突破衍射极限的超高分辨率成像技术发展(修改)

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光学中的超分辨成像技术

光学中的超分辨成像技术超分辨成像技术是目前光学领域的一个热门话题。

光学成像是一种通过光学系统来获取目标物体信息的技术，而超分辨成像技术则是要在前者的基础上，提高成像质量，实现更加细节化的成像结果。

本文将结合理论和实践，对光学中的超分辨成像技术进行深入探讨。

一、超分辨成像技术的理论基础超分辨成像技术的核心在于一种叫做衍射极限的理论。

这个理论认为，在成像中，一个物体在图像中的最小分辨率受到了光波传播的限制，这个极限被称为衍射极限。

达到这个极限，我们才会得到正真意义上的清晰可见的图像。

而在衍射极限外的物体，则会被模糊掉，无法分辨。

为了突破这个限制，科学家们想到了各种办法。

其中主要的两种方法分别是超分辨率显微镜和衍射限制解析成像技术。

二、超分辨率显微镜超分辨率显微镜的发展是在1950年代初期，由Ernst Abbe首先提出的折射率为1.5-1.6的物质是作为透镜的极限。

这一发现将光学成像的空间分辨率极限确定为半波长大小（0.2μm的蛋白质、20-30nm的细胞分子等）。

在此之前的研究中，传统光学显微镜是无法观察到这样小的物体的。

所以人们想到了一些更微小的物体来作为显微镜，例如透射电镜，扫描电子显微镜等。

但是这些显微镜对进行成像的样品要求比较高，而透射电镜还会对样品造成伤害。

因此，人们开始研究超分辨率显微镜。

其中最早的一种是激光荧光显微镜（STED）。

激光荧光显微镜通过对样品进行扫描，然后让样品中的某一部分发光，并快速扫描激光束，从而得到图像。

但是传统荧光信号上的光子数量受到依赖荧光剂分子数目、照射光强度、模糊滤波器和探测器响应等多种因素的影响而受到限制。

为此，科学家通过选择特定波长的激光光束，并在中心光束周围加上一个形状特定的控制激励光束，进一步减小了荧光信号的尺寸。

STED显微镜与传统荧光显微镜相比，具有更高的空间分辨率和更高的信噪比，这意味着它可以获得更清晰的图像，并且可以获得对光学分辨率的一种比较好的突破。

超分辨显微镜的工作原理与成像技术

超分辨显微镜的工作原理与成像技术超分辨显微镜是一种先进的光学显微镜，具有很高的分辨率和成像能力，可以观察到微观领域中细小的结构和现象。

本文将介绍超分辨显微镜的工作原理和成像技术，以及其在生物医学、材料科学和纳米技术等领域的应用。

一、工作原理超分辨显微镜的工作原理基于曲折规律和波的衍射。

传统光学显微镜由于照明光束的衍射限制，无法分辨出比光的波长还要小的物体细节。

而超分辨显微镜通过使用特殊的技术，克服了这一限制。

1.1 衍射极限传统光学显微镜的分辨率受到衍射极限的限制。

衍射极限（称为耐克斯特准则）是由德国物理学家安德烈亚斯·耐克斯特提出的，规定了光学系统能够分辨物体的最小尺寸，即0.61倍的照明光波长。

超过这个极限，显微镜就无法分辨出物体的细节。

1.2 超分辨技术超分辨显微镜采用了多种技术来突破衍射极限，实现更高的分辨率。

其中最常见的技术包括：1.2.1 利用荧光标记超分辨显微镜可以通过利用荧光标记结合合适的成像技术，将被观察物体的特定部分标记出来，并对其进行成像。

这些标记物在光的刺激下会发出荧光信号，通过检测和分析这种信号，可以实现纳米级的分辨率。

1.2.2 利用近场效应近场光学显微镜利用装载在探针尖端的金属纳米结构，利用探针与样品之间的极短距离来增强照明光的局部电场，从而实现超分辨成像。

这种技术在表面等离子激元共振和原子力显微镜中得到广泛应用。

1.2.3 利用建构性干涉通过将两束光进行干涉，可以在显微镜中形成特定的干涉模式。

这种模式包含了被观察物体的高频细节信息。

运用适当的算法和数学处理，可以从干涉模式中提取出高分辨率的图像。

二、成像技术超分辨显微镜采用多种成像技术来获取高分辨率图像。

以下是几种常用的成像技术：2.1 结构光成像结构光成像利用相干光束通过物体表面，通过记录物体与光束的相互作用，实现高分辨率的三维成像。

利用这种技术，可以获得具有亚微米分辨率的物体表面拓扑图像。

2.2 荧光成像荧光成像是利用带有荧光标记的样品在激发光线照射下发出的荧光信号进行成像。

超分辨成像技术的新发展

超分辨显微成像技术的新发展马利红引言人类获得信息的主要器官是眼睛，然而靠人眼观察客观事物的空间分辨率的极限约为4´米，客观世界中人眼不能分辨的所有细微结构称为微观世界。

显微成像技术将310-微观过程或结构成放大图像，以便于人眼能够直接观察。

研究微观世界所涉及的学科领域十分广泛，有生物、医学、材料科学、精密机械、微电子学、分子及原子物理、核物理等等，微观世界中细分的微量尺度原则上是无穷的，因而显微学是跨多学科的，其发展也是无止境的。

1665年，Robert Hooke用原始显微镜发现了池塘水中单细胞有机体，它的出现为人类打开了微观世界的大门。

光学显微镜由此成为历代生物学家的主要研究工具之一。

生物学家把显微镜作为一种主要工具来研究生物器官、组织和细胞，由此奠定了细胞学和组织学的基础，并对生物学、遗传学、微生物学、病理学和医学的发展起到了极大的推动作用。

但传统光学显微镜有以下两个主要缺点：(1)受衍射极限的限制，其分辨率与照明波长是同一个数量级，具有一个数值孔径(NA=nsin(q))的传统光学显微镜，分辨极限l，称之为瑞利判据；(2)由于使用的是场光源，观测到的是一个宽视野图像，为0.61/NA从而降低了信噪比，影响了图像的清晰度和分辨率。

