不同液化处理及核酸共提取方法对痰样本中病毒核酸的提取效果比较

比较其优劣。方法将痰液样本分为二硫苏糖醇（ＤＴｒ）、氢氧化钠（ＮａＯＨ）液化痰液组，以生理盐水为对照，分 别使用ＴｌＡＮａｍｐ
Ｖｉｒｕｓ
剂盒（方法４）提取核酸，微量核酸分析仪检测核酸纯度，多重定量ＰＣＲ方法检测核酸的浓度。结果核酸纯度 测定结果：生理盐水组中方法２和方法３，ＤＴｒ处理组中方法ｌ和方法２，ＮａＯＨ处理组中方法３所提ＤＮＡ纯 度略大于１．８；各组中采用方法１所提ＲＮＡ纯度均明显超过２，方法４及ＮａＯＨ处理组中方法３所提ＲＮＡ纯 度均低于１．８，其余纯度均在正常范围内。ＰＣＲ浓度测定结果：腺病毒（ＤＮＡ）Ｃｔ值：生理盐水组＜ＮａＯＨ处理组 （ｑ＝３５．０９，Ｐ＜０．０５），生理盐水组和Ｄ．Ｉ’Ｉ’处理组间差异无统计学意义（ｑ＝２．５４，Ｐ＞０．０５）；提取方法ｌ＜方法３（ｇ＝ １２。６８，Ｐ＜０．０５），方法１、方法２与方法４之间差异无统计学意义（ｑ＝０．８４、１．６９、２．５３，Ｐ＞０．０５）；呼吸道合胞病毒 （ＲＮＡ）Ｃｔ值：生理盐水组＜ＤＴＦ组＜ＮａＯＨ组（Ｆ＝１５２．７６，１９＜０．０１）；提取方法１＜方法２＜方法３（ｑ＝６．９８、３．７５，Ｐ＜ ０．０５），方法２与方法４之间差异无统计学意义（ｑ＝１．２８，Ｐ＞０．０５）。结论痰液液化前处理会影响病毒ＲＮＡ和 ＤＮＡ的共提取，ＴＩＡＮａｍｐ Ｖｉｒｕｓ ＤＮＭＲＮＡ Ｋｉｔ和ＫＢＷ酶法对痰样本中病毒核酸共提取效果较好。 【关键词】痰；痰液液化；核酸共提取；多重定量ＰＣＲ；腺病毒；呼吸道合胞病毒 基金项目：浙江省医药卫生科技计划项目（２０１５ＺＤＡ０２５）；杭州市科技发展计划（２０１３０７３３Ｑ０４）；杭州市 卫生科技计划重大项目（２０１２ｚＤ００１）
ｏｎ
３（ｑ＝６．９８，３．７５，Ｐ＜０．０５），ａｎｄｔｈｅ：ｒｅｗｅｒｅ
ａｌｌ
ｎｏ
Ｐ＞０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏａｓ Ｔｈｅ ｓｐｕｔｕｍ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｈａｖｅ ｋｉｔ ｂｙ ＴＩＡＮａｍｐ Ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｋｉｔ ａｎｄ ＫＢＷ ｅｎｚｙｍｅ
ａｒｅ
ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ（ｍｑＰＣＲ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｕｒｉｔｙ：ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ＤＮＡ ｐｕｒｉｔｙ ｗａｓ ｓｌｉｇｈｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ １．８ ｂｙ ｍｅｔｈｏｄ ２ ａｎｄ ３ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ａ，ｍｅｔｈｏｄ １ ａｎｄ ２ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ｂ，ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ３ ｉｎ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｐ１ａｎ（２０１３０７３３Ｑ０４）；Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｍａｊｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍ
ｏｆＨｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｌａｎ（２０１２ＺＤ００１）
病毒感染易导致儿童急性呼吸道疾病，据统计 在婴幼儿中，约５０％的肺炎是由病毒引起的ｕ１。随着 分子诊断技术的不断发展，ＰＣＲ技术开始应用于临
ａｎｄ４（口－ｏ．８４，１．６９，２．５３，Ｐ＞Ｏ．０５）；ｔｈｅ
ｗｈｉｌｅｍｅｔｈｏｄ １＜ｍｅｔｈｏｄ ２＜ｍｅｔｈｏｄ
ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓｅ（ＲＮＡ）Ｃｔ
ｖａｌｕｅ：ｇｒｏｕｐＡ＜ｇｒｏｕｐＢ＜ｇｒｏｕｐＣ（砖１５２．７６，Ｐ（ｏ・０１），
ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎｍｅｔｈｏｄ ２ ａｎｄ ４（ｑ＝ｌ・２８，
０００
ｘｇ离
ｍｉｎ，
心５ ｒａｉｎ，去上清，加０．１％Ｄ７ｒｒ至１０ ｍＬ处理２０
１０
０００ｘｇ离心５ ｒａｉｎ，沉淀用１－ｘＰＢＳ缓冲液混匀洗
涤１次，最后用１ｘＰＢＳ补足至１０ ｍＬ。Ｃ管为ＮａＯＨ 处理组：１０ ０００ｘｇ离心５ ｍｉｎ，去上清，加４％ＮａＯＨ
至１０ ｍＬ，静置５ ｒａｉｎ，１０ ０００ｘｇ离心５ ｍｉｎ，去上清，
Ｃ（ｑ＝３５．０９，Ｐ＜０．０５），ａｎｄ ｔｈｅｒｅ
ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ
ｎｏ
ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ
舯ｕｐ Ａ ａｎｄ
Ｂ（ｑ５２．５４，Ｐ＞０．０５）；ｍｅｔｈｏｄ
１＜ｍｅｔｈｏｄ
３（ｑ＝１２．６８，Ｐ＜０．０５），ａｎｄ
ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｅｔｈｏｄ １，２
