农杆菌转化法注意问题
植物表达载体转化农杆菌操作步骤
植物表达载体转化农杆菌操作步骤来源：郭庆水的日志植物表达载体转化农杆菌操作步骤第一部分：农杆菌介导转化水稻1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。
如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。
28℃培养。
3、农杆菌感受态细胞的制备：1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。
2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化；制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。
使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。
4、DNA直接转化农杆菌：1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。
2天左右菌落可见。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）5、重组农杆菌鉴定：1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）2）小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml或10mg/ml）。
农杆菌转化流程
农杆菌转化流程农杆菌转化流程一、农杆菌转化前准备1、必需用到的实验资料（1）转录质子DNA：需要准备好转录质子DNA，一般是由特定的宿主表达稳定贮存的转录质子DNA，或从基因构建中可以获得。
（2）农杆菌载体：以合成DNA或者从宿主菌株中获得的农杆菌载体，其中可以放置表达构建，并且有足够的特殊的鉴定序列（如PCR、Restriction digest），可以鉴定它在农杆菌中的位置。
（3）其它实验质子：比如抗性菌株、生物毒素、和其它的必需的分子质子，也可以从宿主中获得。
2、建立农杆菌转化流程（1）根据转录质子DNA、农杆菌载体和实验质子的特性，建立转化流程，确定各项步骤的操作条件。
（2）根据实验室的条件，准备好相应于上述农杆菌转化流程的实验室基础设施，如冰箱、催化器及其他必须用到的实验用品。
3、准备农杆菌显微镜试剂准备好能够激活农杆菌的显微镜试剂，比如，酶共沉淀染色液，用于检测农杆菌的运动能力； UV诱导染色液，用于分析表达的转录质子pDNA在农杆菌中的分布情况；以及抗性染色液，用于分析表达的转录质子pDNA是否具有抗性。
二、农杆菌转化操作1、消毒操作消毒操作是农杆菌转化最重要的一步，需要准备好消毒设备，以及配备灭菌盘、戴手套等安全措施，严格按照安全操作步骤，进行消毒操作。
2、培养基及农杆菌培养将农杆菌放入合适的培养基中，细菌以合适的温度培养，直到细菌数量达到目标为止。
3、农杆菌转化根据预先设计好的步骤，进行农杆菌转化操作，以及对转录质子DNA、农杆菌载体和实验质子的配比等操作，最终完成农杆菌转化操作。
4、农杆菌筛选将转化后的农杆菌通过显微镜试剂以及其他实验方法进行筛选，确定转化的成功率和转录质子DNA的表达水平。
5、农杆菌转化文库构建将转化成功的农杆菌进行分离，收集多个样本进行文库构建，用于后期实验，或者进行其它实验。
农杆菌介导转化法的概述
农杆菌介导转化法的概述农杆菌介导转化法的概述自从1983年转基因植物诞生以来，植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。
植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，通过各种方法转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。
[1]目前，应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。
由于基因枪轰击的随机性，容易出现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点，而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统,外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定，是最常用的转基因技术[2]。
农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化法在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。
本文对农杆菌介导转化法进行综述。
1 关于农杆菌农杆菌[3-5]是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。
