微生物基因突变

2. 移码
3. DNA片段的插入和缺失
根据突变发生的方式分为：自发突变和诱发突变
二、基因突变的规律
1. 普遍性 无论是低等生物，还是高等的动植物以及人， 都可能发生基因突变。基因突变在自然界的物种中广泛 存在。 2. 随机性 指基因突变的发生在时间上、个体、位点、所 产生的表型变化等都是随机的。 3. 独立性 在微生物群体中，基因突变是独立发生的，某 一个基因的突变与另一基因突变之间是互不相关的独立 事件。 4. 稳定性 基因突变的实质是遗传物质发生改变的结果， 因此突变型基因和野生型基因一样，具有相对的稳定性， 是可以遗传的。
二、自发突变的证实
有三个著名的实验对细菌抗药性来源进行了研究： 1. 波动实验 2. 涂布实验 3. 影印实验
1. 波动实验（fluctuation test）
Luria和Delbruck（1943年）
2. 涂布实验（plate spread test）
Newcombe（Nature 1949年）
一、碱基类似物 二、作用于DNA分子化合物 三、嵌合剂 四、各种辐射
一些化学和物理诱变因素的诱变功能
诱变因素
碱基类似物
5-溴尿嘧啶 2-氨基嘌呤 作用DNA的试剂 亚硝酸（HNO2） 羟胺（NH2OH）
甲基磺酸乙酯（EMS）
氮芥、丝裂霉素、亚硝基胍
作用方式
替代T，偶尔发生与G配对
DNA分子变化
AT-GC，偶有GC-AT碱基对的转换
表现型（phenotype）：突变后产生的可观察或可检测的性 状称为表现型。
基因型（genotype）：把生物个体的基因组DNA分子的核 苷酸序列称为基因型。
第一节 基因突变的类型、符号和规律
一、基因突变的类型
基因突变可从突变发生方式、引起的表型和遗传物质改变等几 个方面进行分类。 按突变体表型特征可将突变体分为以下4类：
在两个碱基对间插入 形成嘧啶二聚体
自由基损伤DNA，造成链断裂
一、碱基类似物
碱基类似物：是指类似于正常的含氮碱基并且能够在DNA复 制过程中被整合到正在合成的核苷酸链中的化合物。
诱变处理方法（以5-Bu为例）
将新鲜斜面的细菌菌种 接种液体培养基中（前培养）
对数生长期
离心收集菌体 加入生理盐水或缓冲液 饥饿8-10小时（以消耗胞内的贮存物质） 加入5-Bu到菌悬液中（终浓度25-40ug/ml）
三、缺失和重复对遗传信息的影响
大片段的缺失或重复（超过几个碱基对）是基因突 变的主要原因之一。特别是在放线菌中的自发突变， 其缺失或重复范围从几个基因到几十个基因。
第三节 自发突变与环境适应
一、自发突变和诱发突变
突 变 可 分为 自 发 突变 和 诱发突 变 。 自发 突 变 （ spontaneous mutation）是指在自然条件下出现的基因突变。 诱发突变（induced mutation）简称诱变，是指利用物理、化 学和生物因素人工诱发产生的基因突变。
4. 环境因素：各种短波辐射、高温、低浓度诱变物质等
Hale Waihona Puke Baidu
第四节 诱变剂和诱变机制
诱发突变（induced mutation）简称诱变，是指利用物理、化 学和生物因素人工诱发产生的基因突变。能够引起基因突变的 物理、生物因素称诱变因素，化学试剂称诱变剂。 诱变因素种类繁多，诱变机理也不尽相同，常用的诱变 因素分为以下几类：
5. 稀有性 突变是极为稀有的，野生型基因以极低的突变 率发生突变。 6. 可逆性 突变基因又可以通过突变而成为野生型基因， 这一过程称为回复突变 。 7. 少利多害性 一般基因突变会产生不利的影响，被淘汰 或是死亡，但有极少数会使物种增强适应性。
8. 不定向性 一个基因可以向不同的方向发生突变，产 生一个以上的等位基因。
由 C 变成 U 时，第一次 DNA 复制尿嘧啶不与鸟嘌呤而与腺 嘌呤互配，第二次复制后G:C转换为A:T； 当 G 变成 X 时，与以上两种情况不同，黄嘌呤仍然和胞嘧 啶配对。
