骨髓间充质干细胞体内归巢特性的研究_施小凤
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江苏医药杂志 2004 年 4 月第 30 卷第 4 期 Jiangsu M ed J , A pril 2004, V ol 30, N o. 4
骨髓间充质干细胞体内归巢特性 张勇 张晓慧
骨髓基质细胞包括单 核内皮 细胞及 纤维母 细胞等 多种 细胞成份组成, 并组成造血微环境, 产生造血干/ 祖细 胞自我 更新、增殖及分化所必需的细胞因子, 维持正常的造血功 能。 业已证实, 骨髓基质有 起源于 间充质 的干细 胞, 该 类细 胞除 可组成造血微环境外, 尚具有多向分化能力。本研究 观察了 骨髓来源的间充质干细 胞( M SC) 体外生 长特性 及归巢 骨髓 的能力。
异基因外周血干细胞移植后纯红细胞再生障碍性 贫血的治疗
干细胞移植
吴汉新 李建勇 任志宏 钱思轩
患者男, 23 岁。因不 明原 因头 昏、乏力、牙 龈出 血 2 周 于 2002 年 8 月 2 日入院。既往有乙肝病毒小三阳史, 5 年前 在外院行先天性心房间隔缺损修补术治疗。入院后查: 重度 贫血貌, 巩膜无黄染, 口腔 黏膜血泡 , 牙 龈出 血, 四 肢皮 肤较 密集出血点, 淋巴结无 肿大, 心肺无 异常, 肝 脾肋下 未扪 及。 血 WBC0 8 109 / L , 中性粒细胞 绝对值( AN C) 0 1 109 / L , Hb33g / L, BPC8 109/ L , 网织 红细 胞 ( Ret) 计 数 0 05% ; 抗 核抗体( AN A) (- ) , Ham s 试验 (- ) ; 乙肝 病 毒小 三阳, HBVDNA(- ) , 丙肝抗 体(- ) ; 骨 髓细 胞学 涂片 及病 理学 活检 均为 再生障碍 性贫 血( A A) 。临床 诊断重 型 A A( SAA) 。8 月 17 日行 HLA 匹配患 者胞 姐外 周血 干细 胞( P BSC) 移植。A BO 血型受者 O 型, 供者 B 型。预 处理方案为 环磷酰胺 50 mg kg-1 d-1 连用 4 d。输注供者单核细胞( M NC) 2 9 108/ kg 和 CD34+ 细胞 3 3 106 / kg。用 环 孢素 A ( CsA ) 、短程 甲 氨蝶 呤、霉酚酸 酯( M M F ) 预防 移植 物抗 宿主 病( GVH D) 。 移植 后 2 个月内无发热、GVHD 等, 但 Hb 在 40~ 50 g / L , Ret 为 0, WBC 及 BPC 正 常。+ 11 d AN C> 0 5 109/ L, + 21 d BPC> 20 109 / L 。+ 40 d 检查患 者血型 由 O 转 为 B 型, 抗 B 凝集素测不出, + 58 d 染 色体 核型复 查仍 完全为 供者 型。 + 14 d 起 4 次骨髓 检查均示粒 系、巨 核系增生活 跃, 红 系缺 如。诊断为 移植后纯红细胞 AA ( PRCA ) 。于 + 65 d 予 大剂 量丙种 球 蛋白 ( 500 mg kg-1 d-1 ) 连 用 5 d, + 73 d Ret 为 5 0% , Hb72 g/ L , + 78 d Hb126 g/ L。+ 80 d 患者因 恐 CsA 对肝功能有损, 自行停 服 CsA 和 M M F, + 96 d 因 发生 爆发 性乙型病毒性肝炎, 患者家属拒绝行血浆置换等治疗 并自动 出院, 出院时血常规正常。
参考文献
1 A lmeida-Porada G, Porada CD , T ran N , et al. Cot ransplantation of human st romal cell progen it ors into preimmune f et al sheep result s in early appearance of human donor cells in circulation and boost s cell levels in bon e marrow at lat er t ime points aft er transplant at ion. Blood, 2000, 95: 3620-3627.
2 Devine SM , Bart holomew A M , M ahmud N , et al. M esenchymal stem cells are capable of homing t o th e bone marrow of non- human promat es f ollowing syst emic in fusion. Exp H emat ol, 2001, 29: 244- 255.