1.1根癌农杆菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含有Ti质粒，能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤，即诱发冠瘿瘤；Ti质粒是农杆菌染色体外的遗传物质，为双链共价闭合环状DNA分子，大小约200-250kb。
依据Ti质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同，根癌农杆菌可分为4种类型：章鱼碱型（Octopine）、胭脂碱型（Nopaline）、农杆碱型（Agropine）和琥珀碱型（Succinamopine）。
原始的Ti质粒根据其功能的不同可分为4个区：1.1.1T-DNA区(Transfer—DNA region)：不同来源的菌株，T-DNA的长度在12~24 kb，它是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关．T-DNA上最重要的是T-DNA区两端的边界各为25 bp的重复序列．其中14 bp 是完全保守的，分10 bp(CAGGAATATAT)和4 bp(GTAA)不连续的2组．左右2个边界(LB和RB)是T—DNA转移所必需的，只要其存在，T-DNA 可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中，转移的方向是从右向左，T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要。
农杆菌转化鉴定
农杆菌转化鉴定引言：农杆菌转化鉴定是一种常用的基因转化技术，被广泛应用于植物基因工程领域。
本文将从农杆菌转化的原理、操作步骤、鉴定方法以及应用前景等方面进行介绍。
一、农杆菌转化原理农杆菌转化是一种通过农杆菌（Agrobacterium）将外源基因转移到植物细胞中的技术。
农杆菌是一种土壤中常见的细菌，具有天然的基因传递机制。
具体而言，农杆菌通过一种称为T-DNA的群体转座子将外源基因插入到植物细胞的染色体中。
二、农杆菌转化操作步骤农杆菌转化的操作主要包括以下几个步骤：1. 构建转化载体：将外源基因插入到农杆菌的转化载体中，并在其中加入适当的选择标记基因。
2. 转化菌的培养：将构建好的转化载体导入到农杆菌中，并通过培养使其大量增殖。
3. 植物材料处理：将目标植物材料进行预处理，如组织培养、愈伤组织的诱导等，为后续的转化提供条件。
4. 植物细胞转化：将培养好的农杆菌与植物材料进行共培养，使农杆菌中的T-DNA转移到植物细胞中。
5. 选择转化植株：通过添加适当的筛选剂，筛选出含有外源基因的转化植株。
6. 验证转化效果：通过PCR、Southern blot等分子生物学技术鉴定转化植株中是否存在外源基因。
三、农杆菌转化鉴定方法农杆菌转化鉴定是为了确认转化植株中是否成功引入了外源基因。
常用的农杆菌转化鉴定方法包括以下几种：1. PCR鉴定：通过设计特异引物，进行PCR扩增，根据扩增产物的大小和序列，判断是否存在外源基因。
2. Southern blot鉴定：将转化植株的基因组DNA进行限制性酶切，然后通过Southern blot检测外源基因的特异序列。
3. 荧光显微镜观察：通过将外源基因与荧光标记基因结合，利用荧光显微镜观察植物组织中的荧光信号，以确认外源基因的存在。
4. RT-PCR鉴定：通过逆转录PCR技术，检测转化植株中外源基因的表达情况。
5. Western blot鉴定：通过Western blot技术检测转化植株中外源蛋白的表达情况。
农杆菌瞬时转化法
农杆菌瞬时转化法:一、本氏烟草的种植⑴配制基质中各成分比例如下,花卉营养土:蛭石:沙土=2:1:1，22℃16h/8h （光/暗）70%湿度（扣透明白盒2周保湿）⑵将基质浇透水后,烟草种子采用移液器点播在基质中,每盆播1，2粒种子,2-3天浇一次水。
二、农杆菌注射烟草叶片1、3周烟草(4 leaves stage)，选取生长状态良好，健壮的烟草叶片植株（年轻的、完全展开的4周大小）进行农杆菌侵染。
转化前将浇透水，转化后要控制浇水2、农杆菌准备:预培养：接种克隆至5ml LB+Antibiotics培养：用1mL预培养液接种至50ml LB+abtibiotics +Acetosyringon(final 20 µM)含Rif (100 mg/mL)、Str (100 mg/mL)和Kan (50mg/mL)三种抗生素的YEB液体培养基活化农杆菌（(GV3130)）。
检测菌液生长到指数后期 OD600=0.6，4000rpm，室温离心10min收获菌液3、配悬浊液:混匀后于4°C保存;4、重悬液（经常15ml）（10 mM MES-KOH，pH 5.6, 10 mM MgCl2, 100 μM acetosyringone乙酰丁香酮）重悬至OD600=1，（可以洗涤2次）5、同时也将同样培养的含有P19的农杆菌同样悬浮并调整悬浮液的浓度为OD600=16、根据实验设计,将以上三类农杆菌0.7:0.7:1.0体积混合,室温下静置3-4h，7、注射前烟草放在白色日光灯下1h，让气孔充分张开8、Agroinfiltration 注射：重悬菌体，用1 mL注射器（去针头）吸取菌液；避开叶脉，用注射器针在叶片上开小孔后，左手抵住叶片正面，右手轻轻将注射管口垂直压在叶片反面，右手拇指缓慢均匀用力推压，观察菌液在叶片表皮下缓慢移动，直至侵染整个叶片。
