血红蛋白的提取和分离

D、为什么要缓慢搅拌？ 防止红细胞破裂释放出血红蛋白。
初次离心后的结果
3次洗涤后的结果
2.血红蛋白的释放：
• 将洗好的红细胞倒入烧杯中，加入蒸馏水 到原血液的体积，再加入40%体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10mim。在 蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释 放出血红蛋白。
（2）释放血红蛋白
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④有些蛋白质有调节作用，如胰岛素和生长激素都是蛋白质，能 够调节人体的新陈代谢和生长发育；
⑤有些蛋白质有免疫(包括细胞识别)作用，如动物和人体的抗体 能清除外来蛋白质对身体生理功能的干扰，起着免疫作用。
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血红蛋白
• 血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要 组成成分，是高等生物体内负责运载氧的一种蛋 白质(缩写为HB或HGB)。血红蛋白因含有血红素 而呈现红色，是使血液呈红色的蛋白。血红蛋白 由四条链组成，两条α链和两条β链，每一条链有 一个包含一个铁原子的环状血红素，此基团可携 带一分子氧或一分子二氧化碳。 • 血红蛋白的特性是：在氧含量高的地方，容 易与氧结合；在氧含量低的地方，又容易与氧分 离。血红蛋白的这一特性，使红细胞具有运输氧 的功能。
2.粗分离----透析（去除分子量较小的杂质）
（1）用 透析
方法进行粗分离，透析袋由半透膜制 成， 玻璃纸、肠衣、膀胱膜 常用 。将透析袋放入 磷酸缓冲 溶液中进行透析。
（2）透析的原理是 透析袋能使小分子自由进出，而将 大分子保留在袋内 （3）透析的目的是
去除样品中分子量较小的杂质
。
• 透析过程中如何去除无机盐离子和小分子 有机物？ • 半透膜的选择透过性，大分子物质不能通 过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜 。在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子 和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH＝7 的磷酸缓冲液中。 • 透析过程中为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？ 为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？ • 维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分 子充分地向外扩散。
思考：说出人体血液中缓冲对。 NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO3
三、 电泳---血红蛋白的分离鉴定方法
1.概念： 带电粒子在 电场作用下发生 迁移 的过程。 2.原理： 许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都
具有 可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带 上 正电 或 负电 。在电场的作用下，这些带电分子 会向着的与其所带电荷相反 的电极移动。电泳利用 了待分离样品中各种分子 带电性质的差异 以及分子 本身的 大小、 形状的不同，使带电分子产生不同 的 迁移速度 ，从而实现样品中各种分子的分离。
（3）分离血红蛋白溶液：
用滤纸过滤，除去 脂溶性沉淀层，于 分液漏斗中静置片 刻后，分出下层的 红色透明液体。
试管中溶液层次
甲苯层（无色透明） 白色薄层固体 红色透明液体
杂质沉淀层（暗红色）
柜式离心机
4.透析：
• 取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透 析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为 20mmol/L的磷酸缓冲剂中（pH为7.0）， 透析12h。
1. 用鸡的红细胞提取D来自百度文库A，用哺乳动物的红细胞 提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA 的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋 白含量丰富，便于提取血红蛋白。 2与其他真核细胞相比,红细胞有什 么特点? 这一特点对你进行蛋白质的分离有 什么意义?
血红蛋白
血红蛋白的特点：
每个肽链环绕一个亚铁血红素基团， 此基团可携带一分子氧或一分子二 氧化碳，血红蛋白因含有血红素而 呈红色。
血红蛋白
两个α－肽链 两个β一肽链 四个亚铁红素基团
蛋白质提取和分离的原理
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根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形 状和 根据蛋白质各种特性的差异， 各种特 性的差异 大小、所带电荷的性质和多少、 溶解度、 大小、所带电荷的性质和多少、 溶解度、吸附性质 和对其他分子的亲和力 等等 可以用来分离不同种 等等， 和对其他 分子的亲和力等等，可以用来分离不同种 类的蛋白质。
血红蛋白
本课题学习目标
体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了 解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。
1、主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 ④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。 2、主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理 ②电泳法分离样品的原理 ③缓冲溶液的组成和作用机理 3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 4、课题难点： ①样品的处理 ②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。
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(5)五大功能：是指蛋白质分子主要有5大功能(由分子结构的多样性 决定)： ①有些蛋白质是构成细胞和生物体的重要物质，如人和动物的肌 肉主要是蛋白质； ②有些蛋白质有催化作用，如参与生物体各种生命活动的绝大多 数酶； ③有些蛋白质有运输作用，如细胞膜上的载体、红细胞中的血红 蛋白；
答:血红蛋白是有色蛋白,因此在凝胶色谱分离时可 以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液 .这 使血红蛋白的分离过程非常直观,大大简化了实验操 作.
