氟苯尼考β-环糊精包合物的制备与表征研究

氟苯尼考β-环糊精包合物的制备与表征研究摘要:为提高氟苯尼考的溶解度和生物利用度,制备氟苯尼考β-环糊精包合物｡以β-环糊精为包合材料,采用饱和水溶液法制备包合物｡包合物用红外分光光度法､相溶解度图法､差热分析法､溶出速率法验证,并计算包合常数,比较了氟苯尼考原料､物理混合物和包合物的溶解度｡结果显示,氟苯尼考和β-环糊精包合完全,相溶解度图为AL型,形成了摩尔比为1∶1的包合物,包合常数为298.2 L/mol,在25℃时包合物的溶解度提高了7.63倍,氟苯尼考在50.0~350.0 μg/mL浓度范围内吸光度与浓度间线性关系良好｡氟苯尼考β-环糊精包合物制备方法简单,可以显著提高药物的溶解度和溶出度｡关键词:氟苯尼考;β-环糊精;包合物;饱和水溶液法;溶解度Study on Preparation and Characteristics of Florfenicol/β-Cyclodextrin Inclusion ComplexesAbstract: To improve the solubility and bioavailability of florfenicol, florfenicol/β-cyclodextrin inclusion complex was prepared by saturated aqueous solution method and then validated by infrared spectroscopy, phase solubility diagram, differential thermal analysis and dissolution rate. Furthermore, the stability constant, solubility of florfenicol, physical mixture and inclusion complex were measured; and UV spectrophotometer method was developed to determinate the concentration. The results showed that the florfenicol was included by β-cyclodextrin completely and showed a typical Al-type as the stability constant was 298.2 mol/L at 25℃. The spectra of infrared spectroscopy, differential thermal analysis, and phase solubility diagram pattern of the inclusion complex were remarkably different from the florfenicol and physical mixture. Solubility rate of florfenicol was enhanced by the formation of inclusion complex and increased by 7.63 fold. The calibration curve was linear withcorrelation coefficient r=0.9999 in the range of 50.0~350.0 μg/mL. The preparation and determination method of inclusion complex was simple and practical as the solubility and dissolution rate was improved significantly.Key words: florfenicol; β-cyclodextrin; inclusion complex; saturated aqueous solution; solubility氟苯尼考(Florfenico1,FF)又称氟甲砜霉素,是甲砜霉素的氟化物,属于动物专用的酰胺醇类广谱抗生素,化学结构见图1｡其临床应用及机制与氯霉素和甲砜霉素相似,但抗菌活性明显优于氯霉素,而且具有无再生障碍性贫血副作用､不与人类形成交叉耐药性和按规定剂量用药无毒害等优点｡所以目前在临床上应用的范围很广,如用于治疗呼吸道感染､伤寒､肠道感染等[1-4]｡但是由于FF水溶性比较差,所以市场上FF常见的剂型主要是预混剂｡有少数公司通过添加增溶剂或使用有机溶剂等方法制成的液体制剂,也常常存在稳定性较差､毒性和刺激性大等问题,最终导致用药后机体生物利用度较低,所以有必要通过制剂技术提高FF的溶解度和生物利用度｡包合技术是药剂学领域广泛应用的一项制剂技术,通过主分子对客分子的包合作用,起到增大药物溶解度､提高药物稳定性和生物利用度等目的｡β-环糊精(β-CD)是一种常用的包合辅料,它具有“外亲水､内疏水”的特殊分子结构,可以与极性､大小､形状和性质适宜的药物分子形成包合物,从而改变药物的溶解特性[5-7]｡笔者在前人研究的基础上,研制了FF/β-CD包合物,并对所得产品进行了研究,为可溶FF的推广应用提供试验数据[8-10]｡