（一个植株可以注射2个叶片，不要用子叶）塑料薄膜覆盖，22℃、3天后撕取叶片下表皮于激光共聚焦显微镜下观察。
农杆菌转化法操作流程
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关于电激法做农杆菌的转化的问题(农杆菌,电激法,质粒)
农杆菌感受态细胞制备方法1．农杆菌稀释100倍过夜培养；3．5000rpm离心5min，弃去上清液；4．沉淀用1.5 ml 25mM CaCl2悬浮,冰浴20min；5．5000rpm离心5min，弃去上清液；6．每管用50μl CaCl2悬浮，20 min 后用于转化；7．加入质粒DNA 0.1～1μg，之后冰浴30 min；8．放入液N2中5min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；10．取出10～50μl菌液涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。
转化时一般200μl感受态细胞悬液（OD600为0.5-0.6）中加入的质粒含量不超过50ng,体积不超过10μl。
电转化步骤如下：1. 从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；2. 取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。
3. 将40～100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml 的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。
4. 打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。
5. 将此混合物转移至已预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部；6. 将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1000μl的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。
7．37℃，220－250rpm复苏1小时。
8. 取20ul转化产物加160ulSOC涂板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。
其余菌液加1：1的30％的甘油后混匀－80℃保存。
注：每块加有Amp的平板上均匀涂有X-Gal 80μl ，SOC 80μl，IPTG 20 μl。
电击杯清洗流程1．用清水将电击杯稍冲一下。
2．向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr。
3．弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。
4．加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30分钟。
农杆菌转化实验步骤
农杆菌转化实验步骤
农杆菌转化实验步骤
农杆菌转化是一种常用的基因转移技术，可以将外源DNA导入植物细胞。
下面是农杆菌转化实验的基本步骤：
1. 制备农杆菌：首先，选择适合的农杆菌株，常用的是农杆菌株Agrobacterium tumefaciens。
接种农杆菌于适宜的培养基中，培养至合适的生长期。
2. 构建质粒：在进行转化实验前，需要构建包含目标基因的质粒。
质粒可以通过常规的分子生物学技术，如PCR扩增、限制性酶切和连接等方法来获得。
3. 准备细菌：将构建好的质粒转化到农杆菌中。
通常采用电穿孔或热激方法，使质粒能够进入农杆菌内。
4. 感染植物：选择适当的植物愈伤组织或幼苗作为接受体，将其暴露在含有农杆菌的培养基中。
农杆菌会侵入植物细胞，并将质粒转移
到植物基因组中。
5. 抗生素筛选：转化后的细菌通常在培养基中含有特定抗生素。
将被转化的植物细胞接种于含有抗生素的选择培养基中，该抗生素能够选择出已转化的细胞。
只有具备目标基因的细胞能够生长并形成抗性。
6. 再生植物：选定抗生素抗性的植物细胞，进一步培养和处理以促进其发育和增殖。
通过激素处理和适当的培养条件，可以使其分化成完整的植株。
7. 验证转化：最后，通过分子生物学技术，如PCR和Southern blot 分析，来确认转化的植物是否成功地获得了外源基因，以及其在植物细胞中的表达。
农杆菌转化实验是一种常用且有效的方法，可用于植物基因工程及改良研究。
通过以上步骤，可以成功将目标基因导入植物细胞中，以获得具有所需性状的转基因植物。
农杆菌转化
农杆菌转化植物表达载体转化农杆菌操作步骤第一部分：农杆菌介导转化水稻1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。