材料和方法 一、试剂与设备: DM EM 培养基( Gibco) , 小牛血清( 杭州 四季 青 公 司) , 胰 酶、胶 原 酶 ( Sigma ) , CF DA SE 荧 光 标 记 ( M olecular probes Inc) , 冰冻切片机( Shandon in U K) , 荧光显 微镜( Oly mpus) , 流式 细胞仪( Coulter ) , SCID 鼠( 上海医 科大 学实验动物中心) , CO2 培养箱、低温离心机( Her aeus) 。 二、M SC 分离培养及鉴定: 抽 正常人骨 髓 5 ml, Ficoll 离 心, 取单个核细胞( M NC) , 加 DM EM 培养基( 含 15% 的小牛 血清, 2 mmol/ L 谷氨酰胺, 0 1 mol/ L 琥 珀酸 氢化 可的松 ) 置 37 , 含 5% CO2 的培养箱中培养 3 d 后 去悬浮细胞, 以后 每 3 d 换液一次, 细胞达 70% ~ 80% 融合时用 0 25% 的胰酶 消化分瓶传代。用 直接 免疫 荧光 标 记, 流式 细 胞仪 分 析方 法, 选用 为 CD34- PE、CD44- F IT C、CD29- F IT C、CD45- F IT C, 阴性对照为小鼠同型 Ig G 单抗。 三、M SC 的 CF DA SE 荧光标记: 操作 按说明 进行, 吸弃 培养瓶中旧 液, 每 瓶 加入 10 mol/ L 的 CFDA SE 2 ml, 置 37 孵育 15 min 后, 弃 去旧 液, PBS 洗涤 后 加入 新 鲜培 养 基, 培养 30 min。分别在 0、12、24、48 和 96 h, 用胰 酶消 化, 收集细胞上流式测定标记率。 四、M SC 在小鼠 体内的分 布: 取经 CF DA SE 标记 M SC 5 106 约 0 2 ml 输入经 3 5 G y 照 射的 SCID 鼠 尾静脉, 24 h 后 处死小鼠, 将肺、心、肝、脾、肾 和肠 作冰冻 切片, 片 厚 30 m 在荧光显微镜 下观察计数 10 张切片的荧光细胞; 取骨髓 及胶原酶处理过的骨髓和肝、脾细胞( > 1 105) 的悬 液涂片 在荧光显微镜下观察并 计数; 冲出骨 髓按常 规再 做 M SC 培 养, 7 d 后收集贴壁细胞, 在荧光显微镜下观察。 五、统计方法: 所有数 据以 x s 表示, 用 SPSS 软 件处 理, 并进行配对 t 检验。
作者单位: 215004 苏州大学附属第二医院血液科
CD29+ + ( 91 96% ) 。新鲜标记 的人 M SC 标记 后细胞 爬片, 细胞呈典型的成纤维样发绿色 荧光见插页 3 图 1, 标记率 达 99 6% , 96 h 后荧光强度稍减, 但标记率仍达 99% 。
二、M SC 在小鼠体内 的分布: 24 h 后各组织冰冻切 片荧 光细胞数依次为肺( 125) 、肾( 23) 、脾( 3) 、肝( 2) , 心脏和小 肠 几乎无荧光细胞。来自于脾、肝和骨髓的细胞悬液的厚涂 片 镜下荧光细胞数检出率增高, 分别为 2 105 个鼠细胞含 12、 9、1 个细胞。经胶原酶消化的厚 涂片, 可数 13 个荧 光细胞。 收集冲出骨髓再培养 M SC 在镜下未 发现荧 光细胞。插 页 3 图 2 为肺脏组织冰冻 切片, 中央可 见 2~ 3 个 荧光细 胞的 断 面; 插页 3 图 3 为肾 脏组织, 边缘 可见一 个圆 形的荧 光细 胞 断面; 插页 3 图 4 为脾脏组织, 中央可见一个荧光细胞。