随着生物医学、材料科学等的发展对显微提出了更高的要求，不仅希望其具有更高的分辨率，而且能对样品进行无损成像，甚至希望可观察其三维图像。

因此，传统的显微镜已不能满足要求。

电子显微镜的分辨率虽然远高于光学显微镜，但它需要在真空条件下工作，因此很难观察活的生物样品，另外电子束的照射也会使生物样品受到辐照损伤。

电子显微镜、的局限以及高分辨显微的需求，迫使人们转向超经典衍射极限的光学超分辨理论和技术研究，利用新原理、新技术、新方法来实现光学高分辨力成像和检测。

第一节基于传统的Rayleigh分辨率意义下的超分辨理论光学系统的空间分辨率是一个非常有用的概念，但是关于它的具体定义和描述却有许多不同的见解。

光学衍射极限的突破

光学衍射极限的突破纪岚森，仵云龙，李岷池，贺杰（青岛大学物理科学学院2011级材料物理1班）摘要：由于光学衍射极限的存在，使得在电子科技上边很难达到人们期望的高分辨率，然而光学衍射极限并不是不能克服的。

除了减小光波长与增加孔径外，我们还可以通过改变光路来突破艾里斑衍射极限。

减小艾里斑在很多的方面都有极其重要的意义，这里讲述的是艾里斑对显微镜技术突破的一些介绍。

关键词：艾里斑，显微镜，光学衍射极限1引言：在大量的电子图像应用领域，人们经常期望得到高分辨率（简称HR）图像。

高分辨率意味着图像中的像素密度高，能够提供更多的细节，而这些细节在许多实际应用中不可或缺。

例如，高分辨率医疗图像对于医生做出正确的诊断是非常有帮助的；使用高分辨率卫星图像就很容易从相似物中区别相似的对象；如果能够提供高分辨的图像，计算机视觉中的模式识别的性能就会大大提高。

同时随着生命科学的迅猛发展三维光学显微技术也已经成为研究生命过程的一种极为有效的工具，但是传统的基于荧光共焦技术的成像方案受到光学衍射极限的限制，其横向和纵向的数量级均在百纳米，因而无法满足科学技术发展的需要，利用各种非线性光学荧光激发方案已经打破光学极限的方案已经实现，然而这种光路较为复杂，通过其他的方法构造出来的奇异光线也是能够实现科学家长期最求的三维远场光学的超分辨成像。

根据瑞利衍射极限任意的光学系统成像就会在像方产生一个光斑，而这个光斑是无法通过改变显微镜的结构来实现的，也就是说，无论是共焦显微镜或是宽场显微镜这个光斑都是存在的，而这个光斑就是我们所说的爱里斑(Airy disc) 由于光的波动性，光通过小孔会发生衍射，明暗相间的条纹衍射图样，条纹间距随小孔尺寸的减少而变大。

大约有84%的光能量集中在中央亮斑，其余16%的光能量分布在各级明环上。

衍射图样的中心区域有最大的亮斑，称为爱里斑。

爱里斑的角度与波长(λ)及小孔的直径(d)满足关系：sinθ=1.22λ/d，θ即第一暗环的衍射方向角（即从中央亮斑的中心到第一暗环对透镜光心的张角），因为θ角一般都很小，有sinθ≈θ，故θ≈1.22λ/d。