如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。
28℃培养。
3、农杆菌感受态细胞的制备：1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。
2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化；制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。
使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。
4、DNA直接转化农杆菌：1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。
2天左右菌落可见。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）5、重组农杆菌鉴定：1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）2）小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml 或10mg/ml）。
水稻农杆菌转化方法
方法1NB基本培养基(右边的为N6,大量相同,加glycine甘氨酸2 mg/L)KNO3 2830 mg/L(NH4)2SO4 463 mg/LKH2PO4 400 mg/LMgSO4.7H2O 185 mg/LCaCl2.2H2O166 mg/LFeSO4.7H2O 27.8mg/L 5.6Na2EDTA 37. 5 mg/L 7.5MnSO4.4H2O 10 mg/L 27.8H3BO3 3 mg/L 1.6ZnSO4.7H2O 2 mg/L 1.5Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L 0.25CuSO4.5H2O 0.025 mg/L 0.025CoCl2.6H2O 0.025 mg/L 0.025KI 0.75 mg/L 0.8盐酸硫胺素thiamine CHL VB1 10 mg/L 0.1盐酸吡哆醇pyridoxine-CHL VB6 1 mg/L 0.5烟酸nicotinic acid 1 mg/L 0.5肌醇myo-inositol 100 mg/L 100水解酪蛋白300 mg/L谷氨酰胺500 mg/L脯氨酸500 mg/L蔗糖30,000 mg/LPHytagel 2.6 mg/LpH 5.8Basic培养基B N6（大量）50ml （20倍）A Ms-Fe盐10-20ml（100倍）CH 0.3g/LS B5 macro 10ml （100倍）phytogel 4g/L或agar 8g/L I B5 vita 10ml （100倍）sucrose 30g/LC proline 0.5g/L glutamine 0.5g/LN6 (大量梗稻种子) 终浓度母液(20倍) 终浓度母液(20倍)培KNO32830mg/L56.6g/L Mg SO4.7H2O185 mg/L 3.7 g/L养(NH4)2SO4463 mg/L9.26 g/L CaCl2.2H2O 166 mg/L 3.32 g/L基KH2PO4400 mg/L8.00 g/L制备1 KNO3, (NH4)2SO4, KH2PO4同时倒入烧杯,加水搅拌, 使之完全溶解.2 Mg SO4.7H2O 先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅, 不能有沉淀.3 CaCl2.2H2O的配制同Mg SO4.7H2O4 配好后放于棕色瓶4℃保存MS(大量籼稻种子)终浓度母液(20倍) 终浓度母液(20倍)培KNO31900 mg/L38g/L Mg SO4.7H2O 370 mg/L7.4 g/L养NH4NO3 1650 mg/L33 g/L CaCl2.2H2O 440 mg/L8.8 g/L基KH2PO4170 mg/L 3.4 g/L制备1 KNO3, NH4NO3, Mg SO4.7H2O同时倒入烧杯,加水搅拌2 KH2PO4先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅,3 CaCl2.2H2O同KH2PO44 配好后放于棕色瓶4℃保存Ms(大量花药用)终浓度母液(20倍) 终浓度母液元素KNO32830mg/L56.6g/L Mg SO4.7H2O 370 mg/L7.4 g/L培养(NH4)2SO4 231 mg/L 4.62 g/L CaCl2.2H2O 160 mg/L3.2 g/L基KH2PO4641 mg/L12.82 g/L制备1 KNO3, (NH4)2SO4, KH2PO4同时倒入烧杯,加水搅拌2 Mg SO4.7H2O 先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅,不能有沉淀.CaCl2.2H2O的配制同Mg SO4.7H2O3 配好后放于棕色瓶4℃保存YM脓杆菌培养基KH2PO4 0.5g/L