1材料与方法1.1材料试剂:FF(批号:20080905,含量为99.0%,由郑州永和制药有限公司惠赠);FF对照品(自制,含量为99.8%),β-CD(批号:20010412,北京奥博星生物技术责任有限公司);其余试剂均为分析纯｡仪器:FTS-40红外光谱仪(美国伯乐公司);CRY-32P差热分析仪(上海精密科学仪器有限公司),TU-1810PC紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);ZRC-6FT智能溶出测定仪(天津创兴电子设备制造有限公司);DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司);SHA-C水浴恒温振荡仪(江苏金坛市佳美仪器有限公司) ;FA2004A分析天平(上海良平仪器仪表有限公司);DZF-6021型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)｡1.2方法1.2.1测定波长的选择精密称定105℃干燥至恒重的FF对照品500 mg,置于50 mL容量瓶中,加无水乙醇溶解并定容,制成FF浓度为10 mg/mL的FF贮备液｡然后吸取贮备液适量,用去离子水稀释,制成FF浓度为250 μg/mL的溶液,另取β-CD 适量制成辅料溶液｡以去离子水为空白,按照分光光度法,在200~400 nm的波长范围内扫描｡1.2.2标准曲线的绘制精密量取贮备液10 mL,置于100 mL容量瓶中,加去离子水稀释,制成FF浓度为1mg/mL的对照样品溶液,然后分别精密吸取对照样品溶液0.5､1.0､1.5､2.0､2.5､3.0､3.5 mL置于10 mL容量瓶中,加去离子水定容,制成FF浓度分别为50､100､150､200､250､300､350 μg/mL的溶液｡以去离子水为空白,按照分光光度法,在266nm的波长处测定吸光度,并以吸光度A对相应的浓度C进行线性回归,求回归方程｡1.2.3回收率试验精密称取β-CD 9份,每3份为1组｡按低､中､高3个水平分别精密加入一定量的FF对照品溶液,按照1.2.2项测定FF的含量,计算回收率｡1.2.4精密度试验取1.2.2项浓度为200 μg/mL的FF溶液,连续测定5次,考察方法的精密度｡结果显示RSD=0.28%,表明方法的精密度良好｡1.2.5包合物的制备称取FF 1.791 g,加入适量N,N-二甲基甲酰胺溶解｡另称取β-CD 5.675 g,加去离子水适量,在60℃恒温水浴中制成饱和溶液｡将β-CD饱和溶液置于磁力搅拌器上,搅拌速率为200 r/min｡在搅拌条件下,缓缓滴入含FF的N,N-二甲基甲酰胺溶液,待反应液呈均相后,继续搅拌 5 h,停止加热,搅拌至室温,置冰箱中冷藏24 h,抽滤,沉淀物用少量乙醇洗涤,然后于60℃真空干燥即得[11,12]｡1.2.6包合物的验证1)红外分光光度法｡用KBr将FF､β-CD､二者物理混合物､FF/β-CD包合物分别压片,在500~4 000 cm-1处分别测红外吸收光谱｡2)相溶解度图法｡参考Higuchi等[13]的方法,精密称取β-CD 0.850g置于50mL 容量瓶中,加去离子水适量溶解并稀释至刻度,摇匀｡然后将β-CD溶液用去离子水稀释成摩尔浓度分别为0､0.002､0.004､0.006､0.008､0.010 mol/L的溶液｡取上述β-CD溶液各10 mL分别置于25 mL的容量瓶中,均加入过量FF,恒温(25℃)下振荡72 h,过滤｡取滤液2 mL置于50 mL的容量瓶中,加去离子水定容,摇匀｡以去离子水为空白,在266 nm的波长处测定吸光度,以标准曲线求出FF的浓度｡以β-CD 的摩尔浓度为横坐标,FF的摩尔浓度为纵坐标拟合曲线,求出回归方程｡根据回归方程,计算包合常数Kf,计算公式为Kf =｡其中,斜率为回归方程的斜率,S0为截距｡3)差热分析法｡分别精密称取FF､β-CD､二者物理混合物､FF/β-CD包合物各5 mg,置于差热分析仪微坩埚中,以α-Al2O3为参比物,在空气下以升温速率10℃/min进行测定｡比较各个组分的差热曲线[14]｡4)包合物溶出速率法｡称取FF原料､FF与β-CD的物理混合物､FF/β-CD包合物适量(相当于FF 200 mg),以去离子水900 mL为溶剂,转速为100 r/min,温度为(37.0±0.5)℃,依法操作测定溶出度｡从接触介质时开始计时,分别于2､5､10､20､30､45､60 min定点取样5 mL,同时立即补充溶剂5 mL｡取出的液体用0.8 μm微孔滤膜过滤作为供试品溶液｡以去离子水为空白,按照分光光度法,在266 nm的波长处测定吸光度,结果代入标准曲线回归方程,计算溶出度｡5)包合物溶解度法｡分别取FF､FF与β-CD物理混合物､FF/β-CD包合物适量置于10 mL容量瓶中,加去离子水制成过饱和溶液,然后置于水浴恒温振荡器中,于(25.0±0.5)℃恒温振荡72 h｡吸取上清液,用孔径为0.8 μm的微孔滤膜过滤,弃去初滤液,取续滤液以去离子水适当稀释,按照分光光度法,在266nm的波长处测定吸光度,结果代入标准曲线回归方程,分别计算FF/β-CD包合物及FF的溶解度[15]｡2结果与分析2.1测定波长的选择FF对照品和β-CD溶液的扫描结果见图2｡