基于高速相位型空间光调制器的双光子多焦点结构光显微技术

基于高速相位型空间光调制器的双光子多焦点结构光显微技术*喻欢欢张晨爽林丹樱于斌† 屈军乐(深圳大学物理与光电工程学院, 光电子器件与系统教育部/广东省重点实验室, 深圳　518060)(2020 年10 月29日收到; 2020 年11 月24日收到修改稿)多焦点结构光照明显微镜(multifocal structured illumination microscopy, MSIM)能在50 µm的成像深度内实现2倍于衍射极限分辨率的提升, 但在对厚样品成像时, 散射光和离焦光限制了其层析能力和图像衬度.双光子多焦点结构光照明显微镜(two-photon MSIM, 2P-MSIM)克服了样品组织散射的影响, 进一步提高了MSIM的成像深度和成像特性. 然而, 现有的2P-MSIM通常采用振镜扫描成像, 系统复杂, 灵活性差. 为了解决上述问题, 本文提出了一种基于高速相位型空间光调制器(spatial light modulator, SLM)的双光子多焦点结构光照明超分辨显微成像系统, 通过在SLM上同时加载生成多焦点阵列的相位图和线性相位光栅的相位图,实现了多焦点阵列的产生和在样品面上的高精度的并行数字随机寻址扫描和激发成像, 结合像素重定位和反卷积技术实现了三维双光子多焦点结构光超分辨成像, 解决了扫描振镜在2P-MSIM成像中的机械惯性问题,同时降低了系统的复杂性, 提升了灵活性. 在此基础上, 利用搭建的2P-MSIM开展了小鼠肾组织切片和铃兰根茎双光子超分辨成像实验, 验证了该方法的三维超分辨成像能力, 对于2P-MSIM的发展具有重要的意义.关键词：多焦点结构光照明显微技术, 双光子, 荧光显微镜, 空间光调制器PACS：87.64.M–, 87.64.kv, 42.30.–d, 87.85.Pq　DOI: 10.7498/aps.70.202017971 引　言近年来, 多种突破光学衍射极限限制的超分辨显微技术蓬勃发展, 如: 受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED)显微技术[1]、光激活定位显微技术[2]、随机光学重构显微成像技术(stocha-stic optical reconstruction microscopy, STORM)[3]及结构光照明显微成像技术(structured illumina-tion microscopy, SIM)[4]等, 已达到了纳米量级的空间分辨率, 实现了对细胞内精细结构的观察, 极大地推动了生命科学等诸多领域的发展. 尽管STED显微技术能对较厚的生物组织进行高分辨率成像, 但需要特定荧光标记的样品及高能量的损耗光, 后者一定程度地造成了光漂白和光损伤, 限制了该技术的进一步应用. STORM虽能提供更高分辨率成像, 但其不仅仅受到荧光染料种类的限制, 宽场的激发方式和稀疏化的发光模式进一步限制了其成像深度和成像速度. 与此同时, SIM虽然仅仅能提供2倍的分辨率提升, 但由于其具有成像时不受荧光染料的限制, 不需要高的激发光功率, 以及快的成像速度等优势, 在活细胞成像方面获得广泛的应用. 令人遗憾的是, 传统的宽场结构光照明显微成像技术仅仅能实现对比较薄的样品(< 10 µm)超分辨成像, 限制了其发展. 图像扫描显微镜(image scanning microscopy, ISM)[5]被认* 国家自然科学基金 (批准号: 61975131, 61775144, 61835009)、广东省自然科学基金(批准号: 2018A030313362)、广东省高等学校科技创新(重点)项目(批准号: 2016KCXTD007)和深圳市基础研究项目(批准号: JCYJ20170818141701667, JCYJ201708资助的课题.† 通信作者. E-mail: yubin@© 2021 中国物理学会 Chinese Physical Society 为是一种点扫描照明显微成像技术, 这种超分辨技术的出现大大提高了结构光照明显微成像技术的成像深度. 然而, 单个聚焦点的扫描方式限制了ISM的成像速度, 于是多焦点结构光照明显微镜(multifocal structured illumination microscopy, MSIM)[6]被提出, 采用多点并行扫描的方式, 大大提高了单点扫描结构光照明显微镜的成像速度.MSIM 不仅能够实现2倍于宽场显微镜的成像分辨率, 还具有传统共聚焦显微技术的层析能力, 成像深度可以达到50 µm. 但是, 在对厚样品成像时, 样品中的散射和离焦背景光降低了MSIM 的成像特性. 双光子显微镜由于成像深度大并具有较好的层析能力在生物成像领域获得了广泛应用.发展基于双光子技术的MSIM, 即双光子多焦点结构光照明显微镜(two-photon MSIM, 2P-MSIM),进一步提升MSIM的成像性能, 将进一步推进其在活体厚样品超分辨成像中广泛应用. MSIM采用数字微镜器件(digtital micromirror device, DMD)实现点阵的产生和扫描, 但是DMD因其较低的能量利用率而难以实现2P-MSIM. 为了能够获得高效的多焦点双光子激发, 各种不同类型的光学器件被应用在多光子多焦点显微成像技术中, 包括光分束器[7]、微透镜阵列[8−10]、衍射光学元件[11,12]及空间光调制器(spatial light modulator, SLM)[13−15]等. 目前, 在2P-MSIM[10]中, 主要采用微透镜阵列与扫描振镜相结合的方式实现双光子点阵的激发和扫描, 但其双光子激发点阵是固定的, 灵活性差.而基于SLM的多焦点产生技术在点阵的均匀性、效率及随机性方面都具有较大的优势. 利用SLM 生成点阵的算法主要有基于相位恢复(Gerchberg-Saxton, GS)算法[16]、广义自适应加法算法[17]、直接搜寻算法[18]、以及加权相位恢复(weighted GS, WGS)算法[19,20]等. 在这些算法中, WGS算法生成的点阵具有更好的均匀性和效率. 直到目前, 几乎所有的多焦点多光子结构光照明显微成像系统都需要振镜来实现扫描成像, 系统具有较大的复杂性且受机械惯性的影响, 灵活性差. 为了解决上述问题, 本文提出并搭建了一种基于高速相位型SLM的2P-MSIM, 仅通过在SLM上加载生成点阵和线性相位光栅的合成相位图, 就同时实现了点阵产生和在样品面上高精度并行数字随机寻址扫描激发, 结合像素重定位和反卷积技术实现了三维双光子多焦点结构光超分辨成像. 利用搭建的系统完成了对小鼠肾切片、铃兰根茎及荧光珠的双光子超分辨成像, 具有较好的成像效果, 验证了该方法的三维超分辨成像能力.2 2P-MSIM原理与方法2.1 2P-MSIM成像理论2P-MSIM被认为是一种并行的2P-ISM, 其实现超分辨的原理与2P-ISM一致. 在ISM[5]中,一个面阵探测器替换了激光共聚焦扫描显微镜中的点探测器. 探测器探测到的图像不仅仅与激发点的位置有关, 同时也与探测器上的像素点的位置有关, 因此, 在不考虑系统放大倍率的情况下, 在样品面扫描位置r处, 探测器s位置处的双光子荧光光强分布可以表示为[5,21]c(r′)E(r′)U(r+s)E0(r)U(r+s)E0(r)=E2(r)σinσdet其中, 表示荧光分子分布, 表示在扫描位置为r的系统激发点扩散函数, 表示探测位置为r + s的系统探测点扩散函数. 那么, 在双光子激发下, 系统有效的点扩散函数可表示为, 其中, 表示在扫描位置为r的双光子激发点扩散函数. 假设双光子激发点扩散函数和系统探测点扩散函数采用高斯分布模型, 且标准差分别为和, 那么双光子激发下, 系统有效的点扩散函数可重新表示为[22]U eff其中, G表示高斯函数, 表示有效的点扩散函数.σ2P-in=σex/√2σexλexλdet1<k<2k=λex/λdetσex=kσdetσ2P-in=kσdet/√2在2P-ISM中, 双光子激发点扩散函数为系统激发点扩散函数的平方, 则双光子激发点扩散函数的标准差为, 其中为单光子激发下, 系统激发点扩散函数的标准差. 在双光子激发过程中, 分子吸收两个光子经过斯托克斯位移后自发辐射出单个光子, 则双光子激发波长与探测波长的比值, 其中. 所以系统激发点扩散函数和系统探测点扩散的标准差之间的关系变为, 因此, 双光子激发点扩散函数的标准差与系统探测点扩散函数标准差之间关系为.假设不考虑双光子激发时荧光染料的吸收截面, 再结合(2)式, 则2P-ISM的有效点扩散函数U 2P-eff 可以描述为I r −k 2k 2+2s ,s 因此, 有效的双光子图像可以通过对s 的积分来重构:再结合(1)式, 2P-MSIM 有效图像可重新表示为如果从频率域来考虑, 那么两边同时进行傅里叶变换将得到:(k 2+2)/k 2(k 2+2)/k 2从(6)式可以看出, 有效图像包含的频谱范围是宽场照明得到 , 所以, 通过像素重定位(pixel reassignment)和反卷积(deconvolution)处理, 理论上2P-MSIM 相比于宽场显微镜能实现倍分辨率的提升.2.2 系统光路设计2P-MSIM 是基于尼康显微镜实现的(Nikon ECLIPSE Ti-U). 一台波长为1036 nm 、功率为1 W 、脉宽为145 fs 的激光从光纤激光器发出(安扬, FemotoYL-6), 首先通过一个可用来调节激光出射功率的半波片(Thorlabs, AHWP05M-980)和偏振分光棱镜对; 从偏振分光棱镜出射的P 偏振光再次经过半波片(Thorlabs, AQWP10M-980),用来调整飞秒光在通过SLM 之前的偏振方向. 然后, 光束被一对包含焦距为25 mm (Thorlabs,AC127-025-B-ML)以及焦距为80 mm (Thorlabs,AC254-080-B-ML)的透镜对扩束; 经扩束后的光束通过一个可调光阑照射在一个高速相位型SLM (Meadowlark Optics, 像元数为1920 × 1152, 像素尺寸为9.2 µm × 9.2 µm)上; 通过在SLM 上加载生成点阵和线性相位光栅的合成相位图, 能够实现多个聚焦点阵列在其傅里叶面上的扫描移动;经SLM 调制的激发光经过一个焦距为300 mm 的透镜(Thorlabs, AC508-300-B)后照射在显微镜的管镜上; 为了满足SLM 采光面大小与物镜后孔径面大小尽可能匹配, 将原来的管镜替换成焦距为300 mm, 尺寸为2英寸的透镜(Thorlabs, A508-300-AB-ML), 与前一个透镜构成一个无扩束的4f 系统;为了只让SLM 的一级光通过系统, 在4f 系统两个透镜间放置一个可调光阑用来滤除SLM 的其他衍射级的光; 光束经过管镜后又经过水浸物镜(Nikon, 60 ×, NA 为1.27)在样品面上形成多个聚焦点; 样品被激发后产生的荧光信号经二向色镜与发射片后由sCMOS 相机(滨松,ORCA-Flash4.0 v3)接收. 整个光路的示意图如图1所示.SLMSampleLaser λ/2 plate λ/2 plate PBS f = 25 mmf = 300 mmf = 300 mmf = 80 mmMirrorMirror IrisDichroic mirrorObjectivesCMOS Tube lens f = 200 mm图 1 2P-MSIM 系统光路示意图Fig. 