讨论 M SC 开始培养时, 常 为多 种细 胞的 混合 体, 传 2~ 3 代 后形成单一的成纤 维细胞, 其 表型特 点为 CD34 和 CD45 阴 性, 但高表达 CD29 和 CD44。CFDA SE 是一种细胞示踪剂, 结合在细胞表面被吞入细胞经酯酶切开发出绿色 荧光, 这 种 标记较稳定, 4 d 后标记率仍达到 99% 。 M SC 与造血干细胞( HSC) 共同 输注可 促进放 化疗后 造 血的重建, 我们以前的实 验也显 示 M SC 与骨 髓共输 给照 射 后的 Babl/ c 小鼠, 白 细胞 恢复 快, 死亡 率低, 能显 著促 进 造 血的恢复。但其机制 不明, 国外研 究主 要集中 在 M SC 是 否 能定位于骨髓。本实验 显示 MSC 只 有很 少的 量植入 骨髓, 冲出骨髓做厚涂 片及取 骨髓 再培 养后 收集 M SC, 镜 下不 能 检测到荧光细 胞, 与 Almeida、Devine 等[ 1, 2] 报道 一致。有 人 将导入抗新霉素基 因的 M SC 系植 入小 鼠体 内, 2 周 后取 出 骨髓再培养 M SC, 用新 霉素筛 选未见 人 MSC。本实 验中 将 骨头剪碎后胶原酶消化 30 min 后 收集, 可明显提 高检出率, 可能输入的 M SC 归巢骨髓后, 黏附到骨组织上, 骨髓冲吸 的 方法难以获取。本实验发现输入的 M SC 12 h 就能在骨髓中 检测到, 24 h 含量升高, 呈随 血流迁 移的过程, 48、96 h 渐 减 低, 骨 髓中的检出率与输入 M SC 数呈正相关, 与国外报道 一 致[ 3] 。 我们采用冰冻切片 法和细胞 悬液厚 涂片 法来测 定荧 光 细胞的检出率, 前者保留了组织形态较直观, 但检 出率低, 后 者检出率高, 但形态发生变化。实验也曾用流式细胞仪分 析 法虽敏感性高, 但特异性 差。本研 究证 实 M SC 细胞 回输 后 肺中含量最高, 其次是肾、肝、脾、和骨髓, 心肌和小肠几乎 没 有, 似 乎与血流量相关。MSC 体积较大, 约是白细胞的 2~ 3 倍, 且呈圆型, 但变形能力不及造血细胞, 除去细胞量和检 测 手段的影响因素, 推断可能 与肺细 胞筛滤 作用 有关, 并与 血 流量有关。 N olta 等[ 4] 发现导入 IL- 3 的 M SC 与 HSC 共输注较未修
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饰的 M SC 促进造血能 力强, 而 M SC 并 未在 骨髓中 发现, 细 胞因子可能 分泌入血再作用于 HSC。本研 究发现回输 M SC 后, 体内多种脏器都可检 出荧光 细胞的 存在, 似乎不 如 HSC 那样特异性地归巢于骨髓, 鉴此, 我们认为绝大多数 M SC 虽 不能归巢骨髓, 参与造血微环境的重 建, 但 可通过与 HSC 的 相互作用及 分泌细胞 因子 来促进 HSC 归巢 骨髓, 并促 进其 增殖和分 化, 加 快 造血 重 建。同 时 M SC 与 HSC 共 同移 植 时, 其分泌的细胞 因子不 仅可 使 HSC 在归 巢骨髓 前免 于凋 亡, 尚可调节其表面分子 表达促 进 HSC 归 巢。一旦 HSC 归 巢后, 有多少 M SC 能在骨髓中长期生存无关紧要。
3 Horw itz EM , K eat ing A . Nonhematopoiet ic mesenchymal st em cells: w hat are t hey? Cyt ot herapy, 2002, 2: 387-388.