Mannitol 10g/L L-Glutamine2g/LNaCl 0.2g/L M g SO40.2g/L Yeast extract0.3g/LAgar 15g/L PH=7.0诱导愈伤、继代培养基basic+2,4-D(2mg/L) PH=5.8共培养培养基液体:N6(大)+Fe+B5(micro)+B5(vita)+ sucrose(前四项与basic相同)+ 肌醇2g/L+ CH500mg/L+phytogel+0.1%AS固体:N6(大)+Fe+B5(micro)+B5(vita)+ sucrose(前四项与basic相同) + 肌醇2g/L+ CH500mg/L+2,4-D (2mg/L)+ phytogel +0.1%ASPH=5.5 加2,4-D前后都要调PH值.灭完菌,温度降下来后加AS筛选培养基诱导愈伤+cef(300mg/L)+hyg(50mg/ml) PH=5.5一筛,二筛的cef,hyg的浓度依次逐渐下降分化1: basic+KT(4mg/L)+NAA(0.25mg/L)+cef(300mg/L)+hyg(50mg/L)培养2: basic+KT(0.5mg/L)+NAA(0.25mg/L)+6-BA(2mg/L)+cef(300mg/L)+hyg(50mg/L)基PH=5.8分化培养基NB培养基：6-BA,2.5mg,NAA,0.25mg,KT,0.5mg壮苗培养基(生根)sucrose 30g/L N6 25ml/L MS-Fe盐10ml/LB5vita 10ml/L agar 7g/LMS-Fe盐(必须单独配制,否则会沉淀,用鳌合铁)终浓度母液(100倍)FeSO4.7H2O 27.8mg/L 2.78g/LNa-EDTA 37.5mg/L 3.75g/L制备1 FeSO4.7H2O溶解于水, Na-EDTA溶解于热水,将两者混合定容,于微波炉中加热,煮沸,颜色变深,冷却到室温,补水, 棕色瓶4℃保存2,4-D母液(1g/ml) 用无水乙醇溶解2,4-D后缓慢加入到H2O中,搅拌,如产生沉淀,则重配.配好后4℃保存NAA母液(1g/ml) 用1N KOH 溶解NAA,用水稀释定容, 4℃保存PAA母液(1g/ml) 用无水乙醇溶解加H2O搅拌,定容,4℃保存6-BA母液(1g/ml) 用HCl溶解, 加少量HCl后,用玻棒研磨成糊状,再加HCl使之完全溶解AS（乙酰丁香酮）用DMSO直接溶解定容19.62mg/ml,分装到无菌小管KT 母液(5mg/ml)用1NKOH溶解，用水稀释定容到10ml，过滤灭菌后分装到EP管中，冰冻保存B5 vitamin终浓度母液(100倍) 终浓度母液(100倍)肌醇100mg/L 10g/l Nico-acid 1mg/l0.1g/lpyrido(B6) 1 mg/L 0.1 g/l thiamin(B1) 10 mg/L1 g/l棕色瓶4℃保存(每次配100ml为好), 肌醇在配培养基时,加入到培养基中B5(micro)KI 0.75mg/L H3BO3 3.0mg/L MnSO4 10mg/L ZnSO4 2.0mg/LNa2MnO4.2H2O 0.25mg/LCuSO40.025mg/L CoCl20.025mg/L程序1.种子去皮，挑成熟完整健康的种子2.用70%乙醇清洗浸泡2-3分钟，洗3-4次，用0.1%升汞浸泡20-40分钟3.无菌水洗3至4次4.置于虑纸上吹干,吹3小时以上5.摆放到诱导愈伤培养基上，黑暗中培养15-20天，直到长出黄色较大的愈伤6.剥下愈伤，转至继代培养基上，黑暗培养2周7.共培养。
构建表达载体的实验流程及其注意事项
质粒纯化：
1、PEG纯化
缺点：摇菌液几百毫升，耗时长，步骤繁多 优点：质粒纯度高（不含线状DNA）
浓度大
2、过柱法：
缺点：柱子吸附能力有限，浓度低，纯度差（甚至有RNA） 优点：省时省力
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质粒的电泳
Marker是酶切片段； 质粒是环形的，还会形成超螺旋结构。
30
质粒验证
1、酶切验证
一般将质粒切成2-3个片段，片段大小是否相符？ 如：连接后酶切的载体片段、目标片段大小与连接前相同？
三、人工化学合成
最后的选择。公司会将合成片段连入克隆载体。需测序验证。
12
汇报内容
1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测
13
基因工程所用的酶
限制性内切酶 从商品目录上得到有关信息
EcoR I
Pst I
GAATTC CTTAAG
CTGCAG GACGTC
验证每步产物，设置对照以检查每一反 应的效率，都是可取的良策。而要对上述问题应对自 如，又必须透彻理解每一步实验流程所涉 及的实验原理。
——第一版前言（p11）
《分子克隆实验指南》 第二版 ，1996，科学出版社
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汇报内容
1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测
质粒提取：碱裂解法
收获细菌：含有质粒的DH5α、TOP10等 LB可富集2-3次，Teriffic可2次。