1. Schematic diagram of 2P-MSIM system.2.3 点阵产生和扫描相位图设计2.3.1 点阵相位图设计原理整个相位图的设计分成3步: 1)点阵相位图的设计; 2)用于点阵扫描的线性相位光栅的设计;3)将两个相位图进行叠加生成最终的复合相位图.√I (x )Φi (x )点阵相位图的生成方法采用的是一种改进的WGS 算法[20], 即当WGS 算法迭代几次后, 一直保持频谱面的相位不变, 用作下一次的迭代, 直至算法收敛. 利用这种方式大大减少了迭代次数, 加快了收敛速度. 在传统的WGS 算法中, 初值相位可以设置成分布范围为–π—π的随机矩阵, 当算法执行第i 次迭代时, 傅里叶平面的振幅和相位可以根据输入平面的振幅和相位经过二维Ψi (u )B i (u )Γ(u )g i (u )g i (u )傅里叶变换得到. 保持傅里叶面的相位不变,振幅用目标振幅乘以一个不均匀性矫正的加权系数来替换. 可以表达为⟨B i (u )⟩M δ(u )g 0(u )其中, 表示计算得到的M 个点的振幅平均值, 表示的是狄拉克函数, 设置为1.A i +1(x )Φi +1(x )√I (x )A i +1(x )g i (u )δΨi (u )δg i (u )g i (u )δΨi (u )Ψi (u )=ΨN (u )然后, 用替换后的振幅和计算得到的相位进行二维逆傅里叶变换就得到输入平面的振幅和相位 , 通过这种方式不断迭代下去, 最后就能得到均匀性好的点阵的输入相位. 但是当用传统的WGS 算法生成点阵时, 我们发现在迭代过程中用替换使在矫正均匀性时很难有较大的改善, 往往需要较长的时间才能实现较好的矫正效果. 主要原因是对于输入平面的傅里叶变换, 振幅的替换引入了一个相位改变量, 这个改变量要比加权系数改变量大得多, 所以导致了在矫正不均匀性方面很难有比较好的效果. 值得注意的是, 通过对后续的i +1次迭代的相位改变施加影响, 能有效地移除相位改变量 . 具体做法是在WGS 算法执行N 次迭代达到目标调制效率后, 保持后续迭代中傅里叶平面的相位不变, 即. 利用这种方法, 算法可以在很少的迭代次数就完成了收敛, 且最终生成了一个均匀性好、效率高的多焦点阵列. 算法的执行过程可以通过图2(a)来表示,图2(b)和图2(c)分别表示利用该算法得到的相位图和点阵图.2.3.2 线性相位光栅的设计线性相位光栅的相位表达式可以表示为其中, k 表示光栅的频率, r 表示SLM 面的坐标.exp (i 2πkr )δ(u −k )δ(ufλ−k )k =ρfλδ(u −ρfλ)B i (u )Ψi (u )B i(u −ρfλ)Ψi(u −ρfλ)相应地, 复振幅表达式可以写成 ,从频率空间来考虑, 其傅里叶变换为 . 考虑到光学的傅里叶变换和数学上傅里叶变换的坐标变换关系, 相位光栅对应的傅里叶面的复振幅分布为 , 其中f 表示透镜的焦距, l 表示激光器的波长. 再令 , 则该复振幅表达式变为 . 假设生成的点阵对应的复振幅为且激光器的波长带宽很窄, 考虑到空域内的复振幅的乘积对应频域内的复振幅的卷积, 则相应的叠加相位图对应傅里叶面的复振幅分布为. 从这个表达式上看, 点阵的位置被移动了r .δf /k max δf =fλ/D k max jδf δf k max 由于SLM 本身是由一个个的像素单元构成的, 在SLM 面上的相位光栅的相位值被离散化,所以实际的线性相位光栅不可能实现点阵的连续移动. 根据文献[23], 相位光栅能实现的扫描精度为 , 这里, D 表示物镜的通光孔径; 表示相位光栅产生位移在 — 的最大可实现个数, 可以表示为其中, N 为产生的相位光栅在SLM 上所占的像素个数, g 为是SLM 的灰度级. 综合以上的分析, 利用线性相位光栅可实现亚纳米级的扫描步长.根据以上的相位图的设计理论, 利用MATLAB 软件分别生成点阵的相位图和线性相位光栅的相位图, 最后通过相位叠加的方式生成最后的相位图.FTIFT[Focal plane](a)(b)(c)( ), ( )( ), ( ) ( ) ( ), ( )[SLM plane]( )( ) ( )= ( )if > , ( )= ( )图 2 (a) WGS 算法流程图; (b)得到的相位图; (c)生成的点阵图Fig. 2. (a) Flow chart of WGS algorithm; (b) generated phase map; (c) generated multi-focus array.2.4 2 P-MSIM 数据获取与分析为了实现同步扫描同步记录的目的, 用LABV-IEW 软件分别控制纳米位移台(Pi, E-709)、相机和空间光调制器. 实验中, 纳米位移台每上升一步,就用SLM 和相机完成一层的成像. SLM 每加载一张图片, 相机同时曝光记录一次, 直至成像完成整个二维平面. 根据每一层的图像信息能够完成对荧光样品的三维重构.与单光子的MSIM 的数据处理方法[6]相类似,2P-MSIM 超分辨图像也可以通过像素重定位技术, 即: 多焦激发(multifocal-exciting)、数字高斯针孔(pinholing)滤波、图像缩放(scaling)、求和(summing) 4个图像处理步骤来重建超分辨图像(multifocal-exciting pinholing scaling summing,MPSS), 再经过Richardson-Lucy (RL)反卷积来进一步提升图像的分辨率, 获得2倍分辨率提升的2P-MSIM 图像. 考虑到激发点大小的改变和波长的差异, 实际的处理过程需要对实验室已有程序[24]略微加以改进, 即可获得近似2倍分辨率提升的双光子超分辨图像.3 结果与讨论3.1 荧光珠成像为了测试系统的空间分辨率, 首先对尺寸100 nm, 中心发射波长为580 nm 的荧光珠进行成像, 由于所选荧光珠尺寸小于该成像系统的理论分辨率, 所以实验分析时未考虑荧光珠直径对测量的半高全宽的影响. 对得到的2P-MSIM 原始数据进行了重构, 分别获得了点阵激发图通过添加高斯数字针孔再叠加(pinholed+summed)的初步降噪的宽场图像(pinholed widefield, Pinholed WF)、像素重定位的MPSS 图像及MSIM 图像, 结果如图3所示. 图3(a)—(c)分别表示荧光珠在经过这3个过程后得到的图像, 大的虚线框内的荧光珠为小的虚线框内的荧光珠的放大, 可以明显观察到在PinholedWF 图像中原本分不开的荧光珠图像在MPSS 和MSIM 图像中能明显地分开. 图3(d)为图3(a)—(c)中黄色实线所在像素的值的大小与对应的像素所占的宽度作的曲线拟合, 每条曲线都经过了归一化处理. 为了能标定系统的分辨率,1.00.80.6N o r m a l i z e d i n t e n s i t yWidth/m m0.40.2000.20.40.60.8 1.0 1.2PinholedWF MPSS MSIM1.00.80.6N o r m a l i z e d i n t e n s i t yWidth/m m 0.40.200.20.40.60.8 1.0PinholedWF MPSS MSIMPinholedWF (a) 2 m m (b) 2 m m(c)2 m m(d)(e)图 3 100 nm 荧光珠成像　(a) PinholedWF 图像; (b) MPSS 图像; (c) MSIM 图像; (d)图(a)—(c)中黄色实线所在像素值的大小与对应像素所占宽度的拟合曲线; (e)单个荧光珠的高斯拟合曲线Fig. 3. 100 nm fluorescent bead imaging: (a) PinholedWF image; (b) MPSS image; (c) MSIM image; (d) fitting curves of the size of the pixel value of the yellow solid lines in panel (a)－(c) vs. the width of corresponding pixel; (e) Gaussian fitting curves of a single fluorescent bead.也对视场范围内10颗荧光珠的图像进行高斯曲线拟合, 并进行统计平均, 得到了系统的平均分辨率,如图3(e)所示. 经过对单个荧光珠的Pinholed-WF, MPSS和MSIM图像拟合, 得到荧光珠的半高全宽值分别是(360 ± 15) nm, (207 ± 15) nm 和(148 ± 13) nm, 与系统的宽场分辨率相比基本实现了近似2倍的分辨率提升.3.2 小鼠肾切片三维成像2P-MSIM相比于1P-MSIM在成像深度方面有明显的提升, 具有良好的三维层析成像能力. 为了测试2P-MSIM的三维成像能力, 对商用的小鼠肾切片进行成像. 为了尽可能提高成像速度, 同时保证超分辨成像质量, 避免图像出现伪影及点阵信号之间的串扰. 设置点阵间隔为3250 nm, 点阵数量为8 × 8, 横向的扫描步长为130 nm, 整幅图像的成像时间是6.25 s, 成像区域大小为26.1 µm ×26.1 µm. 通过控制纳米位移台, 实现了同一个小鼠肾切片的不同厚度的成像, 分别是0, 5, 10 µm,如图4所示. 可以明显地观察到小鼠肾切片在不同深度结构的改变, 同时MSIM处理后的图像的分辨率具有显著的提高.为了能更直观地观察生物样品的三维结构, 进一步扫描了小鼠肾切片的一个三维成像区域, 横向的扫描参数设置保持不变, 轴向的扫描步长设置为200 nm, 扫描层数为30层, 这样总的成像深度为6 µm. 对每层进行超分辨处理后的数据通过Imaris软件进行三维堆栈. 如图5所示, 重构出的三维超分辨小鼠肾切片图像实现了近似2倍的分辨率提升.4 m m4 m m4 m m4 m m4 m m4 m m4 m m4 m m4 m m图 4 小鼠肾切片的不同厚度层成像图Fig. 4. Images of different thickness layers of mouse kidney section.3.3 铃兰根茎成像为了进一步测试2P-MISM的成像能力和分辨率, 对铃兰根茎进行了成像. 和前文描述的方法一样, 对铃兰根茎的不同深度的区域完成了成像,成像深度分别是0, 12, 24 µm, 如图6所示. 可以看出原本无法观测到的铃兰根茎内部结构变化在超分辨处理后能较清晰地观测到, 进一步验证了所搭建2P-MSIM的成像能力.4 结　论本文提出和搭建了一套新的双光子多焦点结构光超分辨显微成像系统. 利用了一个高速相位型空间光调制器同时完成了多焦点阵列的生成及点阵在样品面上的高精度扫描移动, 实现了双光子多焦点成像的目的, 解决了扫描振镜在多焦点成像中的机械惯性问题, 同时降低了系统的复杂性, 提高8 m m8 m m图 5 小鼠肾切片三维成像图　(a) PinholedWF图像; (b) MSIM图像Fig. 5. Three-dimensional image of mouse kidney section: (a) PinholedWF image; (b) MSIM image.4 m m4 m m4 m m4 m m4 m m4 m m4 m m4 m m4 m m图 6 铃兰根茎不同厚度层成像图Fig. 