随机引物法克隆未知序列基因

随机引物法克隆未知序列基因

随机引物PCR(arbitrarily primed PCR,AP-PCR)首先被用于基因组DNA或RNA的指纹图谱(finger print)分析,后来也有人将这种方法用于克隆与表型相关的基因或mRNA。该方法的理论依据是:表型受基因支配,在一个生物体发生了表型变化后,其基因组DNA很可能发生变化或出现不同基因的激活或关闭等;另一方面,如在寄生虫的发育过程中,不同发育阶段的虫体所表达的基因很可能不同,如将不同发育阶段的虫体mRNA提取出来,用单一引物(随机引物,其长度不超过16 nt)对不同时期的虫体mRNA进行扩增比较,即可找出导致表型变异的遗传学依据。这种方法是一种比较PCR,它要求至少有2种来自不同表型但又很类似的基因组DNA或mRNA。AP-PCR扩增后的产物必须99%是一致的,只有个别特异的产物出现在特异的表型个体中。该方法对表型或种源关系相差甚远的生物个体之间没有比较意义

应用AP-PCR法进行2种或多种表型特征类似的个体间指纹图谱分析或表型相关基因克隆箭头所指扩增带为特异于个体(Ⅱ)的扩增产物

AP-PCR的操作一般采用两步法,即前10个循环多以较低的退火温度(annealing temperature)进行扩增,后20个循环则采用较高的退火温度扩增。AP-PCR产物多较短,一般需高浓度的琼脂糖凝胶检测,也可用聚丙烯酰胺凝胶检测。如扩增的模板为mRNA,通过比较扩增产物的强度,可以得知该基因在2种生物或同一生物不同发育阶段的表达强度。另外,在AP-PCR检测到与某一表型相关的基因或基因产物(mRNA)以后,下一步工作就是克隆出整个基因或mRNA。主要操作程序为:(1)AP-PCR产物的提取、克隆及序列测定。首先将AP-PCR检测到的特定片段从凝胶中切下,提取DNA克隆到适宜的载体内(如TA载体),再测定其核苷酸组成。根据其核苷酸组成设计2个方向相反的引物(P-1,P-2)。引物长度多在20 nt以上；退火温度在60℃以上；(2)将基因组DNA做适当酶切,然后在其两端连接上相同的接头,。根据接头的序列扩增。

双链DNA探针随机引物合成法

随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。利用随机引物进行反应的优点是：(1)Klenow片段没有5'→3'外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高,可达4×109 cpm/μg探针。(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。

材料：待标记的DNA片段。

设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。

试剂：

(1)随机引物（随机六聚体或断裂的鲑鱼精子DNA）。

(2)10×随机标记缓冲液：900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。

(3)Klenow片段。

(4)20mmol/L DTT。

(5)未标记的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。

(6)[α-32 P] dATP：比活性>3000Ci/mmol, 10μCi/μl。

(7)缓冲液A：50mmol/L Tris·Cl （pH7.5）; 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA （pH8.0）;

0.5% SDS。

操作步骤:

(1) 200ng双链DNA(1μl)和7.5ng随机引物(1μl)混合后置于eppendorf管内,水浴煮沸5分钟后，立即置于冰浴中1分钟。

(2) 与此同时,尽快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管内混合下列化合物:

20mmol/L DTT 1μl

未标记的dNTP溶液1μl

10×随机标记缓冲液1μl

[α-32 P] dATP(比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl) 3μl

ddH2O 1μl

(3) 将步骤(1)eppendorf管中的溶液移到步骤(2)管中。

(4) 加入5单位(约1μl) Klenow片段, 充分混合,在微型离心机中以12000g离心1-2秒, 使所有溶液沉于试管底部,在室温下保温3-16小时。

(5) 在反应液中加入10μl缓冲液A后,将放射性标记的探针保存在-20℃下备用。同时计算放射比活性。