4 Nolt a JA, H anley M B, K ohn D B. Sustained human hematopoiesis in immunodef icient m ice by co-t ransplant at ion of marrow st roma expressing human int erleukin-3: analysis of gene t ransduct ion of longlived progenit ors. Blood, 1994, 83: 3041-3051. ( 收稿: 2003-11-24)
结果 一、M SC 特点: 培养 7 d 后为单 核内皮 样细胞 及成 纤维 样细胞混合生长, 传 2~ 3 代后成 为单一 的成 纤维细 胞。流 式 示 CD34- ( 0 28% ) 、CD45- ( 0 ) 、CD44+ + ( 96 54% ) 、
基金项目: 江苏省 135 重点医学人才基金( R C2002021 ) ; 苏州大 学医学发展基金( EE123002)
江苏医药杂志 2004 年 4 月第 30 卷第 4 期 Jiangsu M ed J , A pril 2004, V ol 30, N o. 4
骨髓间充质干细胞体内归巢特性 张勇 张晓慧
骨髓基质细胞包括单 核内皮 细胞及 纤维母 细胞等 多种 细胞成份组成, 并组成造血微环境, 产生造血干/ 祖细 胞自我 更新、增殖及分化所必需的细胞因子, 维持正常的造血功 能。 业已证实, 骨髓基质有 起源于 间充质 的干细 胞, 该 类细 胞除 可组成造血微环境外, 尚具有多向分化能力。本研究 观察了 骨髓来源的间充质干细 胞( M SC) 体外生 长特性 及归巢 骨髓 的能力。
异基因外周血干细胞移植后纯红细胞再生障碍性 贫血的治疗
干细胞移植
吴汉新 李建勇 任志宏 钱思轩
患者男, 23 岁。因不 明原 因头 昏、乏力、牙 龈出 血 2 周 于 2002 年 8 月 2 日入院。既往有乙肝病毒小三阳史, 5 年前 在外院行先天性心房间隔缺损修补术治疗。入院后查: 重度 贫血貌, 巩膜无黄染, 口腔 黏膜血泡 , 牙 龈出 血, 四 肢皮 肤较 密集出血点, 淋巴结无 肿大, 心肺无 异常, 肝 脾肋下 未扪 及。 血 WBC0 8 109 / L , 中性粒细胞 绝对值( AN C) 0 1 109 / L , Hb33g / L, BPC8 109/ L , 网织 红细 胞 ( Ret) 计 数 0 05% ; 抗 核抗体( AN A) (- ) , Ham s 试验 (- ) ; 乙肝 病 毒小 三阳, HBVDNA(- ) , 丙肝抗 体(- ) ; 骨 髓细 胞学 涂片 及病 理学 活检 均为 再生障碍 性贫 血( A A) 。临床 诊断重 型 A A( SAA) 。8 月 17 日行 HLA 匹配患 者胞 姐外 周血 干细 胞( P BSC) 移植。A BO 血型受者 O 型, 供者 B 型。预 处理方案为 环磷酰胺 50 mg kg-1 d-1 连用 4 d。输注供者单核细胞( M NC) 2 9 108/ kg 和 CD34+ 细胞 3 3 106 / kg。用 环 孢素 A ( CsA ) 、短程 甲 氨蝶 呤、霉酚酸 酯( M M F ) 预防 移植 物抗 宿主 病( GVH D) 。 移植 后 2 个月内无发热、GVHD 等, 但 Hb 在 40~ 50 g / L , Ret 为 0, WBC 及 BPC 正 常。+ 11 d AN C> 0 5 109/ L, + 21 d BPC> 20 109 / L 。+ 40 d 检查患 者血型 由 O 转 为 B 型, 抗 B 凝集素测不出, + 58 d 染 色体 核型复 查仍 完全为 供者 型。 + 14 d 起 4 次骨髓 检查均示粒 系、巨 核系增生活 跃, 红 系缺 如。诊断为 移植后纯红细胞 AA ( PRCA ) 。于 + 65 d 予 大剂 量丙种 球 蛋白 ( 500 mg kg-1 d-1 ) 连 用 5 d, + 73 d Ret 为 5 0% , Hb72 g/ L , + 78 d Hb126 g/ L。+ 80 d 患者因 恐 CsA 对肝功能有损, 自行停 服 CsA 和 M M F, + 96 d 因 发生 爆发 性乙型病毒性肝炎, 患者家属拒绝行血浆置换等治疗 并自动 出院, 出院时血常规正常。
参考文献
1 A lmeida-Porada G, Porada CD , T ran N , et al. Cot ransplantation of human st romal cell progen it ors into preimmune f et al sheep result s in early appearance of human donor cells in circulation and boost s cell levels in bon e marrow at lat er t ime points aft er transplant at ion. Blood, 2000, 95: 3620-3627.
2 Devine SM , Bart holomew A M , M ahmud N , et al. M esenchymal stem cells are capable of homing t o th e bone marrow of non- human promat es f ollowing syst emic in fusion. Exp H emat ol, 2001, 29: 244- 255.