由图2可知,FF在266 nm的波长处有最大吸收｡同时,按照方法比例配制的β-CD溶液在药物特征波长处无吸收,不影响FF的测定｡故根据其波长特征,选用266 nm作为FF的测定波长｡2.2标准曲线的绘制FF在浓度50~350 μg/mL范围内,吸光度(A)与相应的浓度(C)之间的回归方程为=0.002 7C+0.007 3(r=0.999 9),线性关系良好｡2.3红外分光光度法图3显示了FF､β-CD､FF与β-CD物理混合物和FF/β-CD包合物的红外光谱图｡图3a为FF原料的红外光谱图,3 455 cm-1处为-OH伸缩振动吸收峰,1 684 cm-1处为C=O伸缩振动吸收峰,1 535 cm-1处为-NH的弯曲振动和-CN的伸缩振动吸收峰,1 276 cm-1处是-CN 的伸缩振动和-NH的弯曲振动吸收峰,和文献[15]一致｡图3b为β-CD的红外光谱图,3 389 cm-1处为β-CD分子中-OH伸缩振动吸收峰｡图3c为FF和β-CD物理混合物的红外光谱图,为FF红外光谱图和β-CD的红外光谱图的叠加｡图3d为FF/β-CD包合物的红外光谱图,从图3d可知,4个特征峰全部消失,在一些波数处仍然有FF的特征显示,可能与包合物中含有少量没有洗涤干净的FF原料有关｡这些结果充分说明形成了FF/β-CD包合物｡2.4相溶解度图法图4为FF和β-CD的相溶解度图｡表明在上述β-CD溶液摩尔浓度范围内,随着β-CD溶液摩尔浓度的增加,FF的摩尔浓度也相应增大,两者呈线性相关,线性回归方程为=0.480 4x+0.003 1(r=0.996 1),符合Higuchi和Connors理论的AL型,并且曲线的斜率为0.480 4<1,说明有摩尔比为1∶1的可溶性复合物形成｡根据公式计算包合常数Kf=298.2 L/mol｡2.5差热分析法FF､β-CD､二者物理混合物､FF/β-CD包合物的差热曲线见图5｡从图5可知,FF 原料的差热曲线,在154℃附近的强吸热峰为原料的熔点峰｡β-CD的差热曲线,在300℃附近的吸热峰为β-CD的熔点峰｡FF与β-CD物理混合物表现出FF原料和β-CD的共同特征,有FF原料和β-CD熔点峰,表明两者只是简单的物理混合,没有相互间的作用｡FF/β-CD包合物的差热曲线,FF原料在154℃附近的强吸热峰消失,只显示出β-CD的特征,表明包合物与简单的物理混合有区别,形成了新的结构体系｡2.6溶出速率法根据测定结果,以时间为横坐标,累积溶出度为纵坐标做图得图6｡结果显示FF/β-CD包合物的累积溶出度明显高于FF原料､FF与β-CD物理混合物,在短时间内达到全部溶出平衡后,溶出度稍微下降｡混合物的累积溶出度稍高于FF原料｡2.7包合物溶解度测定FF､FF与β-CD物理混合物和FF/β-CD包合物的溶解度测定结果见表1｡由表1可知,在25℃恒温条件下,FF的溶解度为1.118 mg/mL,而包合物的溶解度为8.531 mg/mL,是FF原料药物的7.63倍｡说明通过β-CD的包合作用,FF的亲水性得到了显著提高｡3小结与讨论试验用饱和水溶液法制备了包合物,使用紫外分光光度法检测药物含量,并通过红外分光光度法､相溶解度图法､差热分析法和溶出速率法验证了包合物的形成,确定了两者形成摩尔比为1∶1包合物的可能性,计算得包合常数为298.2 L/mol,研究了包合物的溶解度,发现形成包合物后可以使其溶解度达到FF原料药物的7.63倍｡包合物的制备方法有饱和溶液法､冷冻干燥法､喷雾干燥法等｡后两种方法需要特殊的仪器设备,不利于大面积推广｡采用饱和溶液法制备FF/β-CD包合物,利用β-CD在不同温度下溶解度的显著变化,能够使包合物在低温下大量析出,干燥后即可以得到成品｡该方法不需要增加设备投入,有利于制备方法的推广应用｡利于不同方法验证包合物的形成是保证药物和载体材料包合作用的必须步骤,也是检验包合物形成的有效方法｡常用的验证方法有相溶解度法､扫描电子显微镜法､差热分析法､红外分光光度法等｡FF原料药在包合前后其分子结构､外在形态､物理性质等发生了变化,产生与包合物不同的现象｡本文研究了包合前后FF的溶解特性､溶出规律､差热曲线和红外光谱变化特征,发现包合物的溶解度显著增加,差热曲线和红外光谱图与原料药有明显差异,有力地证明了包合物的形成,为后续利用包合物作为中间体制备临床用药提供了理论依据｡通过考察FF和β-CD在紫外光谱区域内的吸收特征,发现β-CD在药物的特征吸收波长处无吸收,并根据检测的线性范围､回收率和精密度等指标建立了检测FF/β-CD包合物的紫外检测方法｡方法满足检测要求,并且方法简单,符合相关单位仪器配置要求,便于推广｡参考文献:[1] 余虹,李逐波.国内氟苯尼考的合成与开发进展[J].畜牧兽医科技信息,2007(2):14-15.[2] 吕惠序. 氟苯尼考在兽医临床上的应用[J].兽医导刊,2008(3):35-36.[3] BOOKER C N,JIM G K,GUICHON P T.Evaluation of lodenieol for the treatment of undiferentiated fever in feed lot ealvas in westem Canada[J]. 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