死活细胞的鉴定方法

活细胞的鉴定在生物学与医学上具有很重要的意义。细胞培养过程中要随时记录细胞的生长情况,需要经常测定细胞的存活率;在肿瘤细胞的研究中,为了检验各种药物对肿瘤细胞的杀伤力,也需要测定肿瘤细胞的存活率。在临床医学中死活细胞的鉴定也有很大的应用,例如为了检测某一男子的生育能力,测定精子细胞的存活力就是比较常用的办法。

死活细胞的鉴定方法有很多种,常用的有染色法与仪器分析法。染色法就是常用的细胞死活鉴定方法,简便,易于操作。但就是通过直接的形态观察来鉴别细胞死活,实验结果很容易受操作者的主观因素的影响,存在一定的误差,所以,在实际操作中也常采用一些仪器来进行精确的批量检测。

不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理,但无论采用何种办法,都就是利用了死活细胞在生理机能与性质上的差异。

常用的方法包括染色法与仪器分析法。

1 染色法

染色法分化学染色法与荧光染色法,根据染色机理的不同,染料或使死细胞着色,或使活细胞着色。死活细胞在生理机能与性质上的差异主要包括:

死活细胞细胞膜通透性的差异:活细胞的细胞膜就是一种选择性膜,对细胞起保护与屏障作用,只允许物质选择性的通过;而细胞死亡之后,细胞膜受损,通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就就是利用了这一性质。台盼蓝,又称锥蓝,就是一种阴离子型染料,不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色,而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。

死活细胞在代谢上的差异:就是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝就是一种无毒染料,氧化型为蓝色,还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用,使细胞内具有较强的还原能力,能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型,因此美蓝染色后活的酵母细胞无色;而死细胞或代谢缓慢的老细胞,则因它们的无还原能力或还原能力极弱,使美蓝处于氧化态,从而被染成蓝色或淡蓝色。

荧光素双醋酸酯(FDA)就是一种常用的培养动植物细胞以及植物细胞原生质体的生活力鉴定染料,其染色机理也利用了死活细胞在代谢上的差异:FDA

本身不产生荧光,也无极性,能自由渗透出入完整的细胞膜。当FDA进入活细胞后,被细胞内的脂酶分解,生成有极性的、能产生荧光的物质——荧光素,该物质不能自由透过活的细胞膜,积累在细胞膜内,因而使有活力的细胞产生绿色荧光;而无活力的细胞因不能使FDA分解,而无法产生荧光。

除此之外,还有一些细胞器的专有染料。如液泡系的专有染料中性红。中性红就是一种低毒性染料,可以使活细胞液泡着红色,而细胞质与细胞核不被着色;死细胞的液泡不被着色或浅染,染料弥散于整个细胞中,细胞核与细胞质被染成红色。有时侯为了增加染色效果可以将两种染料结合使用,如甲基蓝-中性红混合染色法。

2 仪器分析法

可采用微电极技术(利用死活细胞膜两侧电位的差异)、全自动分析细胞记数仪与流式细胞仪等,可对细胞的死活进行精确的批量检测。

德国INNOVATIS出产的全自动Cedex细胞存活率/细胞计数仪/细胞分析仪就是世界上第一台高分辨率、高清晰度扫描(专利)细胞分析仪,具有全自动台盼蓝染色、显微CCD成象、CEDEX工作站软件,可用于制药、医学、发酵、免疫、病理、毒性测试、生物技术等学科的研究开发与工业生产过程中的细胞计数与分析。自动分析结果,检测分析数据输出(11项):总细胞数目,总细胞浓度

(cells/mL) ;活细胞数目,活细胞浓度 (cells/mL);死细胞数目,死细胞浓度(cells/mL) ;细胞存活率 (%) ;细胞的平均圆度 (compactness) ;细胞的平均直径 (um) ;细胞团比例 (Aggregate Rate);细胞直径分布图 (Diameter Histogram);细胞团分布图 (Aggregate Histogram);细胞圆度分布图(Compactness Histogram) ;细胞生长时间曲线(Cultivation Time Chart)。

流式细胞仪法用来判断细胞死活的常用荧光探针有二大类:一类就是能透过活的细胞膜进入细胞内而发出荧光的物质,例如FDA可被活细胞持留而发出黄绿色荧光,若细胞有损伤则会从细胞中流失,观察不到荧光。另一类就是不能透过活细胞膜,但能对固定的细胞及膜有破损的细胞的核进行染色,例如碘化丙啶( PI,Propidium iodide )与溴化乙锭( EB,Ethidium bromide )就就是常用的第二类荧光探针。碘化丙啶(PI)不能穿透细胞膜,对于具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。而对于坏死细胞,其细胞膜的完整性丧失,碘化丙啶(PI)

可以染色坏死细胞。目前常用的一种细胞凋亡与坏死检测试剂盒则含有Hoechst 33342与碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)两种荧光染料。细胞发生凋亡时,染色质会固缩,Hoechst 33342可以穿透细胞膜,染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。上述两种染料双染后,使用流式细胞仪或荧光显微镜检测时,正常细胞为弱红色荧光＋弱蓝色荧光,凋亡细胞为弱红色荧光＋强蓝色荧光,坏死细胞为强红色荧光＋强蓝色荧光。

此外,还可以用植物细胞的质壁分离试验来对植物细胞的死活进行见证,还可以通过观察细胞质的流动性进行细胞的死活鉴定。