6. Images of different thickness layers of lily of the valley rhizome.了灵活性. 另外, 为了进一步提高双光子多焦点成像的分辨率, 把点扫描结构光成像和双光子成像结合在一起, 实现了双光子多焦点结构光照明的超分辨成像, 将双光子多焦点的成像分辨率提高了近2倍. 最后, 利用该系统完成了小鼠肾切片和铃兰根茎的三维超分辨成像, 证实了该系统具有优异的成像特性, 为进一步开展活体细胞及组织的超分辨成像打下了基础.参考文献H ell S W, Wichmann J 1994 Opt. Lett. 19 780[1]B etzig E, Patterson G H, Sougrat R, Lindwasser O W,Olenych S, Bonifacino J S, Davidson M W, Lippincott-Schwartz J, Hess H F 2006 Science 313 1642[2]R ust M J, Bates M, Zhuang X W 2006 Nat. Methods 3 793[3]G ustafsson M G L 2000 J. Microsc. 198 82[4]M uller C B, Enderlein J 2010 Phys. Rev. Lett. 104[5]Y ork A G, Parekh S H, Nogare D D, Fischer R S, Temprine K, Mione M, Chitnis A B, Combs C A, Shroff H 2012 Nat.Methods 9 749[6]N ielsen T, Frick M, Hellweg D, Andresen P 2001 J. Microsc-Oxford 201 368[7]B ewersdorf J, Pick R, Hell S W 1998 Opt. Lett. 23 655[8]Q u J L, Liu L X, Chen D N, Lin Z Y, Xu G X, Guo B P, Niu [9]H B 2006 Opt. Lett. 31 368I ngaramo M, York A G, Wawrzusin P, Milberg O, Hong A,Weigert R, Shroff H, Patterson G H 2014 Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 111 5254[10]S acconi L, Froner E, Antolini R, Taghizadeh M R, Choudhury A, Pavone F S 2003 Opt. Lett. 28 1918[11]J ureller J E, Kim H Y, Scherer N F 2006 Opt. Express 14 3406[12]S hao Y, Qin W, Liu H, Qu J, Peng X, Niu H, Gao B Z 2012 Appl. Phys. B 107 653[13]M atsumoto N, Okazaki S, Fukushi Y, Takamoto H, Inoue T, Terakawa S 2014 Opt. Express 22 633[14]M atsumoto N, Konno A, Ohbayashi Y, Inoue T, Matsumoto A, Uchimura K, Kadomatsu K, Okazaki S 2017 Opt. Express25 7055[15]S inclair G, Leach J, Jordan P, Gibson G, Yao E, Laczik Z J, Padgett M J, Courtial J 2004 Opt. Express 12 1665[16]C urtis J E, Koss B A, GrierD G 2002 Opt. Commun. 207 169[17]M eister M, Winfield R J 2002 Opt. Commun. 203 39[18]D i Leonardo R, Ianni F, Ruocco G 2007 Opt. Express 15 1913[19]K im D, Keesling A, Omran A, Levine H, Bernien H, Greiner M, Lukin M D, Englund D R 2019 Opt. Lett. 44 3178[20]S heppard C J R, Gu M 1990 Opitk 86 104[21]R oider C, Heintzmann R, Piestun R, Jesacher A 2016 Opt.Express 24 15456[22]S chmitz C H J, Spatz J P, Curtis J E 2005 Opt. Express 13 8678[23]L i S W, Wu J J, Li H, Lin D Y, Yu B, Qu J L 2018 Opt.Express 26 23585[24]Two-photon multifocal structured light microscopy based on high-speed phase-type spatial light modulator*Yu Huan -Huan Zhang Chen -Shuang Lin Dan -Ying Yu Bin † Qu Jun -Le(Key Laboratory of Optoelectronic Devices and Systems of Ministry of Education and Guangdong Province, College of Physics andOptoelectronic Engineering, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China)( Received 29 October 2020; revised manuscript received 24 November 2020 )AbstractMultifocal structured illumination microscopy (MSIM) can achieve a doubled improvement in the resolution of the diffraction limit within an imaging depth of 50 µm. But when imaging thick samples, scattered light and defocused light limit its optical sectioning capability and image contrast. Two-photon MSIM (2P-MSIM) overcomes the influence of sample tissue scattering and further improves the imaging depth and imaging characteristics. However, the existing 2P-MSIM usually adopts galvanometer based scanning mirrors for precisely scanning imaging, which is a complicated and poor flexibility system. Here we propose a simpler 2P-MSIM. Two-photon multifocal scanning imaging can be realized by a spatial light modulator (SLM) with a high frame rate (< 845 Hz). The phase map of generating multi-focus array and linear phase grating loaded on the SLM simultaneously, high-precision parallel digital random address scanning and excitation imaging on the sample surface can be realized. The mechanical inertia problem of the galvanometer scanner in multifocal imaging can be solved by the proposed method while reducing the complexity of the system and improving flexibility. We finally realize two-photon multifocal imaging of mouse kidney tissue slices and lily of the valley rhizome by this system, which verifies the three-dimensional super-resolution imaging capability of this method. It is of great significance in developing the 2P-MSIM.Keywords: multifocal structured illumination microscopy, two-photon, fluorescence microscope, spatial light modulatorPACS: 87.64.M–, 87.64.kv, 42.30.–d, 87.85.Pq DOI: 10.7498/aps.70.20201797* Project supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 61975131, 61775144, 61835009), the Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (Grant No. 2018A030313362), the Scientific and Technological Innovation (Key) Projects of Department of Education of Guangdong Province, China (Grant No. 2016KCXTD007), and the Shenzhen Basic Research Project, China (Grant Nos. JCYJ20170818141701667, JCYJ20170818144012025, JCYJ20170412 105003520, JCYJ20180305125649693).† Corresponding author. E-mail: yubin@。