溶液Ⅰ： Tris-HCl, EDTA, 葡萄糖 溶液Ⅱ： NaOH, SDS
冰上3-5min，时间过长会： 质粒断裂；羟基化影响酶切
溶液Ⅲ：乙酸钾，冰乙酸 迅速颠倒3次混匀后，置于冰上
提高农杆菌转化效率方法
提高农杆菌转化效率方法
答案：
使用预热的热激液。
分别预热两管热激液，第一管38℃，第二管42℃，并准备冰浴。
用38℃的热激液处理后立即放入38℃水浴热激8分钟，随后冰浴3分钟。
之后用42℃的热激液处理并立即放入42℃水浴热激1分30秒，最后调水浴至20℃让溶液自然降温。
原生质体共培养法。
通过纤维素酶和果胶酶处理去除植物细胞壁，将原生质体与农杆菌混合，离心后收集原生质体，放在含抗生素的选择培养基上筛选转化细胞，再生植株。
此方法可处理多个细胞，得到较多转化体，且转化、再生后的植株不含嵌合体。
植物组织与器官共培养法。
使用离体植物的组织或器官作为外植体进行转化。
由于植物伤口对农杆菌敏感，创伤部位细胞易脱分化，此方法转化细胞成苗率较高。
整株感染法。
模拟农杆菌天然感染过程，在植物上造成创伤后注射农杆菌进行侵染。
农杆菌感受态制作和转化
农杆菌感受态制作
1.取保存的菌种，在含相应抗生素的YEB固体培养基上划线，28℃、培养24~36h至长出
单菌落。
2.挑取农杆菌单菌落，接种于5ml含有相应抗生素的液体YEB培养基内。
28℃、250rpm
培养24~36h，至菌液OD600约0.5~0.6
3.按2%体积，将菌液加入含相应抗生素的液体YEB培养基中，28℃、250rpm培养至OD600
为0.5~0.6。
4.4℃、5000rpm离心10min，收集菌体。
5.加入和扩大培养时培养液相同体积的70mmol/L CaCl溶液，重悬。
6.4℃、5000rpm离心10min，收集菌体。
7.加入体积为扩大培养时培养液1/10的70mmol/CaCl溶液，重悬。
8.分装为100μL的小分，至于冰上备用。
9.若要冻存，需加入终浓度为15%~20%的甘油。
-80℃冻存。
注：4~9步请注意无菌操作！。
农杆菌转化法作用
农杆菌转化法作用
农杆菌转化法作为一种常见的基因转移技术，被广泛应用于生物学和农业领域。
本文将从农杆菌转化法的基本原理、应用领域、优缺点等方面进行介绍。
一、基本原理
农杆菌转化法基于农杆菌与植物细胞间的互作关系，将外源DNA 转移至植物细胞中，实现基因转移。
其基本原理是将外源DNA与农杆菌质粒（Ti质粒）连接，然后将这些质粒转移至农杆菌细胞中，接着再将农杆菌与植物细胞接触，使质粒中的DNA转移到植物细胞中。
转移过程中，农杆菌的生物学特性是关键因素，包括其菌株的选择、营养物质的添加等。
二、应用领域
1.植物基因工程：农杆菌转化法是植物基因工程中最常见的技术之一。
利用农杆菌转化法可以将外源基因导入植物细胞中，实现多种基因功能的表达或靶向编辑。
2.农业生产：农杆菌转化法可以被用于改良农作物的品质和产量。
例如，通过导入耐盐碱性基因或高产基因，可以提高作物的适应性和产量。
3.医学研究：农杆菌转化法在医学研究中也有应用。
例如，将荧光
蛋白基因转移到哺乳动物细胞中，可以用于细胞追踪和药物筛选。
三、优缺点
1.优点：农杆菌转化法具有高效、简便、可重复性好等特点。
同时，该技术也可应用于多种植物物种中。
2.缺点：农杆菌转化法也存在一些缺点，如转化效率和稳定性会受到多种因素的影响，如农杆菌菌株的选择、植物细胞的生长状态等。
四、总结
农杆菌转化法作为一种常见的基因转移技术，具有广泛的应用前景。
虽然该技术存在缺点，但是其高效、简便的特点仍然使其成为一种重要的基因转移技术。
我们相信，在今后的生物学和农业领域中，农杆菌转化法会继续发挥重要的作用。
农杆菌介导转化法的概述
农杆菌介导转化法的概述农杆菌介导转化（Agrobacterium-mediated transformation）是一种常用的转基因技术方法，用于将外源基因导入目标植物的基因组中。
该方法利用一种土壤细菌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens或Agrobacterium rhizogenes）作为载体，将目标基因转移到植物细胞中。
农杆菌介导转化法具有高效、广谱、可逆和整合性等特点，因此被广泛应用于农业和植物基因工程研究中。
2.转化农杆菌：将农杆菌和构造体进行共转化。
这个步骤需要确保构造体能够稳定地进入到农杆菌的细胞质中，并且能够被菌体所拷贝。
一般使用电击法、化学法或冷冻法来完成这个步骤。
3.培养农杆菌：将转化后的农杆菌分别培养在选择性培养基上，以筛选出带有目标基因的菌落。
4.感染植物：通过注射或浸渍等方式将培养得到的农杆菌菌体引入植物的组织或细胞中。
农杆菌会通过分泌细菌素（也称为转化素）的方式进入植物细胞，并在转化素环境下将目标基因导入到植物基因组中。
5.再生转化植株：利用组织培养方法，将含有目标基因的植物细胞培养至完整植株。
这个步骤需要将转化素与细胞分裂激素配比得当，以促进细胞分裂和组织再生。
6.筛选转化株：利用选择标记基因识别并筛选出携带目标基因的转化株。
一般使用抗生素选择法或草酮酸合酶标记法进行筛选。