1．试剂的配制 （1）1mol/L pH4.5醋酸缓冲液 称取醋酸 6.12g，加蒸馏水定容 100ml。称取醋酸钠 8.2g， 加蒸馏水定容 100ml。将醋酸钠溶液缓缓加入到醋酸溶液中， 搅拌均匀，调节pH至4.5，两者之比大约为1:1。 （2）0.1mol/L亚硝酸钠溶液 称取亚硝酸钠0.69g，加蒸馏水定容100ml。 （3）0.07mol/L pH8.6磷酸氢二钠溶液 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4· 2H2O）1.246g，加蒸馏水定容 100ml。 以上试剂使用前均要灭菌。
上述规则主要在原核生物中使用，1995年，被收录到《TIG遗传命名指南》 中，真核生物特别是高等生物尚未遵循此规则。TIG: Trends in Genetics Genetic Nomenclature Guide
第二节 基因突变的分子基础
一、碱基置换及其对遗传信息的影响
碱基置换又可分为两种类型：
Lederberg（1952年）
三、自发突变的机制
自发突变是在自然条件下产生的突变。从本质上讲，突 变不论是自然发生的，还是诱发产生的，都是通过理化 因子作用于DNA，使其结构发生变化最终改变遗传性状 的过程。 引起自发突变的原因徐了与微生物所处的外界环境条件 外，还与细胞内自身的化学反应、DNA分子内部的自身 运动、转座因子等因素有关。
转换（transition）和颠换（transversion）
AT
GC
红线双箭头为转换 绿线单箭头为颠换
CG TA
无义突变
二、移码突变及其对遗传信息的影响
移码突变（frame-shift mutation）是指编码蛋白质的DNA序 列中插入或缺失一个碱基，使翻译的阅读框发生改变而导致 多肽链的氨基酸序列的完全改变。
如果处理细菌，亚硝酸最后浓度以0.05mol： 将斜面新鲜菌体移人肉汤培养基 适温培养到对数期 将培养液进行离心，弃去上清液, 用生理盐水洗涤 pH4.5醋酸缓冲液和0.1mol/L硝酸钠溶液1：1加入沉淀的菌 体中，使之悬浮。 于35~37℃处理5～10min 加入5倍的pH8.6的磷酸氢二钠溶液，使pH下降到6.8。 取一定量进行后培养1.5～2h。 稀释分离于平板上 在亚硝酸处理菌体或孢子时要严格控制好温度，否则会影 响诱变效果。
以细菌抗药性突变为例进一步说明基因突变的规律
1. 抗药性突变的发生与药物的存在无关。
2. 抗药性突变以一定的突变率发生。
3. 各种抗药性突变的发生各不相关。 4. 抗药性突变型具有稳定性。 5. 抗药性突变型可回复突变 6. 抗药性突变率可通过理化因素处理而提高。
7. 抗药性突变是DNA分子某一特定位置结构改变的结果。
第三章：微生物基因突变
突变（mutation）是指生物的遗传物质-DNA的分子 结构发生改变而产生遗传性变异。 突变：染色体畸变 （大段DNA的缺失、重复、倒位、易位等） 基因突变 指基因内部细微结构的变化，它可是
DNA序列中单个或几个核苷酸发生改变
野生型（wild type）：在微生物遗传学研究中，人们通常 把从自然界中分离的菌株称为野生型，发生突变的相应个 体或群体称为突变型。 突变体（mutant）：在遗传学中，把携带有突变的生物个 体或群体称为突变体。
2．处理方法（以处理浓度0.025mol/L为例） 取1ml孢子悬液 2ml pH4.5醋酸缓冲液 1ml 0.1mol亚硝酸钠溶液 (处理浓度为0.025mol/L) 于25~26℃保温10~20min 加入20ml 0.07mol、pH8.6的磷酸氢二钠溶液， 使pH下降至6.8左右，以终止反应 稀释分离于平板
三、基因的命名规则和符号
1966年，M. Demerec提出了大肠杆菌的基因命名规则，其要 点： 1. 每个基因用斜体小写的三个英文字母来表示，这三个字母 取自表示该基因特性的一个或一组英文单词的前三个字母。 如str 表示streptomycin链霉素抗性基因。
2. 产生同一表型的不同基因，在三个字母后用不同的大写斜 体英文字母表示。如trp 代表色氨酸基因，各个不同的色氨 酸基因分别用trpA、trpB 来表示。
几种细菌抗性自发突变的频率
细 菌 绿脓杆菌 大肠杆菌 志贺杆菌 百日咳嗜血杆菌 伤寒沙门氏菌 大肠杆菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌 巨大芽孢杆菌 巨大芽孢杆菌 抗 性 链霉素 链霉素 链霉素 链霉素 链霉素 噬菌体T3 噬菌体T1 磺胺噻唑 青霉素 异烟肼 对氨基柳酸 突 变 率 4×10-10 1×10-10 3×10-10 1×10-10 1×10-10 1×10-7 3×10-8 1×10-9 1×10-7 5×10-9 1×10-5