超高分辨率荧光显微镜

(1) 生物学研究方面的应用
研究重点在于分子间如何相互作用、组装形成复合物。
1.通过观察蛋白质之间的组合关系来了解它们的作用，并能为后续的细胞功能试验打下基础 2.SR成像有助于人们更好地了解分子间的差异 3.SR成像技术还能用于在单分子水平研究蛋白动态组装过程
图3-1 蛋白质组装示意图
22
应用前景
15
基于点扩散函数调制的超分辨技术
环状光的孔径理论上可以通过增加激光强度无限缩小获得一个小于衍射极限的荧光激发点
更改了阿贝的衍射极限公式:
d
2nsin 11/ l
可见，随着 I 的增加，STED 技术的分辨率可以无穷小
16
基于点扩散函数调制的超分辨技术贡献
2000 年，用一束激光激发荧光分子发光，再用另一束环状激光消除激发光周边的荧光，通过二维点扫描实现了超高分辨率成像，将光学显微镜分辨率提高了近 10 倍实现了 1994 年提出的想法
在生物领域的应用一直没有发展
后期努力均在远场条件下发展
10
超高分辨率显微成像
几种超高分辨显微成像技术原理示意及成像结果
超高分辨率显微成像——一般指在远场条件下基
于荧光的、“突破”衍射极限的光学显微成像技
术
荧光——物质吸收光照后发出的一类光
成为
低背景：利用了荧光发射光波长比吸收光波长较生物
长这一重要原理，通过光路设计，分开激发光和学研
荧发射光，大幅降低了成像的背景
究中
光高灵敏度：结合灵敏的检测器件，在优化条件下，最常
显微镜
荧光显微镜还可以检测单个荧光分子发出的极其微弱的荧光，成为单分子成像的最佳选择，其发展也奠定了这次诺贝尔化学奖的半壁江山