（二）操作过程
采集得到血液（加入抗凝血剂柠檬酸钠）
从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：
• 洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋 白、透析。
1.红细胞的洗涤：
蛋白质的知识
(1)一个通式：是指组成蛋白质的基本单位氨基酸；氨基酸的通式只有 1个， 即 (形象记忆：碳周围有四个邻居，三个固定邻居即-H、-COOH、-NH2， 一个变动邻居即-R基)。不同的氨基酸分子，具有不同的-R基。 (2)两个标准：是指判断组成蛋白质的氨基酸必须同时具备的标准有2个： 一是数量标准，即每种氨基酸分子至少都含有一个氨基(-NH2)和一个羧基(COOH)；二是位置标准，即都是一个氨基和一个羧基连接在同一个碳原子上。
透析过程动画演示
3、纯化（凝胶色谱）---去除相对分子量 较大的杂质蛋白
（1）凝胶色谱柱的制作
①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两 端需用砂纸磨平。
②底塞的制作： 打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。
凝胶色谱柱的制作
（2）凝胶色谱柱的装填
①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。
一、基本概念及原理
1、凝胶色谱法
凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根 据分子量的大小分离蛋白质的方法之一，又 称分子筛层析 。 凝胶实际上是一些微小的多孔球体，例 如：浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙 烯酰胺、葡聚糖凝胶等
原理： 当不同的蛋白质通过凝胶时
相对分子质量较小 容易进入 相对分子质量较大 无法进入凝胶 内部的通道 只能在凝胶外部移动 路程较短 移动速度较快
②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定 量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成 凝胶悬浮液。 ③凝胶色谱柱的装填方法： A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。 B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之 间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为 气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效 果。
电泳检测PCR结果
琼脂糖凝胶电泳
①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先 处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。 ②测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳， 这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所 带电荷的性质和分子的大小、形状。
二、实验步骤
磁力搅拌器
搅拌器转子
搅拌器正在工作
3.分离血红蛋白溶液：
• 将搅拌好的混合溶液转移到离心管中，以 2000r/mim的速度离心10mim后，可以看出 溶液分为4层，从上往下数，第一层是无色 透明的甲苯层，第二层为白色薄层固体， 是脂溶性物质沉淀层，第三层为红色透明 液体，这是血红蛋白的水溶液，第四层是 其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液 体用滤纸过滤，出去脂溶性沉淀物，于分 液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透 明液体
思考：
1. 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了 哪些物质？（蒸馏水，40%体积的甲苯） 2. 为了加速释放过程，采取了什么措施？ （使用磁力搅拌器充分搅拌） 目的分析： 使红细胞大量吸水胀裂 1. 蒸馏水的作用是______________________________ 。 溶解红细胞的细胞膜 2. 加入甲苯的作用是____________________________ 。 加速红细胞的破裂 3. 充分搅拌的目的是____________________________ 。
凝胶内部的通道 路程较长 移动速度较慢
相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。
4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程
• 思考：所有的蛋白质都可以用凝胶色谱法 来分离吗？
不是，能分离的蛋白质分子必须是具 有相对分子质量不同的蛋白质。
二、缓冲溶液
1.作用: 在一定范围内，能够抵制 外界的酸和碱 对溶
液PH值的影响，维持PH 基本 不变。 调节缓冲剂 使用比例 的就可以制得在不同PH范围内使 用的缓冲液。 磷酸缓冲液 3.提问：在本课题中使用的缓冲液是:__________ , 其目的是: 利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科 学研究(活性)
2.配制: 通常由 1~2 种缓冲剂 溶解于水中配制而成。
琼脂糖凝胶电泳示意图
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
（1）、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于
它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。 （2）、SDS能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物， SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷 量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳 分子的大小 迁移率完全取决于（ ）。
1、样品的处理
（1）红细胞的洗涤 A、洗涤目的: 去除杂质血浆蛋白，以利于后续步骤的分离纯化 B、分离时采用 低速短时间 三次 洗 涤，重复洗涤
表明红细胞已洗涤干净
五倍体积的生理盐水 离心，用 ，直至 上清液不再呈现黄色，
为什么要低速短时离心？ 防止白细胞沉淀 C、能否用蒸馏水代替生理盐水？
不能，生理盐水能保持红细胞的渗透压而不至于破裂，若红细胞 提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大分离难度。
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(3)三个数量关系：是指蛋白质分子合成过程中的3个数量关系( 氨基酸数、肽键数或脱水分子数、肽链数)，它们的关系为：当m个 氨基酸缩合成一条肽链时，脱水分子数为(m-1)，形成(m-1)个肽键， 即脱去的水分子数=肽键数=氨基酸数-1；当m个氨基酸形成n条肽链 时，肽键数=脱水分子数=m-n。 (4)四个原因：是指蛋白质分子结构多样性的原因有4个： ①组成蛋白质的氨基酸分子的种类不同； ②组成蛋白质的氨基酸分子的数量成百上千； ③组成蛋白质的氨基酸分子的排列次序变化多端； ④蛋白质分子的空间结构不同。
• 洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，用离心 机进行分离。采用低速短时间离心，如 500r/mim离心2mim，用胶头滴管吸出上层 透明液体（黄色血浆），将下层暗红色的 红细胞液体倒入烧杯中，再加入五倍体积 的生理盐水（质量分数为0.9%的NaCl溶液 ），缓慢搅拌10mim，低速时间离心，如 此重复洗涤三遍，直至上层清液中没有黄 色，表明红细胞已洗涤干净。
蛋白质的提取和分离一般分为四步： 样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定（电泳）
实验操作
（一）蛋白质提取和分离步骤 红细胞的洗涤 样品处理 血红蛋白的释放 分离血红蛋白溶液 粗分离： 透析—去除样品中分子量较小的杂质 纯化：用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的
杂质
纯度鉴定 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
3.类型: 琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
最常用的电泳支持介质是聚丙烯酰胺和琼 脂糖凝胶。琼脂糖有一个相对较大的孔径，用 来分离大分子例如核酸、大蛋白和蛋白复合物 ，聚丙烯酰胺形成孔径较小的胶，适合于分离 大多数蛋白和小片段核酸。
在电场的作用下，这些带电分子会向着 与其所带电荷相反的电极移动