发酵工程-第二章

A
μ
B
S0
基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（μ）的影响
当S<S0时，富集什么菌株？
当S>S0时，富集什么菌株？
连续富集培养技术分离菌株的优点

分离的菌株特别适合连续发酵生产过程 有利于分离具有某种工业生产特性的菌株 可以筛选出能共生的稳定混合培养物
B. 固体培养技术

常用于分离某些酶产生菌
四、微生物菌种的扩大培养





菌种扩大培养的目的：为微生物生长提供适宜物理 化学环境，使其迅速大量繁殖。 发酵工业生产过程中的种子必须满足以下条件： （1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能 迅速生长，迟缓期短。 （2）生理性状稳定。 （3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求。 （4）无杂菌污染。
革兰氏阳性杆菌 革兰氏阴性肠道细菌 结核杆菌 酵母状真菌 丝状真菌
药理活性化合物产生菌的筛选


药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一 个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到 治疗的目的。 筛选模型：目标酶
生长因子产生菌的筛选

筛选模型：营养缺陷型试验菌 筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进 营养缺陷型试验菌生长
筛选模型：氨苄青霉素和β -内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同 I II 无试样时（不含棒酸时），I对II菌作用不大 有试样时（含棒酸时），I对II菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性
试验菌 金黄色葡萄球菌209p
代表微生物类型 革兰氏阳性球菌
枯草杆菌6633 大肠杆菌 耻垢分枝杆菌607 白色念珠菌 青霉菌
选择压力：在选择培养基中加入所需酶 的基质
四、重要工业微生物菌种的分离

筛选菌种的重要指示：菌的营养特征、生长温度、 设备和生产过程的适应性、稳定性、产物得率、易 从培养液中回收产物。
抗生素产生菌的筛选

筛选模型：试验菌 筛选方法： 固体培养筛选 液体培养筛选
铺菌法 复印平板法
抗药性筛选
原生质体融合 主要步骤：选择亲本、制备原生质体、原生质体融合、 原生质体再生及筛选优良性状的融合子。 基因工程育种
第三节 菌种退化和菌种保藏



一 、菌种退化 1、引起菌种退化的原因 定义：指生产菌种或选育过程中筛选出来的较优良的菌株， 由于进行接种传代或保藏之后，群体中某些生理特性和形态 特征逐渐减退或完全丧失的现象。 原因：基因突变、连续传代、其他因素 2、菌种复壮定义及常用方法 退化菌种的复壮、通过宿主进行复壮、联合复壮 3、防止退化的措施 合理的选育菌种、选用合适培养基、创造良好培养条件、控 制传代次数、利用不同类型的细胞进行移种传代、采用有效 的菌种保藏方法
氨基酸产生菌的筛选
样品
预处理
初筛（除真菌）
在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板（copy 法） 平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸
对应到copy前相应
位置，找到目的菌落
u.v线杀死长好的菌落
再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂 培养后 产氨基酸菌落周围有生长圈
目的菌落进行液体培养， 对产物进行定量测定
保持稳定的生产能力。
1、种子的制备过程



实验室制备一般采用：孢子制备和液体种子（好氧 培养过程是试管、三角瓶、摇床、种子罐与厌氧培 养过程是试管、三角瓶、卡式罐、种子罐） 车间种子制备 种子罐作用：使孢子发芽，生长繁殖成菌丝体，接 入发酵罐能迅速生长。 种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数， 主要取决于两方面：菌种生长特性、孢子发芽及菌 体繁殖速度；采用发酵罐的容积
本章内容
一、菌种的来源
二、发酵高产菌种选育 三、菌种退化与保藏 四、微生物菌种扩大培养
第一节 菌种的来源
一

最常用的工业微生物 细菌 醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌 乳酸杆菌 枯草杆菌 丙酮丁醇梭菌 大肠杆菌 谷氨酸棒状杆菌
最常用的工业微生物

酵母菌

酿酒酵母 假丝酵母属
分离筛选原理与技术 筛选包括以下几个方面 （1）把分离到的野生型菌株进一步纯化并进 行代谢产物的鉴别； （2）从已知菌种和大自然中分离新菌株 ①寻找新的发酵产品的产生菌； ②寻找老产品的新的优良菌株。 选择筛选方法时必须考虑两个要点：（1）选 择性（2）灵敏度。
新种分离与筛选的步骤





（三）菌种保藏机构 1、国外菌种保藏机构 （1）ATCC(American Type Culture Collection） 美国典型菌 种保藏中心 （2）NRRL (Agricultural Research Service Culture Collection) 美国农业研究菌种保藏中心 （3）DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH) 德国微生物菌种保藏中心 （4）NBRC (NITE Biological Resource Center) 日本技术评 价研究所生物资源中心 2、国内菌种保藏机构 （1）ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心 （2）CGMCC 普通微生物菌种保藏管理中心 （3）AS 中国科学院微生物研究所 （4）CICC 工业微生物菌种保藏管理中心 （5）IFFI 轻工业部食品发酵工业科学研究所
微生物分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、目的菌。 调查研究（包括资料查阅） 试验方案设计 含微生物样品的采集 （如何使样品中含所需微 生物的可能性大？） 样品预处理 （如何在后续的操作中使这种可 能性实现） 菌种分离
根据目的菌株及其产物特点分
选择性分离方法
(定向筛选←选择压力)
随机分离方法
(用筛选方案- 检测系统进行间接分离）


链霉菌属 小单孢菌属 地中海诺卡氏菌 米苏里游动放线菌
二、工业微生物来源

1、菌种保藏机构索取有关菌种


2、自然界采集
3、发酵制品中分离目的菌株
三、微生物菌种的选择性分离


菌株分离：将一个混杂着各种微生物的样品通 过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的 特性采取迅速、准确、有效的方法对他们进行 分离筛选，进而得到所需微生物的过程。 1. 菌种选择的总趋势 野生菌→变异菌 自然选育→代谢控制育种 诱发基因突变→基因重组的定向育种
筛选产物含量高的菌株
多糖产生菌的筛选

