蒲公英有效成分提取

蒲公英有效成分的提取与分离
1. 蒲公英有效成分的粗提取
1.1 蒲公英多糖的提取和分离
1.1.1热水浸提法提取
1.1.1.1材料预处理
称取蒲公英样品100g,干燥,粉碎至一定粒度,40目筛备用
1.1.1.2脱脂
置于圆底烧瓶中,用石油醚在索氏提取器中回流8h,脱去脂肪(多次长时间)
1.1.1.3单糖和寡糖用80%乙醇回流，以除去样品中的单糖、寡糖以及其它小分子物质的去除
1.1.1.4热水浸提
加入蒸馏水3000ml，80℃提取3h，抽滤，重复2次，合并滤液。

（多层纱布过滤）
1.1.1.5脱蛋白
Sevag法向提取液中加入1/4体积的氯仿-正丁醇（v/v4:1）混合20min,3500r/min 离心5min中层白色絮状沉淀即为蛋白质,取上清,反复重复5、6次,至中间无沉淀为止.
1.1.1.6醇析
脱蛋白完毕,向提取液中缓缓加入95%乙醇,并用玻璃棒缓慢搅拌,使乙醇浓2度达到80%,静置4h,4000r/min离心5分钟,沉淀得粗多糖.离心沉淀物,离心洗涤数次,即得蒲公英多糖.
1.1.1.7纯化
将粗多糖复溶于水,透析36h,用80%乙醇沉淀多糖.4000r/min离心5分钟,多糖沉淀分别用乙醇、丙酮洗3次,真空干燥得精致多糖.
1.1.2 超声波提取
称取蒲公英100g，干燥，粉碎至40目，置于圆底烧瓶中，用石油醚在索氏提取器中回流8h脱去脂肪，残渣按料液比1:30，提取时间4h，提取温度为70℃提取。

超声波提取3次。

提取液用活性炭进行脱色，Sevag法除蛋白，离心，去上清液，浓缩后以95%乙醇沉淀，离心提取沉淀物，无水乙醇洗涤数次，干燥，即得蒲公英粗多糖。

1.2 蒲公英中黄酮的提取
1.2.1 超声波提取
1.2.1.1原料预处理
取出干燥的蒲公英适量，用粉碎机粉碎，过60目筛，得蒲公英干粉备用
1.2.1.2总黄酮提取
取1g蒲公英干粉，在乙醇体积分数65%，料液比1:35，超声时间35min，超声温度60℃，提取次数4次。

然后抽滤，得黄酮提取液。

1.2.2 有机溶剂回流萃取
准确称取干燥蒲公英粉末1g加乙醇浸提。

乙醇浸提法：提取温度为80℃，提取时间3h，乙醇体积分数55%，料液比1:30.提取液抽滤，得滤液为黄酮提取液。

1.3 蒲公英中酚酸的提取
1.3.1 超声波提取
提取工艺流程
蒲公英→干燥粉碎→超声波提取→微孔滤膜过滤→薄层层析→紫外分光光度计测定。

取干燥蒲公英粉末，过100目筛，准确称取2.5g置于25ml锥形瓶中，精密加入5%甲酸的甲醇溶液25ml，振荡，摇匀，称定重量。

然后置超声波提取器中，超声提取30min，取出，冷却，称定重量，用5%甲酸的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀。

滤液置25ml容量瓶中，定容，即得绿原酸提取液。

1.3.2 乙醇回流萃取
称取10g蒲公英干草，粉碎（40目），置于500ml烧瓶中，加入10倍量60%的乙醇，调pH为4，80℃水浴回流提取2次，每次2h，合并滤液，12000r/min 离心10min，减压浓缩干燥后溶于10ml刻度试管后定容（试液质量浓度为1g/ml），即为粗提液。

40℃沉淀10min，离心后沉将乙醇回流法提取得到的绿原酸粗提液经ZnCl
２
淀物水洗1次，然后离心物用pH 1.5的盐酸转溶15min，上层澄清液过滤减压浓缩干燥后，溶于蒸馏水，经大孔树脂分离纯化后浓缩干燥，得到分离纯化后的绿原酸。

