HPLC色谱常见问题

指的是流动相在紫外短波段的吸收。描述一种溶剂的末端吸收常用其截止波长描述。

溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。

其测量是将溶剂装入1cm的比色皿，以空气为参比，逐渐降低入射波长，溶剂的吸光度A＝1时的波长称为溶剂的截止波长。也称极限波长。

中国药典对UV法溶剂的要求是：以空气为空白，溶剂和吸收池的吸收度在220~240nm范围内不得超过0.40，在241~250nm范围内不得过0.20，在251~300nm 范围内不得过0.10，在300nm以上不得过0.05。

末端吸收简单的说就是紫外吸收短波端有强而不成峰值吸收处，简单的一个例子就是你很可能都见到过一个物质紫外扫描图谱中小于200nm的地方就是强吸收，但没有吸收峰

出现倒峰的原因，以下是查到的一些资料：

1.常为溶剂峰,流动相的紫外吸收大于样品的溶剂的紫外吸收,就产生倒峰.

2.样品中的杂质没有紫处吸收或吸收很小,而流动相紫外吸收大,如用甲醇时波长设定在220nm以下时,常出现这种现象.

3.进样过程中进入了空气也会导致的.

4.如果流动相有紫外吸收的杂质，使用紫外检测器时，会产生倒峰，必须用高纯度的溶剂作为流动相。

5.检测器的极性接反了，也会出现倒峰

从液相色谱的角度来解释，出现倒峰一般是分析物的吸收比流动相的吸收还要小，

HPLC色谱常见问题

1.用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在？如何解决？

2.液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？

3.HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法

4.做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？

5.我最近更换了另一种牌号的ODS柱，虽然分离情况仍可以，但保留时间不重现，为什么？

6.我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？

7.色谱双峰产生的可能及判断和处理

8.色谱柱中的流动相会排干吗？

9.使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接头需要注意什么问题？

10.液相色谱梯度洗脱中柱温的影响有那些？

11.为何基线会漂移

12.规则的基线噪音是如何产生的

13.不规则的基线噪音是如何产生的

14.保留时间漂移的故障排除

15.为何出现肩峰或分叉？

16.为何出现鬼峰？

17.为何出现峰拖尾？

18.为何出现峰展宽？

19.除了流速外，还有哪些因素能引起压力改变？

20.什么是强溶剂、弱溶剂？

21.怎样才会使峰位发生重排？

22.除了在线脱气常用的实验室脱气方式还有哪些？

23.评价一个色谱柱的最基本指标有那些？

24.什么是时间常数？

25.为什么在实验过程中有时会出现倒峰？

26.为何会出现“胖"峰和平头峰？怎样避免？

27.什么是次级保留效应？

28.前延峰的发生及处理？

29.峰变宽的原因？

30.柱平衡慢的常见原因有哪些？

31.用内标法实验时对内标物的要求有哪些？

32.管子切割与安装注意事项？

33.什么是HPLC的“无限直径效应"？

34.如何评价一台检测器？

35.如何简单判断比例阀是否内漏？

液色迷人

1.用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在？如何解决？

关于漂移问题：

①温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定

②流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等

③柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡

关于快速变化问题

①流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定

②泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。

③流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合

2.液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？

①筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。

②存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子

③可能柱超载，减少进样量。

3.HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法

①样品量不足，解决办法为增加样品量

②样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子

③样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器

④检测器衰减太多。调整衰减即可。

⑤检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数

⑥检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。

⑦检测池中有气泡。解决办法为排气。

⑧记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。

⑨流动相流量不合适。调整流速即可。

⑩检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。

4.做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？

①泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；

②比例阀失效，更换比例阀即可；

③泵密封垫损坏，更换密封垫即可；

④溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；

⑤系统检漏，找出漏点，密封即可；

⑥梯度洗脱，这时压力波动是正常的。

5.我最近更换了另一种牌号的ODS柱，虽然分离情况仍可以，但保留时间不能重现，为什么？

这是因为被分析物可能具有形成氢键的能力。尽管过去几年来，填料的制造技术有了极大的提高，但不同的厂商的ODS填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用。因此，同一被分析物中的各组分在不同牌号的ODS柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相中加入少量竞争物，如三乙基胺（TEA），将会使硅醇基的成键能力饱和，从而能保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。

如分离情况可以，系统稳定，达到系统适用性要求，就不必保留时间的重现。

6.我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？

柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。

①拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；

②把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；

③将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，

再检查；只用于使用过的柱子。

④更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，

在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的Rheodyne 7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。

7.色谱双峰产生的可能及判断和处理