取样特点：碳水化合物工业的废弃物 筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液 状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来 筛选高产菌。
细菌分离：以乳酸菌为例
取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中 加麦芽汁至瓶口处，封塞，25℃培养24-48h 培养基中长出绢丝状波动物，镜检 用选择性培养基分批富集培养2-3代 稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、CaCO3的琼脂培养基 根据透明圈挑选菌落 性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定） Rf值定性 （有机酸呈黄斑点） 乳酸生成量测定（滴定法） 杆状，阳性染色 初步断定乳酸菌
2. 菌种选择的要求

（1）能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成的目的产物产 量高、易于回收；

（2）生长速度和反应速度较快，发酵周期较短； （3）培养条件易于控制； （4）抗噬菌体及杂菌污染的能力强；
（5）菌种不易变异退化；
（6）对放大设备的适应性强； （7）菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。
取发酵液少许以10倍稀释成10-1-10-7 稀释分离法 取0.1ml 加入固体培养基铺平皿（×2） 在麦芽汁固体培养基上，25℃培养48-72h 形态筛选 根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用
纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次
性能测定
① 生 成子 囊 孢 子 速 度 测 定 ②发酵力测定 ③热死温度测定 ④凝集力测定 ⑤双乙酰含量测定
放线菌的分离： 以产链霉素菌种的分离为例 （从退化菌种中筛选）
取工业发酵液（含孢子）样品1环 放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀
采用稀释法制平板，获取单菌落
斜面保藏 根据高产菌的特点，选择目的菌落
高产菌恢复
放大培养，发酵液性能测试
筛选模型：形态依据
真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例


产朊假丝酵母 解脂假丝酵母 热带假丝酵母

毕赤酵母属、汉逊酵母属
最常用的工业微生物

霉菌 曲霉属 米曲霉 黑曲霉 青霉属 青霉菌：点青霉、产黄青霉 桔青霉 根霉属 德氏根霉 米根霉、小麦曲根霉 红曲霉属 紫红曲霉
最常用的工业微生物

放线菌



（二）微生物菌种保藏 1 保藏原理：采用低温、干燥、缺氧、缺乏、 营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，使 微生物处于代谢不活泼，生长受抑制的环境 中。 2 方法 ① 斜面低温保藏法 ② 砂土管保藏法 ③ 冷冻真空干燥法 ④ 液氮超低温保藏法



3、保藏菌种的质量控制 ① 保藏样品制备前，应反复核对，监测 生理生化指标，与亲本特征比较。 ② 保藏样品制备后，仍要按3%抽样检查， 一旦有误，此批全部废掉。 ③ 注重菌种保藏的连续性。
诱变剂类型 自然选育
物理
常用诱变剂
紫外线、快中子、X射线、激光等 定义：在生产过程中，不经过人工处理，利用 菌种的自发突变，选育出油量菌种的过程。 碱基类物质 2-氨基嘌呤、5-溴尿嘧啶、 8-氮鸟嘌呤 存在两种可能：菌种衰退；代谢更加旺盛，生 与碱基反应的物质 DES、EMS、NTG、NMU、NEU、 化学 产性能更高。 NA、NM、4-NQO、EI、羟胺 诱变育种 DNA分子中插入或缺 吖啶类物质、吖啶氮芥衍生 失一个或几个碱基 物 原理：理论基础是基因突变，包括染色体畸变 噬菌体、转座子 和基因突变两大类。 生物 常用诱变剂：物理、化学、生物三大类。
选择性分离原理和技术


生长条件的选择与控制原理 控制营养成分 控制培养基酸碱度 添加抑制剂 控制培养温度 控制通气条件 选择性分离技术 富集液体培养技术 施加选择压力，进行定向筛选 固体培养技术
A.富集液体培养


增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长 或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 培养方式 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题 连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选
富集液体培养 (初筛)
固体培养基条件培养
Fra Baidu bibliotek
菌种纯化
复筛
菌种纯化
初步工艺条件摸索
再复筛
生产性能测试
较优菌株1-3株
保藏及进一步做生产试验 某些必要试验和
或作为育种的出发菌株
毒性试验等
（一）含微生物样品的采集


采样时应注意的问题: 土壤微生物的分布 采土深度 土壤植被情况 采样季节 土壤的酸碱度 对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准： 土壤来源广泛 在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新 菌种
二、发酵高产菌种选育



自然选育 常规育种(诱变育种) 细胞工程育种 基于代谢调节的育种技术 基因工程育种 蛋白质工程育种 代谢工程育种
菌种选育改良的具体目标

提高目标产物的产量 提高目标产物的纯度，减少副产物 改良菌种性状，改善发酵过程 改变生物合成途径，以获得高产的新产品



诱变育种的方法 包括：诱变（出发菌株的筛选、诱变剂种类、计量的选 择）和筛选（初筛、复筛） 杂交育种 定义：人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或 原核微生物的接合、F因子转导和转化等过程，促使两 个具有不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能 优良的生产菌株。 一般程序：选择原始亲本、诱变筛选直接亲本、直接亲 本间亲和力鉴定、杂交、分离到基本培养基或选择培养 基、筛选重组体、重组体分析鉴定。
（二）样品的预处理

目的：提高分离效率 方法：

物理方法：热处理；膜过滤法；离心法 化学方法 诱饵法
（三）分离方法的选择

根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法 菌种的营养特征独特 选择性分离 生长特征独特 无选择性特征 根据产物的特征进行 随机分离
选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控 制，从而实现定向富集筛选。