衍射极限艾里斑分辨率-概述说明以及解释

衍射极限艾里斑分辨率-概述说明以及解释1.引言1.1 概述在概述部分，我们将介绍衍射极限艾里斑分辨率这一主题的背景和重要性。

衍射极限艾里斑分辨率是一种用于评估和描述光学系统分辨能力的指标。

光学系统的分辨能力是指其能够将空间中两个点状物体分辨为两个离散的点的能力。

衍射极限艾里斑分辨率的概念源于19世纪的衍射理论和光的波动性质。

根据衍射理论，当光束通过一个孔径较小的光学系统时，光的波动会导致光斑的扩散和干涉现象，从而限制了系统的分辨能力。

艾里斑分辨率是一种经典的衡量光学系统分辨能力的方法。

它是由物理学家Ernst Abbe于1873年提出的，并以他的名字命名。

艾里斑分辨率的计算基于光学系统的参数，包括光的波长和系统的数值孔径。

衍射极限艾里斑分辨率在科学研究和实际应用中具有重要意义。

在生物医学领域，它可以用于评估显微镜的分辨能力，进而实现对细胞和组织结构的高分辨率成像。

在光刻技术中，艾里斑分辨率的理论极限可以指导光刻机的设计和性能改进。

然而，衍射极限艾里斑分辨率也存在一定的局限性。

实际光学系统往往受到各种因素的限制，如光的衍射、散射、畸变等，这些因素会降低系统的实际分辨能力。

因此，进一步研究和改进光学系统，以提高其分辨能力成为未来发展的方向。

在接下来的文章中，我们将详细介绍衍射极限的定义和原理，以及艾里斑分辨率的概念和计算方法。

我们还将讨论衍射极限艾里斑分辨率在不同领域的应用，并探讨其存在的局限性和未来的发展方向。

通过对这一主题的全面了解，我们可以更好地理解光学系统的分辨能力，并为相关领域的进一步研究和应用提供指导。

1.2文章结构文章结构部分的内容可以是对整篇文章的组织和布局进行介绍。

可以提及文章的各个章节主题、内容概要以及各个章节之间的逻辑关系等。

以下是关于文章结构部分的一个示例：第2节正文部分是本文的核心内容，将详细介绍衍射极限和艾里斑分辨率的定义、原理和计算方法。

通过对衍射极限的研究和艾里斑分辨率的计算，我们可以更好地理解光学成像中的分辨率限制和相关原理。

STORM和STED显微成像技术特点的比较

STORM和STED显微成像技术特点的比较宗艾伦;周迎生【摘要】随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)技术和受激发射损耗(stimulated emission depletion,STED)显微镜技术是近年来发展迅速的两种超分辨率荧光显微镜技术.这两种技术均提供超越传统荧光显微镜分辨率成像的功能,具有多色显像,三维成像以及活细胞内成像的潜力.在这篇综述中,我们关注两种技术荧光控制、激光强度等技术参数设定,同时结合样品制备、图像采集与处理等流程优化对比两者在分辨率、图像采集时间及具体应用中的优劣.STORM可获得更高的三维分辨率,但可能需要更长的图像采集时间.STED需要较高损耗光强度,却能在图像采集后立即生成超分辨率图像,不需要额外图像数据处理.最终,选择STORM和STED不仅取决于技术的具体应用,还取决于操作者优化各环节技术参数的能力,从而决定图像质量.【期刊名称】《中国实验动物学报》【年(卷),期】2019(027)001【总页数】4页(P115-118)【关键词】超分辨率荧光显微镜技术;随机光学重建显微镜;受激发射损耗显微镜【作者】宗艾伦;周迎生【作者单位】首都医科大学附属北京安贞医院内分泌代谢科,北京市心肺血管疾病研究所,北京 100029;首都医科大学附属北京安贞医院内分泌代谢科,北京市心肺血管疾病研究所,北京 100029【正文语种】中文【中图分类】Q95-33光学显微镜和电子显微镜，是研究亚细胞结构最常用的两大类显微镜技术。

