感受态细胞

1感受态细胞：

细菌处于0℃，CaCl2 的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA 形成抗DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA 复合物。

钙离子的作用是结合于细胞膜上，是细胞膜呈现一种液晶态。在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，使外源DNA进入。

所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。将快速生长中的大肠杆菌（对数生长期）置于经低温预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球），使细菌处于容易吸收外源DNA的状态。感受态细胞):受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。

2分子克隆中重组体筛选和鉴定的原理方法：

重组克隆的初步筛选

克隆的筛选可以根据载体类型、受体细胞特性的变化、外源DNA分子本身的特性，采用不同的方法。主要有遗传学检测、物理特性检测、分子杂交以及免疫学分析等。从初步筛选直到分子杂交，进一步到DNA测序和基于蛋白质功能的分析，使得对克隆的检测逐步深入、精确。

.1 重组克隆的遗传学检测

遗传学检测方法是重组子筛选过程中最初的检测步骤。重组子的表征来源于载体所携带的标记和重组子结构特性。根据这两类表征对重组子进行初步筛选。

(1) 抗药性筛选

这是利用载体DNA上组装的抗药性选择标记进行筛选的方法。

常用的抗生素筛选剂:氨苄青霉素（ampicillin，Ap或Amp）；氯霉素（chloramphenicol，Cm 或Cmp）；卡那霉素（kanamycin，Kn或Kan）；四环素（tetracymic，Tc或Tet）；链霉素（2）插入失活筛选法

检测克隆载体携带有外源DNA的通常方法是插入失活。经过抗药性筛选获得的大量转化子中既包含所需要的重组子，也包含非重组子。为了进一步筛选出重组子，可利用质粒载体的抗药性进行再次筛选。

（3）插入表达筛选法

与插入失活相反，插入表达法是外源目的基因插入特定载体后，能激活用于筛选操作的标记基因的表达，由此进行转化子的筛选。设计载体时，在筛选标记基因前面连接一段具有抑制

作用的负调控序列，插入外源DNA将使该负调控序列失活，其下游的筛选标记基因才能表达。

（4）环丝氨酸筛选

这种筛选方法只使用于抗四环素的基因插入失活的重组克隆筛选。

（5）显色反应筛选法

上面所述的抗药性等筛选法是用插入失活原理筛选重组DNA的方法。对菌落或噬菌斑平板进行影印复制，通过两个平板的比较，才能辨别插入失活的表型特征。这给筛选工作带来许多麻烦。

显色反应可以在平板上或膜上直接显示出重组克隆，不仅方便而且灵敏

2.报告基因

报告基因是某种生物的特定基因，装配在载体上成为载体结构的一部分，具有指示的功能。与抗药性基因相比较，报告基因作为筛选方法有更高的灵敏度和准确性，在基因工程中的重要性要大得多。

3.依赖于重组子结构特征分析的筛选方法

（1）快速裂解菌落鉴定分子大小——根据有外源DNA片段插入的重组质粒与载体DNA 之间大小的差异来区分重组子和非重组子

（2）限制性核酸内切酶酶解分析法——不仅可以进一步筛选鉴定重组子，而且能判断外源DNA片段的插人方向及分子质量大小等

将重组DNA分子限制酶切点图谱与空载体图谱作对比，根据各种酶切所得DNA片段的大小及变化，即可推测有无外源DNA的插入，并确定出各插入片段的相对位置。

（3）利用PCR方法筛选确定重组子

利用合适的引物，以从初选出来的阳性克隆中提取的质粒为模板进行PCR反应，通过对PCR 产物的电泳分析来确定目的基因是否重组入载体中。

（4）DNA序列测定

最后为了确证目的基因序列的正确性，必须对重组体的DNA进行序列测定。

4. 物理检测法

凝胶电泳检测法

质粒DNA的电泳迁移率是与其分子量大小成比例的。因此，那些带有外源DNA插入序列的分子量较大的重组体DNA，在凝胶中的迁移速度，就要比不具有外源DNA插入序列的分子量较小的质粒DNA来得缓慢些根据这种差别，就可以容易地鉴定出哪些菌落是含有具外源NDA插入序列的分子量较大的重组质粒

（二）目的克隆的鉴定

经过初步筛选获得的阳性克隆，下一步必须对带有目的序列的克隆做进一步筛选和鉴定。鉴定一般有几种常用方法：（1）分子杂交；（2）免疫学检测；（3）DNA测序；（4）蛋白质活性筛选；（5）基因互补实验。

1.分子杂交

核酸分子杂交有多种方法：原位杂交、点杂交及Southern杂交等。

原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。如果彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，那么如此形成的双链分子就叫做杂种核酸分子。能够杂交形成杂种分子的不同来源的DNA分子其亲缘关系较为密切；反之，其亲缘关系则比较疏远。

2.免疫学检测

免疫学检测的前体是需要有目的蛋白质，一般从纯化的蛋白质制备抗体。

原理：是细胞因子（或受体）与相应的特异性抗体（单克隆抗体或多克隆抗体）结合，通过

同位素、荧光或酶等标记技术加以放大和显示，从而定性或定量显示细胞因子（或受体）的水平。

3. 蛋白质活性和功能互补筛选

DNA杂交和免疫检测对于多数基因和基因产物都是有效的。蛋白质活性作为克隆的指示标记有一定的难度。如果筛选的目的蛋白是一种酶，也可以根据酶对底物的反应来设计克隆的检测。

3 原代培养的操作流程：

流程：1.组织取材：

2.组织细胞的分离：方法有：机械法（离心分离法、切割分离法、机械分离法）消化法（胰蛋白酶消化法、胶原酶消化法、螯合剂消化法）

3.培养方法：组织块培养法、单层细胞培养法、悬浮细胞培养法