3. 突变型基因的表示是在基因符号的右上角加“-”，如亮氨 酸缺陷型用leu -表示。抗药性基因是在基因符号的右上角加 上“r”表示抗性，加上“s”表示敏感。如str r表示链霉素抗 性。 4. 某一突变型基因的表型一般也用相应的正体三个字母表示， 不过第一个字母要大写。如乳糖发酵缺陷型基因用lacZ –表 示，其表型则需用LacZ-表示。 5. 当染色体上存在缺失时用“Δ”表示，缺失部分放在Δ符号的 括号中。如Δ（lac-pro）表示乳糖发酵基因到脯氨酸合成基 因这一段染色体发生了缺失。
替代A，错误与C配对
AT-GC碱基对转换
AT-GC和GC-AT对转换
使A和C脱氨基 与C作用
使G甲基化，错误与T配对
使DNA链交联并被DNase切除
GC-AT碱基对转换 GC-AT碱基对转换 造成点突变和缺失 导致移码或小段缺失
导致DNA的错误修复或缺失 导致DNA的错误修复或缺失
嵌合剂：吖啶类、溴化乙锭 辐射 紫外线（UV） 离子辐射（如X-射线）
这类化学诱变剂有： 亚硝酸（HNO2） 羟胺（NH2OH） 烷化剂 常见的烷化剂包括： 甲基磺酸乙酯（EMS） 硫酸二乙酯（DES） N’-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（NTG） 氮芥等。
（一）亚硝酸的诱变机制
亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的DNA分子，脱 去碱基中的氨基变成酮基，改变碱基氢键的电位，引起 转换而发生变异。
在12个平板上涂对T1 敏感的E.coli，5*104/ 皿 培养3-5小时 小菌落生长时产生抗T1突 变，每个平板上5*104菌落， 5000个细菌/菌落 6个平板喷入T1，培养
6个平板重新涂布后， 喷入T1，培养
1个抗T1菌落
多个抗T1菌落
3. 影印实验（replica plating test）
NH2 N N N N H O
HNO2
HN N H
N N H
腺嘌呤（A）脱氨基 变为次黄嘌呤（H）
第一次 复制
第二次 复制
H C G C
H
C A T
A
T
H
T
亚硝酸引起碱基脱氨基作用，由A变成H时，第一次DNA复制 后，次黄嘌呤不与胸腺嘧啶配对，而与胞嘧啶配对，第二次复 制后A:T转换为G:C。
脱氨基的结果： 腺嘌呤（A）变为次黄嘌呤（H） 胞嘧啶（C）变为尿嘧啶（U） 鸟嘌呤（G）变为黄嘌呤（X）
混匀后，取0.1-0.2ml菌悬液涂布到平板培养基上 在适宜温度下培养（即诱变处理） 培养后挑取单个菌落，进行筛选
注：如果处理真菌、放线菌孢子，则应提高5-Bu的浓度，通常为0.11mg/ml。加诱变剂后，需要振荡培养6-12小时，以绝大多数孢子刚刚 萌发为度，涂平板处理培养。
二、DNA分子上碱基的化学修饰
形态突变型、生化突变型、致死突变型、条件致死突变型
按遗传信息的改变方式可将突变分为以下3类： 1. 错义突变：突变造成所编码蛋白的氨基酸序列的变化 2. 同义突变：碱基改变后编码的氨基酸与野生型的氨基酸相 同
3. 无义突变：当碱基突变后形成终止密码子，使蛋白质合成 提前终止。
根据遗传物质的结构改变，分为： 1. 碱基置换
1. DNA分子内部运动
碱基脱氨基作用：如“C”脱氨基生成“T”。
互变异构效应：“T”可以酮式或烯醇式两种状态存在，酮式与“A”
配对，烯醇式与“G”配对。“C”和“A”则可以氨基或亚氨基两种状 态存在，“C”的亚氨基与“A”配对。
O HN O N O N OH N NH2 HN N O N
+
NH2
H
N
+
+
O
酮式
烯醇式
氨式
亚氨式
2. DNA的环出效应与缺失
自发产生缺失的机制，可能与DNA在复制或修复中的差错有关，一条 DNA链发生环状突起，当复制进行时环状突起区域不复制，这样环 状突起区域在子代中就发生缺失。 B A 1 A A A C
C
B C
B
C
3. 自身代谢产物：硫氢化合物、重氮丝氨酸、过氧化氢 等