纳他霉素的发酵生产、分离纯化及检测

纳他霉素的发酵生产、分离纯化及检测
摘要：本实验利用褐黄孢链霉菌接种斜面得到该菌孢子再将其接种到种子培养基中得到
发酵种子液，再将少量种子液接种到发酵培养基中进行纳他霉素发酵，得到了纳他霉素产物0.24g，并在整个实验过程定时镜检观察菌体形态变化及测量发酵产物量。

关键词：褐黄孢链霉菌；纳他霉素；发酵；纯化；镜检
引言：纳他霉素是一种多烯大环内酯类抗真菌剂，也称游链霉素或匹马霉素。

它是近白色
至奶油黄色结晶粉末，几乎无臭无味，溶点280℃，分子式C33H47013,相对分子质量665.75。

纳他霉素是一类两性物质，分子中有一个碱性基团和一个酸性基团，等电点为6.5，其在水中和极性有机溶剂中溶解度很低，不溶于非极性溶剂，室温下在水中的溶解度为30～50mg/L，易溶于碱性和酸性的水溶液，转变为胆酸盐形式后溶解度可迅速增加。

纳他霉素在发酵生产中中常用的菌种有恰塔努加链霉菌、纳塔尔链霉菌和褐黄孢链霉菌。

本次所用菌种为褐黄孢链霉菌。

发酵过程中，培养液中各成分的浓度和类型都会影响纳他霉素的生物合成，其中碳氮比是最关键的因素之一，氮源促进菌体的生长繁殖。

纳他霉素在以葡萄糖为碳源时产量最高。

纳他霉素能够专一性地抑制酵母菌和霉菌，故纳他霉素已被广泛应用于食品防腐和真菌引起的疾病的治疗等。

在发酵过程中，培养液中各成分的浓度和类型都会影响纳他霉素的生物合成，其中碳氮比是最关键的因素之一，氮源促进菌体的生长繁殖，同时要在发酵中流加补充适当的碳源（葡萄糖）。

纳他霉素在以葡萄糖作为碳源时产量最高，这是因为葡萄糖能渗入纳他霉素的分子中去。

有资料表明，氮源的类型对菌体生长和纳他霉素的产量有较大影响，菌体细胞生长最好的氮源是酵母抽提物，而纳他霉素产生的最佳氮源是牛肉浸出物。

1.实验材料与方法
1.1材料：
1.1.1发酵菌种：褐黄孢链霉菌
1.1.2培养基：
孢子斜面培养基：酵母提取粉4g/L，麦芽提取粉10 g/L，葡萄糖4 g/L，琼脂20 g/L；pH7.0
摇瓶种子培养基：葡萄糖15 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L；pH7.0
摇瓶发酵培养基：大豆分离蛋白19.5 g/L，麦芽糊精50 g/L，酵母提取粉4 g/L葡萄糖6 g/L，pH7.0
1.1.3实验试剂：酵母提取粉，葡萄糖，琼脂，蛋白胨，氯化钠，大豆分离蛋白，麦芽糊精，酵母提取粉，乙醇，甲醇，20%NaOH，抗氧化剂BHA，1，2-丙二醇，纳他霉素标准品；
1.1.4实验仪器：250mL三角瓶，摇床，生化培养箱，离心机，紫外分光光度计。

1.2方法：
1.2.1孢子的制备：按斜面孢子培养基配方准确配好培养基，121℃灭菌15min,摆斜面冷却后置于37℃培养1～2d，备用，用斜面转接管接种，25℃培养10d，待孢子长满后，放置冰箱5d以上再用。

涂片观察孢子形态，并显微拍照。

1.2.2摇瓶种子制备：按摇瓶种子培养基配方准确配好培养基200mL，平分装在两个三角锥瓶中，121℃灭菌25min。

待培养基冷却后，刮取孢子接种摇瓶，每支斜面接种5瓶摇瓶。

29℃，200r/min振荡培养24h，无菌取样，涂片观察种子菌球形态，并显微拍照。

1.2.3摇瓶发酵：按摇瓶发酵培养基配方准确配培养基600mL, 平分装在6个三角锥瓶中，121℃灭菌25min。

待培养基冷却后，取摇瓶种子1mL接种，29℃，200r/min振荡培养120～168h。

每隔24h无菌取样，取1mL发酵液用于测量其303nm处OD值，另取少量涂片观察形态，并显微照相。

1.2.4OD303的测量方法：从接种后第48h开始，每隔24h从其中一瓶中取0.5mL发酵液，加入4.5mL的丙二醇，在摇床上震荡1h，12000r/min离心10min，取0.5mL上清液，再加4.5mL 蒸馏水，摇匀，用紫外分光光度计在波长303nm处测定光密度。

1.2.5标准曲线的制作：取50mg纳他霉素，溶于100mL丙二醇，得浓度为500ug/mL的纳他霉素原液。

按表1制作曲线，横坐标为纳他霉素工作溶液浓度，纵坐标为OD303的值。

（要求相关系数R2>0.99）产物浓度计算公式为：
纳他霉素含量（mg/L）=X×100×n
式中，X为将所测样品的浓度，100为样品处理时两次稀释倍数之积；
表1 纳他霉素标准曲线工作表
管号 1 2 3 4 5 6
工作溶液浓度/(ug/mL) 010********
纳他霉素原液/mL添加量00.20.40.60.81水/mL 109.89.69.49.29
OD303CK
1.2.5纳他霉素的分离纯化：合并全部发酵液，再12000r/min离心10min。