7. 鉴定转化株：对筛选出的转化株进行鉴定，确认目标基因已经整合到植物基因组中。
一般利用PCR、Southern blot或Northern blot等方法进行鉴定。
通过以上步骤，农杆菌介导转化法可以实现将外源基因导入目标植物中，从而改变植物的性状或增强植物对生物胁迫的抗性。
该方法已经广泛应用于农作物的育种研究以及植物的分子生物学研究中。
农杆菌转化法单子叶植物
农杆菌转化法单子叶植物农杆菌转化法是一种常用的植物遗传转化技术，它是利用土壤中普遍存在的一种生物——农杆菌的特殊细胞质遗传机制来实现将外源基因导入植物细胞内的方法。
这种技术不但可以用来转化双子叶植物，而且在单子叶植物中也得到了广泛的应用。
单子叶植物是指种子植物的一类，其胚种子由一个种皮、一对子叶和一个胚根组成，与双子叶植物不同。
单子叶植物在农业生产中占有重要地位，例如水稻、小麦、玉米等。
在进行单子叶植物的农杆菌转化时，需要充分考虑其特殊的生理与生物学特点。
一般来说，在进行单子叶植物的农杆菌转化前，我们需要先获得相应的植物组织（例如愈伤组织、幼胚等）和合适的农杆菌菌株，并进行预处理。
预处理的目的是为了让菌株和植物细胞更好地结合，提高转化率。
预处理方法可以根据不同的单子叶植物特点进行调整，例如水稻的处理时间较长，需要进行10-15天的预处理；而小麦则只需要进行1-2天的处理。
在预处理完成后，需要将待转化的外源基因DNA与农杆菌载体进行连接，并将其导入到菌株中。
具体的操作可以通过化学转化、电转化或热激转化等多种方法来实现。
这些方法的选择与实际情况有关，需要在实践中根据不同的物种和实验条件进行选择。
转化后的农杆菌菌株需要进行筛选和评估，以确认外源基因已经成功地导入了植物细胞内，并且被稳定地集成到了细胞核中。
评估方法可以通过PCR检测、Southern blotting、Northern blotting、Western blotting等方法来实现。
这些方法主要是对转化植株的基因型和表达水平进行分析，以确保外源基因已经集成到植物细胞内，并且能够正常表达。
农杆菌转化法在单子叶植物中的应用不仅可以进行基础研究，还可以用于农业生产中的性状改良和优良品种选育。
例如，我们可以通过外源基因的导入来实现对一些逆境生存能力的增强，如抗病、耐旱、抗盐碱等。
此外，这种技术还可以用于挖掘植物自身天然的次生代谢产物和活性成分，以改善产品的质量和营养价值。
植物表达载体转化农杆菌操作步骤
植物表达载体转化农杆菌操作步骤来源：郭庆水的日志植物表达载体转化农杆菌操作步骤第一部分：农杆菌介导转化水稻1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。
如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。
28℃培养。
3、农杆菌感受态细胞的制备：1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。
2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化；制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。
使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。
4、DNA直接转化农杆菌：1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。
2天左右菌落可见。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）5、重组农杆菌鉴定：1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）2）小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml 或10mg/ml）。
农杆菌介导转化方法
农杆菌介导转化方法农杆菌介导转化方法是一种常用的基因转化技术，广泛应用于植物、微生物等领域。
本文将介绍农杆菌介导转化方法的原理、步骤和应用。
一、原理农杆菌介导转化方法是利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）作为载体，将外源基因导入目标细胞中的一种方法。
农杆菌是一种自然界广泛存在的土壤细菌，它能将其自身的DNA转移到植物细胞中，从而导致植物发生病理性变化。
利用这一特性，科学家将目标基因插入到农杆菌的载体DNA中，通过农杆菌的感染作用，将目标基因导入到目标细胞中。
二、步骤农杆菌介导转化方法通常包括以下几个步骤：1. 农杆菌培养：首先需要将含有目标基因的农杆菌培养至适宜的生长期，以保证其感染能力。
2. 植物处理：将目标植物的组织经过表面消毒处理，然后将其切割成小片或小块，以增加接触面积。
3. 农杆菌感染：将培养好的农杆菌与植物组织接触，使其感染植物细胞。
通常使用浸泡法或注射法进行感染。
4. 抗生素筛选：在感染后的组织中加入适当浓度的抗生素，以筛选转化成功的细胞。
只有携带目标基因的细胞才能够存活下来。
5. 培养和再生：将筛选出的转化细胞进行培养和再生，形成转基因植株。