Ｓｐｕｔｕｍ ｗａｓ ｌｉｑｕｅｆｉｅｄ ｂｙ Ｏ．１％Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
（ＤＴＦ）（ｇｒｏｕｐ Ｂ）ａｎｄ ４％ＮａＯＨ（ｇｒｏｕｐ Ｃ）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓａｌｉｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（ｇｒｏｕｐ Ａ）．ＴＩＡＮａｍｐ Ｖｉｒｕｓ
ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｋｉｔ（ｍｅｔｈｏｄ １），ＫＢＷ ｅｎｚｙｍｅ ｋｉｔ（ｍｅｔｈｏｄ ２），ＫＢＷ ｕｎｉｖｅｒａｌ ｋｉｔ（ｍｅｔｈｏｄ ３）ａｎｄ ＴＡＫＡＲＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ＣＯ－ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｓｐｕｔｕｍ Ｈｅ Ｈｕｉ，Ｃｈｅｎ
ｏｎ
ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃ－
Ｙｉ，Ｐａｎ只愕，Ｐａｎ
Ｆｕｇｅｎ，Ｙｕ
Ｖｉｒｕｓ
ＤＮＭＲＮＡ
Ｋｉｔ（ＤＰｌ３０４２３ＴＩＡＮＧＥＮ公司）、ＫＢＷ酶法Ｋｏｎｉｎｇ
通用型酶法体液病毒ＤＮＡｍＮＡ小量制备试剂盒
（Ｃ３６１２杭州百迈生物技术有限公司）、ＫＢＷ通用 法Ｋｏｎｉｎｇ通用型体液病毒ＤＮＭＲＮＡ小量制备试 剂盒（Ｃ４６１２杭州百迈生物技术有限公司）、ＲＮＡ提 取试剂盒（９７６７ ＴＡＫＡＲＡ公司）。 三、方法 １．不同液化方法 将混合痰液平均分为３管，标记为Ａ、Ｂ、Ｃ。Ａ 管为生理盐水组，Ｂ管为Ｄｒｒｒ处理组：１０
理委员会审核［２０１５科研伦理审第（２６）号一Ｏｌｌ。 二、试剂及仪器 二硫苏糖醇（ＤＴＦ）、ＲＮＡ酶（上海源叶公司），
ＤＮａｓｅ
床病毒感染的检测，其中多重荧光定量ＰＣＲ更适合
于多种病毒混合感染的鉴别诊断【２】。应用多重ＰＣＲ 检测病毒的关键在于核酸提取，有关病毒ＤＮＡ和 ＲＮＡ提取试剂盒众多，但多只能提取单一种类核 酸，但常见呼吸道病毒往往包括多种病毒核酸，如 腺病毒（ＡＤＶ）为ＤＮＡ病毒，而呼吸道合胞病毒 （ＲＳＶ）等为ＲＮＡ病毒，其重要性相当，因此如何从 同一份痰样本中同时提取ＤＮＡ和ＲＮＡ具有重要 意义。本研究比较３种核酸共提取试剂盒从痰样本 提取核酸的效率，并对其中的核酸浓度及纯度进行 对比研究，同时研究不同液化方法对痰液核酸提取 效率的影响，从而对ＰＣＲ技术检测临床痰液样本 核酸的处理方法做优化选择，为多重ＰＣＲ技术同 时检测ＤＮＡ和ＲＮＡ病毒寻找更精确、高效的试剂 盒提供依据。 材料与方法 一、样本来源 收集杭州市第一人民医院２０１４年１１月至 ２０１５年２月经直接／间接免疫荧光法检查ＡＤＶ或 ＲＳＶ阳性的儿科患者痰液样本共２５份，将痰液混 合，使用生理盐水补足至５０ ｍＬ，取１ ｍＬ用普通 ＰＣＲ方法扩增，送上海生工生物工程公司测序验证 混合痰液中含ＡＤＶ和ＲＳＶ。痰样本取得过程征得 患儿家长同意，并通过杭州市第一人民医院医学伦
沉淀用Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ洗涤３次，最后用生理盐水补足至
Ｉ（ＴＡＫＡＲＡ公司），ＤＫ一８Ｄ型电热恒温水槽由
上海精密实验设备有限公司提供；电泳仪及凝胶成 像系统购于Ｂｉａ．Ｂａｄ公司，Ｈｅｒａｅｕｓ高速冷冻离心 机、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ一２０００１２０００Ｃ超微量核酸蛋白测定
仪由德国Ｔｈｅ加。公司提供；电子天平ＢＳＡｌ２４Ｓ．ＣＷ
由德国赛多利斯提供、ＴＩＡＮａｍｐ
Ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ＣＯ・ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
ｍｅｔｈｏｄｓ
ｏｎ
ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ ＣＯ－ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ
ｓｐｕｔｕｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
ａｄｖｅｒｓｅ ｉｍｐａｃｔ
ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｅｘｔｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ
ＣＯ—ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ
ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｍｅｔｈｏｄｓ・
［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓｌ
ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｌｏｎ Ｓｐｕｔｕｍ；Ｓｐｕｔｕｍ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ；ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ ＣＯ－ｅｘｔｒａｔｉｏｎ；Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（ｍｅｔｈｏｄ ４）ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ
ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ
ｎａｎｏ
ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｍｅｔｈｏｄｓ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ
ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｅｓｔｅｒ，ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ＷａＳ
Ｄａｏｊｕｎ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ ＡＪ毋ｌｉｃａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ
Ｆｉｒｓｔ Ｐｅｏｐｌｅ！ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ．Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１０００６，Ｃｈｉｎａ（Ｈｅ Ｈ。Ｃｈｅｎ Ｆｏｕｒｔｈ
ｒａｎｇｅ．Ｔｈｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ
万方数据
・８２・
国际流行病学传染病学杂志２０１６年４月第４３卷第２期Ｉｎｔｅｒ Ｊ
Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ—Ｉｎｆｅｃｔ Ｄ—ｉｓ，Ａｐｒｉ—ｌ ２０１６，Ｖｏ—１．４３，Ｎｏ．２
ｗａｓ
ｎｏ
ａｃｉｄ ｂｖ ｍｑＰＣＲ：ｔｈｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅ（ＤＮＡ）Ｃｔ ｖａｌｕｅ：ｇｒｏｕｐ Ａ＜ｇｍｕｐ
国际流行病学传染病学杂志２０１６年４月第４３卷第２期Ｉｎｔｅｒ Ｊ
Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ＇Ａｐｒｉｌ ２０１６，Ｖ０１．４３．Ｎｏ．２
・８ｌ・
Fra Baidu bibliotek
・论著・
不同液化处理及核酸共提取方法对痰样本中 病毒核酸的提取效果比较
何慧
陈懿
潘平
潘富根余道军
３１０００６杭州，浙江中医药大学附属杭州第一医院检验科，杭州市第一人民医院检验科
ｇｒｏｕｐ
Ｃ：ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ＲＮＡ ｐｕｒｉｔｙ ｗａｓ ｈｉｇｅｒ ｔｈａｎ ２ ｂｙ ｍｅｔｈｏｄ １ ｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ，ａｎｄ Ｗａｓ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ １．８ ｂｙ ｍｅｔｈｏｄ ４ ｉｎ
ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ３ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ｃ；ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ
（何慧、陈懿、潘平、余道军）；３２２０００浙江义鸟，浙江大学医学院附属第四医院检验科
（潘富根） 通信作者：余道军，Ｅｍａｉｌ：ｙｕｄａｏｊｕｎ９８＠１６３．ｃｏｍ
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－４１４９．２０１６．０２．００３
【摘要】目的
比较不同痰液液化方法及不同核酸提取方法共提取痰液中病毒ＲＮＡ和ＤＮＡ的效果，并 ＤＮＭＲＮＡ Ｋｉｔ（方法１）、ＫＢＷ酶法（方法２）、ＫＢＷ通用法（方法３）和单一核酸提取试
（ｍｑＰＣＲ）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ；Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓｅｓ
Ｆｕｎｄ ｐｒｏｇｒａｍ：Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅ（ｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
Ｐｒｏｊｅｃｔ（２０１５ＺＤＡ０２５）；Ｈａｎｇｚｈｏｕ
Ｙ，Ｐ弧Ｐ。Ｙｕ Ｄｎ；Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｔｈｅ ３２２０００，ｇｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ（Ｐａｎ ＦＧ）
Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，ｇｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎ＆ｅｒｓ毋Ｓｃｈｏｏｌ
ｏｆ胁如妇，Ｙｉｗｕ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｙｕ
Ｄ晒ｕｎ，Ｅｍａｉｌ：ｙｕｄａｏｊｕｎ９８＠１６３．ｃｏｍ