2. 大孔吸附树脂分离纯化蒲公英有效成分
2.1 黄酮的分离
大孔吸附树脂的预处理：将干树脂用95%乙醇浸泡24h，使其充分溶胀，湿法装柱，用95%乙醇以流速2.0BV/h洗至流出液加适量水（流出液：水=1:5）无白色浑浊，再用蒸馏水反复冲洗至无醇味；然后用5%HCl溶液浸泡3h，用蒸馏水以同样流速洗至流出液为中性；最后用5%NaOH溶液浸泡3h，用蒸馏水以同样流速洗至流出液为中性，备用。

D-101大孔吸附树脂能很好地富集纯化蒲公英花总黄酮，其最佳条件为：上样液浓度为1.24mg/ml，pH为3，上样量为2BV，室温下以流速2.0BV/h吸附饱和，用4BV的50%~70%乙醇以2BV/h的流速洗脱.
2.2 酚酸的分离
在大孔吸附树脂分离纯化过程中，上样参数是：上样液为50 mL绿原酸提取液，调pH 3，加硝酸钠使之终浓度为7%，以12 mL/min的流速通入层析柱（层析柱规格：3.5×80 cm，树脂装填高度：75 cm，树脂体积：721.2 cm3；洗脱参数是：先用蒸馏水以适当流速冲洗2倍床体积，再用体积分数为20%的乙醇以15 mol/min的流速洗脱1.5倍床体积，后改用体积分数为45%的乙醇以适当流速
洗脱1.5倍床体积，洗脱液无色时改用体积分数为95%的乙醇洗脱再生树脂柱，最后用蒸馏水洗树脂柱至无酒精味。

3.有效成分的初步鉴定
3.1黄酮的鉴定
样品提取液在氨水环境下显亮黄色，在三氯化铝存在条件下黄色明显加深，盐酸镁粉反应显黄色，证明样品溶液中含有黄酮类物质。

3.2酚酸的鉴定
样品提取液三氯化铁实验显污绿色，加入重氮盐试剂（加对硝基苯胺，亚硝酸钠）显红色，证明样品溶液中含有酚酸类物质。

4.有效成分含量测定
4.1多糖含量测定
4.1.1 标准曲线的建立
葡萄糖标准曲线的建立所得回归方程为y= 4.82x-0.001（R2 = 0.9995）
4.1.2 换算因子的计算
准确称取精制蒲公英多糖20mg，用蒸馏水溶解，定容到100ml。

蒽酮-浓硫酸法测定该样液中吸光值，并由葡萄糖回归方程计算样液中多糖含量，根据公式F=W/CD 计算换算因子，其中W 为精制多糖重量（mg）,C 为精制多糖样液的葡萄糖量（mg），D 为多糖的稀释倍数。

4.1.3 样品中多糖含量测定
准确称取1g 蒲公英粉末，经 1.2.1 法脱脂、除单糖和寡糖等杂质，加入30ml 蒸馏水，80℃提取3h，抽滤，重复2 次，合并滤液，定容到100ml，稀释100倍，蒽酮-浓硫酸法测吸光值。

根据公式X=FCD/W ×100%计算蒲公英根中多糖含量。

4.2黄酮含量测定
将1.2.2.2所得滤液取5ml移至25ml试管中，加入5%NaNO2 1ml，摇匀，放置6min，再放入10%Al(NO3)3 1ml，6min后加入4%NaOH 10ml，再用60%的乙醇定容至刻度，摇匀，放置20min后，在波长510nm处测定吸光度。

根据绘制的总黄酮标准曲线所得回归方程A=0.0091c-0.0068，R2=0.9998。

Y=(V×X)/G×10-6×100% ,式中：Y-总黄酮含量（%）；V-提取液体积（ml）；X-总黄酮浓度(μg/ml)；G-蒲公英样品质量（g）。

4.3酚酸含量测定
采用薄层层析——紫外分光光度法。

采用硅胶G板，以乙酸丁酯：甲酸：水=7.5:2.5:2.5为展开剂，展开剂用量为30ml，每次点样量为6μL。

每块硅胶板板上均点有绿原酸标准品作为对照。

在紫外灯下，样品中与标准品跑样距离相等的蓝色荧光斑点为分离出的绿原酸。

取三次跑板样之和，在330nm处用紫外分光光度法测定绿原酸含量。