离心前发酵液的体积与离心后上清液的体积之差即为湿菌泥的体积；加两倍湿菌泥体积的95%乙醇，20%氢氧化钠调pH10～10.5，边加边搅拌0.5h（注意一定要调过pH后再计时），以便纳他霉素充分溶解；然后再再12000r/min离心10min，保留上清液，将上清液用1mol/L盐酸调pH6.5，静置3h（冰箱），以便纳他霉素在等电点处沉淀析出；最后再12000r/min离心10min，保留沉淀（产物），将产物置于55℃真空干燥2h，称重。

2.实验结果与分析
2.1标准曲线制作结果：
标准曲线结果如下表2所示：
表2 纳他霉素标准曲线数据
管号 1 2 3 4 5 6
工作溶液浓度/(ug/mL) 010********
纳他霉素原液/mL添加量00.20.40.60.81
水/Ml 109.89.69.49.29
实际工作溶液浓度/(ug/mL) 0 2 4 6 8 10
OD30300.237 0.256 0.585 0.783 0.752 以上表数据作出标准曲线：
纳他酶素标准曲线
y = 0.0535x R 2
= 0.9964
00.10.20.30.40.50.60.70.80
2
4
6
8
10
12
14
系列1
线性 (系列1)
2.2发酵液检测结果：（如表3所示）
表3 定时测量OD 值数据表 培养时间/h 48 72 96 120 144 测得OD 303 0.237 0.256 0.585 0.783 0.752 纳他霉素浓度（ug/mL ） 4.430
4.785
10.935
14.636
14.056
2.3菌体镜检结果:
(1)斜面菌镜检图片:
图1 斜面菌40倍镜检图 图2 斜面菌100倍镜检图
如图1、图2可看到，此时（接种到种子培养基前）的菌体形态较小，需在100倍镜下才能看到，菌丝多分裂成芽孢，菌丝量少；由图中可以看到有大量芽孢的存在，所以接种斜面以获得菌体芽孢的目的已达到，可以进行种子培养基接种了。

(2)种子培养基中培养24h 后菌体的镜检照片:
图3 种子菌40倍镜检图图4 种子菌100倍镜检图
由图3可看到，此时许多芽孢已长成了菌体，菌体数量增多，菌体形态由图4可以看到此时菌体还比较小，但长成了周围有辐射状生长的短菌丝，中间一小部份实心；
(3)发酵48h镜检结果:
图5 发酵48h 10倍镜检图图6 发酵48h 40倍镜检图
由图5可知，此时在10倍镜下就能看到菌体，说明此时的菌体较之前已大了很多倍，且在数量上也增加了很多；由图6可看到，此时菌体形态多为菌球形，即中间有一略呈圆形的密集部份，周围或某一方向上有长短不一的菌丝伸出；而菌球旁边那些菌丝碎片可能是作装片时打碎的；
(4)发酵72h镜检结果:
图7 发酵72h 40倍镜检图
由图7可看到发酵72h后的菌体数量较发酵48h也增加了很多；菌体较48h时变大了，中部更致密周边菌丝更多更长了；
(5)发酵96h镜检结果:
图8 发酵96h 10倍镜检图图9 发酵96h 40倍镜检图
由图8、图9可以看到，此时菌体较48h时也变大了，但中间原来致密的部分现变得较松散了，菌体在形态上也从略呈圆形变也了不规则状
(6)发酵120h镜检结果:
图10 发酵120h 10倍镜检图图11 发酵120h 40倍镜检图由图10、11、。

可看到，菌体周边有大量的菌丝密密麻麻的中部较边上致密。

(7)发酵144h镜检结果:
图12 发酵144h 40倍镜检图
由图12可看到，此时菌体数减少了，单个菌体变大了，菌体周边有大量的菌丝密密麻麻的中部较边上致密，此时的菌丝多而细；
2.4纳他霉素分离纯化结果：
表4 产物分离纯化结果
发酵液总体积/mL 离心后上清液体积/mL 湿菌泥体积/mL 产物干重/g 410.0 320.0 90 0.24
2.5实验结果分析：
1由纳他霉素标准曲线可知：标准曲线的线性系数为0.9964，线性关系比较强。

制备浓度梯度的纳他霉素的校准液操作比较规范，测定OD值过程比较规范。

2随着发酵时间越长，纳他霉素的生产量逐渐增多。

随着发酵液的消耗，褐黄孢链霉菌菌量不多增多。

而纳他霉素的产生是非生长偶联型，故在发酵72h之前，纳他霉素产量变化较小；72h~144h的产量变化较大。

3由褐黄孢链霉菌发酵过程镜检图可知：种子培养基的镜检菌丝球较少，小菌丝较多。

随着发酵时间增长，发酵液中菌丝球不断增大，菌丝增多，孢子产生。

褐黄孢链霉菌发酵为好氧发酵，在摇瓶发酵过程，菌体会形成菌丝球。

随着菌体生长，菌丝球增大，生长后期，菌体变老，孢子增多。

总结：
在实验中，我学到了纳他霉的发酵生产及分离纯化的方法，对好氧微生物的发酵的基本过程有了较深刻的认识，并且对褐黄孢链霉菌在各个发酵过程中其菌体的大体变化趋势有了一定的了解。

另外，在这次实验过程中我的实验操作能力也得到了加强。

参考文献：
﹝1﹞雷德柱，胡位荣. 生物工程中游技术实验手册. 科学出版社，2010，96-100.
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