三、应用农杆菌介导转化方法已成功应用于多种植物和微生物中，具有以下几个优点：1. 高效性：农杆菌介导转化方法可以在较短时间内实现大量基因转化，且转化效率较高。
2. 转基因稳定性：通过农杆菌介导转化方法获得的转基因植株通常具有较高的遗传稳定性，能够稳定地传递给下一代。
3. 广泛适用性：农杆菌介导转化方法适用于多种植物和微生物，包括农作物、果树、花卉等。
可以用于改良作物的品种、抗病性、耐逆性等性状。
4. 无需种子：与传统的植物遗传改良方法相比，农杆菌介导转化方法无需使用种子，能够直接利用植物的组织进行转化，节约了时间和资源。
5. 无需外界辅助：农杆菌介导转化方法不需要借助特殊设备或昂贵试剂，只需在实验室条件下进行即可。
农杆菌直接转化法：冻融法
Ⅲ、农杆菌直接转化法：冻融法一旦预期的分子在大肠杆菌中被构建，该分子可通过冻融法直接转化入土壤农杆菌中。
尽管与三亲杂交法相比，冻融法转化的效率仅为103个转化子/mgDNA，但该法是可靠快速的。
该法也可以去除三亲杂交法造成的质粒重排现象。
1、含有辅助Ti质粒的农杆菌单菌落（2-3mm）接种于5mlYEP培养基中，28℃过夜培养；2、取1ml过夜培养物于含有100mlYEP的250ml三角瓶中，并在28℃下，剧烈振荡（250rpm）培养至OD值为0.5-0.6；3、取50ml培养物置于冰上冷却5min，4℃，5000rpm，离心5min；4、A、弃去上清液，用1ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬沉淀菌体，分装重悬物于Eppendorf小试管内（0.1ml/管），用于后续试验；B、弃去上清液，用1ml冰冷的0.1MCaCl2溶液重悬沉淀菌体，分装重悬物于Eppendorf小试管内（0.1ml/管），并添加15%的甘油，液氮速冻后，-80℃保存；5、A、直接取分装后的感受态农杆菌（0.1ml/管），加入1-2μg的质粒，轻轻混匀；B、取-80℃保存含感受态菌株的Eppendorf小试管一支，在冰上融解后，加入1-2μg的质粒，轻轻混匀；6、冰上放置30min，再用液氮速冻5min；7、将小管放于37℃水浴中5min，融解细胞；8、加入1mlYEP培养基于试管内，28℃，200rpm，振荡培养2-4h。
该过程使得菌体表达抗生素抗性基因；9、4℃，5000rpm，离心30s，弃去上清液，再用0.1mlYEP培养基重悬沉淀细胞；10、涂布重悬物于含有20μg/mlRif和50μg/mlKanamycin的YEP平板上，28℃共育。
2-3d后转化克隆出现。
农杆菌转化法注意问题
一、简介
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性
细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子 叶植物的受伤部位，并诱导产生冠痪瘤或发状根。 根想农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和 Ri质粒，其上有一段T—DNA，农杆菌通过侵染植物 伤口进入细胞后，可将T—DNA插入到植物基因组 中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。 人们将目的基因插入到经过改造的T—DNA区，借 助农杆菌的感染实现外源基因向植物胞的转移与 整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基 因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中， 近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物(尤其 是水稻)中也得到了广泛应用。
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细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子 叶植物的受伤部位，并诱导产生冠痪瘤或发状根。 根想农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和 Ri质粒，其上有一段T—DNA，农杆菌通过侵染植物 伤口进入细胞后，可将T—DNA插入到植物基因组 中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。 人们将目的基因插入到经过改造的T—DNA区，借 助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与 整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基 因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中， 近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物(尤其 是水稻)中也得到了广泛应用。