实验考马斯亮蓝测蛋白质含量

实验7考马斯亮蓝考 G-250染色法测定蛋白质含量

一、目的

1、学习一种蛋白质染色测定的方法

2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法

二、原理

蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。

考马斯亮蓝 G-250在酸性溶液中为棕红色，其所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合，形成蓝色的蛋白质染料复合物，在595nm处有最大吸光度，在一定的蛋白质浓度范围

内，蛋白质染料符合物在595nm处的吸光度与蛋白质杭亮成正比，因此可用于蛋白质含量测定。

反应2— 5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。在0.01 —1.0 mg蛋白质/ml范围内均可。该法操作简便迅速，

消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙

酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力

强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。

三、材料、试剂与器具

（一）试剂

1、染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，力廿100ml 85%磷酸，加水稀释至 1升。棕色瓶保存，该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。

2、标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。

3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在10— 30mg/ml

（二）器具

1、试管及试管架

2、移液管（1ml,5ml）

3、可见光分光光度计

四、操作步骤

（一）标准曲线的制作

1、取7支试管，按下表加入试剂

2、将试管摇匀，放置 20分钟。

3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm。

4、以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

（二）样品的测定

1、取一支试管，加入未知浓度的蛋白质溶液0.2ml，蒸馏水0.8ml考马斯亮蓝试剂 5ml.

2、将试管摇匀，放置 20分钟。

3、比色测定吸光值 A595nm，对照标准曲线求得蛋白质的浓度。

五、注意事项

1、由于染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠，试剂背景值会因与蛋白质结合的染料增加而不断降低，因而当蛋白质浓度较大时，标准曲线稍有弯曲，但直线弯曲程度很轻，不致影响测定

2、测定工作应在蛋白质染料混合后2min开始，力争1hr内完成，否则会因蛋白质一染料复合物发生凝集沉淀而影响测定结果。

六、实验报告

绘制标准曲线，并将实验结果与其他蛋白质测定方法比较分析。

七、思考题 1、考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量的原理是什么？ 2、考马斯亮蓝法有什么优缺点

Bradford 法的优点 是

（1） 灵敏度高，其最低蛋白质检测量可达 1卩g 。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质 -染

料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化很大。 （ 2）测定快速、简便、只需要加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要 5min 左右，颜色在 5min 至 20min 之

间稳定性也很好。

（ 3）干扰物质相对其它方法少。

缺点 是

（ 1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此 Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的

偏差。

（2） 仍有些物质干扰此法测定：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS ）和0.1mol/L 的NaOH 。 （ 3）标准曲线也有轻微的非线性。

操作注意事项： 不可使用石英比色皿 （染色不易洗掉） ，可用塑料或者玻璃比色皿，使用后立即用少量 95%

的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可以用乙醇或丙酮长时间浸泡。 721 分光光度计的操作使用

① 在接通电源前，应对仪器的安全性进行检查，电源线接线应牢固，接地线通地要良好，各个调节旋钮的起始 位置应该正确，然后再接通电源。

② 将灵敏度派或调至“ 1 ”档（放六倍率最小） ③ 开启电源开关，指示灯亮，选择开关置于“ 热 20 分钟。

④ 打开吸收池暗室盖（光门自动关闭），调节“ 于光路，使光电管受光，调节透光度“ 100%”旋钮，使数字显示为“

100.0”。

⑤ 如果显示不到“ 100” ，则可适当增加电流放大器灵敏度档数，但应尽可能使用低档数，这样仪器将有更高 的稳定性。当改变灵敏度后必须按④重新校正“ 0”和“ 100 ”。

⑥ 按④连续几次调整“ 00.0”和“ 100”后，将选择开关置于

A ，调节吸光度调零旋钮，使数字显示“ .000” 然后将待测溶液推入光路，显示值即为待测样品的吸光度值 A 。

⑦ 浓度C 的测量。选择开关由“ A ”旋至“ C ”，将标准溶液推入光路，调节浓度旋钮。使得数字显示值为已 知标准溶液浓

度数值。将待测样品溶液推入光路，即可读出待测样品的浓度值。 ⑧ 如果大幅度改变测试波长时，在调整“

00.0”和“ 100”后稍等片刻（因光能量变化急剧，光电管受光后响应

缓慢，需一段光响应平衡时间），当稳定后，重新调整“ 00.0”和“ 100”即可工作。

五、注意事项 比色皿使用注意事项： ① 拿取比色皿时，手指不能接触其透光面； ② 装溶液时，先用该溶液润洗比色皿内壁 2〜3次；测定系列溶液时，通常按由稀到浓的顺序测定；

③ 被测溶液以装至比色皿的 3/4 高度为宜；

④ 装好溶液后，先用滤纸轻轻吸去比色皿外部的液体，再用擦镜纸小心擦拭透光面，直到洁净透明； ⑤ 一般参比溶液的比色皿放在第一格，待测溶液放在后面三格。

调波长调节器至所需波长

T”，调节透光度“ 100 %”旋钮，使数字显示“ 100.0”左右，预

0”旋钮，使数字显示为 “ 0 0 . 0 ，”盖上吸收池盖，将参比

溶液置