材料和方法 一、试剂与设备: DM EM 培养基( Gibco) , 小牛血清( 杭州 四季 青 公 司) , 胰 酶、胶 原 酶 ( Sigma ) , CF DA SE 荧 光 标 记 ( M olecular probes Inc) , 冰冻切片机( Shandon in U K) , 荧光显 微镜( Oly mpus) , 流式 细胞仪( Coulter ) , SCID 鼠( 上海医 科大 学实验动物中心) , CO2 培养箱、低温离心机( Her aeus) 。 二、M SC 分离培养及鉴定: 抽 正常人骨 髓 5 ml, Ficoll 离 心, 取单个核细胞( M NC) , 加 DM EM 培养基( 含 15% 的小牛 血清, 2 mmol/ L 谷氨酰胺, 0 1 mol/ L 琥 珀酸 氢化 可的松 ) 置 37 , 含 5% CO2 的培养箱中培养 3 d 后 去悬浮细胞, 以后 每 3 d 换液一次, 细胞达 70% ~ 80% 融合时用 0 25% 的胰酶 消化分瓶传代。用 直接 免疫 荧光 标 记, 流式 细 胞仪 分 析方 法, 选用 为 CD34- PE、CD44- F IT C、CD29- F IT C、CD45- F IT C, 阴性对照为小鼠同型 Ig G 单抗。 三、M SC 的 CF DA SE 荧光标记: 操作 按说明 进行, 吸弃 培养瓶中旧 液, 每 瓶 加入 10 mol/ L 的 CFDA SE 2 ml, 置 37 孵育 15 min 后, 弃 去旧 液, PBS 洗涤 后 加入 新 鲜培 养 基, 培养 30 min。分别在 0、12、24、48 和 96 h, 用胰 酶消 化, 收集细胞上流式测定标记率。 四、M SC 在小鼠 体内的分 布: 取经 CF DA SE 标记 M SC 5 106 约 0 2 ml 输入经 3 5 G y 照 射的 SCID 鼠 尾静脉, 24 h 后 处死小鼠, 将肺、心、肝、脾、肾 和肠 作冰冻 切片, 片 厚 30 m 在荧光显微镜 下观察计数 10 张切片的荧光细胞; 取骨髓 及胶原酶处理过的骨髓和肝、脾细胞( > 1 105) 的悬 液涂片 在荧光显微镜下观察并 计数; 冲出骨 髓按常 规再 做 M SC 培 养, 7 d 后收集贴壁细胞, 在荧光显微镜下观察。 五、统计方法: 所有数 据以 x s 表示, 用 SPSS 软 件处 理, 并进行配对 t 检验。
作者单位: 215004 苏州大学附属第二医院血液科
CD29+ + ( 91 96% ) 。新鲜标记 的人 M SC 标记 后细胞 爬片, 细胞呈典型的成纤维样发绿色 荧光见插页 3 图 1, 标记率 达 99 6% , 96 h 后荧光强度稍减, 但标记率仍达 99% 。
二、M SC 在小鼠体内 的分布: 24 h 后各组织冰冻切 片荧 光细胞数依次为肺( 125) 、肾( 23) 、脾( 3) 、肝( 2) , 心脏和小 肠 几乎无荧光细胞。来自于脾、肝和骨髓的细胞悬液的厚涂 片 镜下荧光细胞数检出率增高, 分别为 2 105 个鼠细胞含 12、 9、1 个细胞。经胶原酶消化的厚 涂片, 可数 13 个荧 光细胞。 收集冲出骨髓再培养 M SC 在镜下未 发现荧 光细胞。插 页 3 图 2 为肺脏组织冰冻 切片, 中央可 见 2~ 3 个 荧光细 胞的 断 面; 插页 3 图 3 为肾 脏组织, 边缘 可见一 个圆 形的荧 光细 胞 断面; 插页 3 图 4 为脾脏组织, 中央可见一个荧光细胞。
