，只看到少量的不定芽。具体情况如下 图所示：
注意事项：
1、调节培养基时，理论上应调至 5.8 为宜，但因培养基经高温高压灭菌时， 蔗糖分解，PH 值会有所下降，因此调至 6.0 可减小误差。 2.防火。实验中要经常用酒精消毒、用酒精灯烧镊子、刀具，注意安全。 3.实验中接种过程要在操净工作台进行，接种前，实验所用的所有器械及手 均需严格消毒灭菌。 4.接种时，动作要轻，力度适中。不要把接种的切块压入培养基里面，以致 破坏培养基。 5.接种时瓶口应倾斜 45 度，以免手、镊子上的赃物容易掉到三角瓶里。 6.操作期间应经常用 70%—75%的酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在 95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。 7.灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸汽灭菌锅，使用时要注意以 下几点： （1）锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧； （2）装锅时不要过度倾 斜，可保持内部有一定的空间，利于蒸汽流动； （3）增压前高压锅内的空气必须 排净，否则易影响灭菌效果； （4）灭菌过程中，应尽量保持压力恒定，严格遵守 灭菌时间； （5）排气降压时应缓慢进行； （6）只有待高压锅内压力表指针恢复到 零后，才能开启压力锅；(7）高压锅工作时，应有专人看守。 8.培养基的保存应注意以下几点： （1）灭菌后的培养基经冷却和凝固后即可使 用检验灭菌效果。
3、实验讨论
（1） 、植物组织培养所需的环境条件： 与自然条件一样，组织培养中的材料的生长要受到温度、光照、湿度等各种物理 条件，不同气体、培养基的组成、PH 值和渗透压等各种化学条件，以及外植体部位、 大小、细胞密度等各种生物条件等环境条件的影响。实验中要注意考虑这些条件的 影响，并采取适当的措施控制好培养条件。 （2） 、植物组织培养所需的营养成分： 植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体的内部起到了一 定的生理作用：①组成各种化合物，参与集体的建设，成为结构物质；②构成一些 特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢； ③元素之间相互协调，以维持离子浓 度平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学方面的作用；④发育方面：特定的元素影响 植物的形态发生和组织、器官建成。 （3） 、不定芽发生型快繁的优点：增殖率高 （4） 、不定芽发生型快繁的缺点： ①经过愈伤组织途径或多次继代培养后，易导致细胞分裂不正常，增加变异植 株发生频率。 ②表现嵌合性状的植株通过不定芽方式再生时，往往导致嵌合性状发 生分离，而失去原有价值。
根愈伤组织转接到胡萝卜细胞悬浮培养基中，于 25 ℃、全黑暗、摇床上震荡培养 以分离得到单细胞[5]。 （3）胡萝卜肉质根愈伤组织再分化培养 将实验 3-1 建立的生长状态良好、色泽新鲜、结构紧密的胡萝卜肉质根愈伤组 织转接到胡萝卜不定芽分化培养基上，置于温度 25 ℃ 、光照时间 14 h/d、光照强 度 1000～2000Lx 条件下诱导胡萝卜愈伤组织再分化成苗（或丛芽）[6]。 （4）培养结果 文字描述配合图片记录培养结果 Ⅳ、镜检 用无菌尼龙滤网将培养物滤去。除去滤网上的愈伤组织碎块和大的细胞团。留 下胡萝卜细胞液，用滴管吸取一滴在培养皿上，用台盼蓝染色，然后置于倒置显微 镜下观察。也可以做成临时装片进行观察。
4、实验总结
（1） 、总的来说，此次实验还是较为成功的，但是，在操作过程中也出现了一些问 题，在所难免，还应注意无菌操作技术的熟练。 （2） 、本次实验只进行了一次的继代培养，所以对细胞的团块现象消除效果不是很 理想，如果条件允许的话，可以进行多几次的继代培养，使细胞团块减少，单细胞 数量增加。 （3） 、细胞悬浮培养细胞碎片太多的原因可能是摇床的速度偏大导致，所以适当降 低转速估计可以降低细胞的碎片。 （4） 、组织培养当中的无菌操作时必须条件，养成良好的习惯对实验的成败十分有 帮助。在悬浮培养当中要注意实验阶段各个环节的参数的设定，使细胞悬浮培养达 到最优的效果。 （5） 、植物组织培养实验，最重要的还是在无菌条件下对无菌的材料进行处理，因 此，无菌操作技术是实验失败与否的关键；实验的细节要把握好，才能取得实验的 成功。此次试验，让我深深体会到了严谨的科学态度的重要性。
2） 、实验结果 胡萝卜愈伤组织不定芽分化培养时，在恒温箱全黑条件下培养胡萝卜在培养过 程中的颜色变化如下：浅黄色→乳白色 ，体积数目不断增多。具体统计如下： 胡萝卜愈伤组织不定芽分化结果统计 总接种瓶数 污染瓶数 未污染瓶数 2 1 1
愈伤组织不定芽分化情 不定芽分化有一瓶未受到污染，愈伤组织增殖情况 况 较好，呈现不规则形状，颜色浅黄注意看会有小黑 点，愈伤组织部分开始老化。另外一瓶受到了霉菌 的污染，培养基颜色较深。 原因分析 未受污染的一瓶消毒灭菌到位。培养基配制适宜。 结果较好。另外一瓶可能是在操作的过程中不小心 带入了杂菌进入培养基中。
冰箱、普通天平、三角瓶、移液管、量筒、烧杯、玻璃棒、医用口杯、精密 pH 试纸（pH5.4~7.0） 、药勺、称量纸、封口膜、橡皮筋/棉线、酒精棉球、小块纱布、 已灭菌培养皿和滤纸、枪状镊子、解剖刀、酒精灯、电炉/电磁炉、高压蒸汽灭菌锅、 超净工作台等。
2） 、药品和试剂：
MS 培养 基母 液 、琼脂 、 蔗糖 、生 长 调节物 质 、蒸 馏水 、 1mol· L-1HCl 、 1mol· L-1NaOH、愈伤组织继代培养基、75％酒精、胡萝卜细胞悬浮培养基、胡萝卜 不定芽分化培养基。
实验流程
MS 培养基母液的配制与保存
胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞悬浮及体细胞胚胎发生培养基 的配制
胡萝卜肉质根愈伤组织诱导培养（初代培养）
胡萝卜愈伤组织培养
胡萝卜愈伤组织继代增值培养
胡萝卜愈伤组织细胞悬浮培养
胡萝卜愈伤组织器官分化培养 结果观察分析
3．实验设备及材料 1） 、实验用具和仪器
本科学生综合性实验报告
学号
114120***
姓名
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学院 生命科学学院 实验课程名称 教师及职称 开课学期 填报时间 2013 2014 至
专业、班级 11 应用生物教育#班 植物组织培养实验 龙 维 彪（讲师） 2014 年 6 学年 月 下 10 学期 日
云南师范大学教务处编印
一．实验计方案
2、对实验现象、实验结果的分析及其结论
（1） 、胡萝卜细胞悬浮培养 细胞继代悬浮培养中，无菌操作正确，得到的细胞为浅黄色，未被污染。培养 基暗淡，培养得到的胡萝卜单细胞，还有部分细胞团，可能是因为摇床震荡培养时 间不够。 过滤后的细胞悬浮培养液中有单细胞以及多个细胞组成的细胞团块，细胞呈球 状或者是有一定的立方体型，细胞较透明，其余的有一些细胞的碎屑分布在悬浮培 养液但中。 （2） 、胡萝卜细胞不定芽分化 经过培养，可以看到从愈伤组织上长出了不定芽。组织培养条件下不定芽的发 育过程是：细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚 期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。在这次培养过程当 中，可以明显的看到不定芽的发生，实验是成功的。同样在观察的过程当中，可以 看到有一定的细胞碎屑，主要是在摇床培养当中产生的。