讨论 M SC 开始培养时, 常 为多 种细 胞的 混合 体, 传 2~ 3 代 后形成单一的成纤 维细胞, 其 表型特 点为 CD34 和 CD45 阴 性, 但高表达 CD29 和 CD44。CFDA SE 是一种细胞示踪剂, 结合在细胞表面被吞入细胞经酯酶切开发出绿色 荧光, 这 种 标记较稳定, 4 d 后标记率仍达到 99% 。 M SC 与造血干细胞( HSC) 共同 输注可 促进放 化疗后 造 血的重建, 我们以前的实 验也显 示 M SC 与骨 髓共输 给照 射 后的 Babl/ c 小鼠, 白 细胞 恢复 快, 死亡 率低, 能显 著促 进 造 血的恢复。但其机制 不明, 国外研 究主 要集中 在 M SC 是 否 能定位于骨髓。本实验 显示 MSC 只 有很 少的 量植入 骨髓, 冲出骨髓做厚涂 片及取 骨髓 再培 养后 收集 M SC, 镜 下不 能 检测到荧光细 胞, 与 Almeida、Devine 等[ 1, 2] 报道 一致。有 人 将导入抗新霉素基 因的 M SC 系植 入小 鼠体 内, 2 周 后取 出 骨髓再培养 M SC, 用新 霉素筛 选未见 人 MSC。本实 验中 将 骨头剪碎后胶原酶消化 30 min 后 收集, 可明显提 高检出率, 可能输入的 M SC 归巢骨髓后, 黏附到骨组织上, 骨髓冲吸 的 方法难以获取。本实验发现输入的 M SC 12 h 就能在骨髓中 检测到, 24 h 含量升高, 呈随 血流迁 移的过程, 48、96 h 渐 减 低, 骨 髓中的检出率与输入 M SC 数呈正相关, 与国外报道 一 致[ 3] 。 我们采用冰冻切片 法和细胞 悬液厚 涂片 法来测 定荧 光 细胞的检出率, 前者保留了组织形态较直观, 但检 出率低, 后 者检出率高, 但形态发生变化。实验也曾用流式细胞仪分 析 法虽敏感性高, 但特异性 差。本研 究证 实 M SC 细胞 回输 后 肺中含量最高, 其次是肾、肝、脾、和骨髓, 心肌和小肠几乎 没 有, 似 乎与血流量相关。MSC 体积较大, 约是白细胞的 2~ 3 倍, 且呈圆型, 但变形能力不及造血细胞, 除去细胞量和检 测 手段的影响因素, 推断可能 与肺细 胞筛滤 作用 有关, 并与 血 流量有关。 N olta 等[ 4] 发现导入 IL- 3 的 M SC 与 HSC 共输注较未修
江苏医药杂志 2004 年 4 月第 30 卷第 4 期 Jiangsu M ed J, A pril 2004, V ol 30, N o. 4
265
饰的 M SC 促进造血能 力强, 而 M SC 并 未在 骨髓中 发现, 细 胞因子可能 分泌入血再作用于 HSC。本研 究发现回输 M SC 后, 体内多种脏器都可检 出荧光 细胞的 存在, 似乎不 如 HSC 那样特异性地归巢于骨髓, 鉴此, 我们认为绝大多数 M SC 虽 不能归巢骨髓, 参与造血微环境的重 建, 但 可通过与 HSC 的 相互作用及 分泌细胞 因子 来促进 HSC 归巢 骨髓, 并促 进其 增殖和分 化, 加 快 造血 重 建。同 时 M SC 与 HSC 共 同移 植 时, 其分泌的细胞 因子不 仅可 使 HSC 在归 巢骨髓 前免 于凋 亡, 尚可调节其表面分子 表达促 进 HSC 归 巢。一旦 HSC 归 巢后, 有多少 M SC 能在骨髓中长期生存无关紧要。
3 Horw itz EM , K eat ing A . Nonhematopoiet ic mesenchymal st em cells: w hat are t hey? Cyt ot herapy, 2002, 2: 387-388.
4 Nolt a JA, H anley M B, K ohn D B. Sustained human hematopoiesis in immunodef icient m ice by co-t ransplant at ion of marrow st roma expressing human int erleukin-3: analysis of gene t ransduct ion of longlived progenit ors. Blood, 1994, 83: 3041-3051. ( 收稿: 2003-11-24)
结果 一、M SC 特点: 培养 7 d 后为单 核内皮 样细胞 及成 纤维 样细胞混合生长, 传 2~ 3 代后成 为单一 的成 纤维细 胞。流 式 示 CD34- ( 0 28% ) 、CD45- ( 0 ) 、CD44+ + ( 96 54% ) 、
基金项目: 江苏省 135 重点医学人才基金( R C2002021 ) ; 苏州大 学医学发展基金( EE123002)