光学显微镜可根据光源不同分为普通光、荧光、红外光显微镜等。

荧光光学显微镜以免疫荧光染色为技术基础，以荧光抗体为成像探针只选择与荧光抗体特异结合的结构进行成像。

光学显微镜分辨率定义为显微镜下可分辨两独立同亮度理想点光源间的最小距离。

因存在衍射，成像为光斑而非理想光点。

当两光点过于靠近，其像斑重叠时，无法将两点区分开，即光学系统中存在一分辨率极限。

光学超分辨成像技术在肿瘤细胞研究中的应用

光学超分辨成像技术在肿瘤细胞研究中的应用光学超分辨成像技术是一种能够突破衍射极限，提供更高分辨率成像的技术，已经被广泛应用于生物医学研究中。

在肿瘤细胞研究中，光学超分辨成像技术提供了对肿瘤细胞行为的更详细、更全面的观察，从而促进了对肿瘤发生机制、生长和转移的理解。

以下是光学超分辨成像技术在肿瘤细胞研究中的应用的一些例子。

首先，光学超分辨成像技术可以用于观察肿瘤细胞形态特征的变化。

相较于传统的显微镜观察，光学超分辨成像技术能够提供更高分辨率的图像，捕捉到更微小的结构细节。

例如，通过在细胞膜表面标记荧光蛋白，可以使用光学超分辨成像技术观察细胞膜的动态变化，如细胞膜褶皱、纳米级结构等。

这些信息有助于了解肿瘤细胞的生物学特征和细胞-细胞相互作用。

其次，光学超分辨成像技术可以用于研究肿瘤细胞内部的亚细胞结构和分子分布。

通过标记特定的亚细胞器或蛋白质，可以在超分辨率下观察到细胞器的分布、形态和动态变化。

例如，通过标记线粒体、内质网或高尔基体等亚细胞器，可以研究它们在肿瘤细胞中的数量、形态和位置的变化。

此外，通过标记肿瘤相关的蛋白质，还可以观察到这些蛋白质在肿瘤细胞中的表达和分布情况，进一步了解它们在肿瘤发生和发展中的作用。

第三，光学超分辨成像技术可以用于研究肿瘤细胞移动和转移的机制。

通过标记细胞膜或细胞骨架等结构，可以实时观察细胞的运动轨迹和变形过程。

这对于研究肿瘤细胞的运动行为、肿瘤细胞转移的机制以及细胞-细胞或细胞-基质相互作用具有重要意义。

光学超分辨成像技术的高时空分辨率使得可以实时跟踪肿瘤细胞的运动状态，揭示肿瘤转移过程中的关键事件。

此外，光学超分辨成像技术还可以与其他技术相结合，实现更全面、综合的肿瘤细胞研究。

例如，可以与荧光定量PCR、质谱分析等技术结合，同时观察肿瘤细胞的形态、分子表达和代谢信息，从而全面了解肿瘤细胞的特征和功能。

总之，光学超分辨成像技术在肿瘤细胞研究中具有广泛的应用价值。

通过提供更高分辨率的成像，这种技术能够揭示肿瘤细胞的形态、结构和分子表达的细节信息，有助于深入理解肿瘤发生和发展的机制，为肿瘤预防、诊断和治疗提供新的思路和方法。

突破衍射极限的方法

突破衍射极限的方法1.近场成像基本思路是利用高空间频率信号来获得清晰的物象。

由于需要非常接近样本，因而对于实际应用造成了很大的障碍。

1) superlensZhang X, Liu Z. Superlenses to overcome the diffraction limit.[J]. Nature Materials, 2008, 7(6):435-441.使用负折射率超材料（完美透镜）增强原子力显微镜/显微镜的分辨率。

将负折射率材料靠近目标物体，近场消逝波将被增强。

完美透镜的分辨率不取决于衍射极限，而是取决于放大率和多少消失模被存储2) hyperlensLu D, Liu Z. Hyperlenses and metalenses for far-field super-resolution imaging[J]. Nature Communications, 2012, 3(6):1205.3) microsphere assist imagingWang Z, Guo W, Li L, et al. Optical virtual imaging at 50 nm lateral resolution with a white-light nanoscope[J]. Nature Communications, 2011, 2(1):385-396.4) nearfield scanning optical microscopy2.远场成像可以做到远场高分辨，达到几十纳米的分辨率，通过选择性激活或者灭活荧光团但是这些成像技术仅适用于生物组织样本1)STEDStimulated emission depletion microscopy受激发射减损显微镜https:///wiki/STED_microscopy2) PALMphoto-activated localization microscopy光激活定位显微镜https:///wiki/Photoactivated_localization_microscopy3) STORM随机光学重构显微技术Stochastic optical reconstruction microscopyhttps:///wiki/Super-resolution_microscopy#Stochastic_optical_reconstruct ion_microscopy_.28STORM.293.SOLsuper-oscillatory lens超震荡透镜Berry M V. Exact nonparaxial transmission of subwavelength detail using superoscillations[J]. Journal of Physics A Mathematical & Theoretical, 2013,46(20):2140-2154.。

超分辨率光学显微成像技术

超分辨率光学显微成像技术超分辨率光学显微成像技术是一种通过光学方法实现超出传统光学显微镜分辨率极限的成像技术。

传统光学显微镜由于受到衍射极限的限制，其分辨率受到了严重的限制，无法观察到微观尺度下的细节。

而超分辨率光学显微成像技术的出现，为科学研究和生物医学领域带来了革命性的突破，使得研究人员能够观察到更加细微的结构和过程，为科学研究提供了强大的工具和支持。

超分辨率光学显微成像技术主要包括结构光显微镜、单分子荧光显微镜、受限光学激发显微镜等多种技术手段。

这些技术手段通过不同的原理和方法，实现了超出传统光学显微镜分辨率极限的成像效果，为科学研究提供了更加清晰和详细的图像信息。

结构光显微镜是一种基于结构光原理的成像技术，通过在样本表面投射特殊的结构光，利用样本对结构光的干涉或衍射效应，实现对样本的高分辨率成像。

这种技术在生物医学领域得到了广泛的应用，可以观察到细胞和组织的微观结构，为研究细胞生物学和病理学提供了重要的帮助。

单分子荧光显微镜是一种能够实现单个荧光标记物的高分辨率成像技术，通过对样本中的单个荧光标记物进行定位和成像，可以实现纳米尺度下的成像分辨率。

这种技术在生物分子和细胞内部结构的研究中具有重要意义，可以观察到生物分子的动态行为和相互作用过程，为生命科学研究提供了重要的实验手段。

受限光学激发显微镜是一种基于受限光学激发效应的成像技术，通过在样本表面引入受限光学激发效应，可以实现对样本的超分辨率成像。

这种技术在材料科学和纳米技术领域具有重要的应用，可以观察到纳米尺度下的材料结构和性质，为材料设计和制备提供了重要的参考和指导。

总的来说，超分辨率光学显微成像技术的出现，为科学研究和生物医学领域带来了革命性的突破，为研究人员提供了强大的工具和支持。

随着技术的不断发展和完善，相信超分辨率光学显微成像技术将在更多领域展现出其巨大的潜力和应用前景。

突破衍射极限的超高分辨率成像技术发展 (修改)

结课论文题目突破衍射极限得超高分辨率成像得技术进展学生姓名学号学院专业班级二〇一五年十二月一引言1.1选题意义光学显微成像具有极为悠久得历史,但一直以来，光学成像一直受到衍射极限得限制而分辨率无法突破２0０nm.后来虽然有了电子显微镜、核磁共振显像、x光衍射仪等微观观测或者显像设备,但就是使用光学显微镜可以在活体状态下观察生命体使得其在生物、医学观察方面仍有巨大优势。

值得庆贺得就是近年来，超高分辨率显微技术得发展使得光学显微成像分辨率达到了2０nm以下。

其中德国科学家Stｅfａn Helｌ、美国科学家ErｉｃＢetzig与Wiｌｌiam Mo ｅｒｎer因其在超高分辨率显微技术方面得突出贡献获得了2014年得诺贝尔化学奖。

在这篇文章中，我们就简要介绍一下超高分辨率显微技术得发展与应用,并对诸位大师致以敬意.1.2 技术指标显微技术成像优劣一般通过X-Y 平面分辨率与Ｚ轴分辨率大小来判定,分辨率越高数值越小.下表就是各种显微成像技术得分辨率指标。

二衍射极限2、1 衍射极限我们能瞧到什么?瞧到多小得范围?瞧得有多清楚？几百年来,依靠不断进步得科学手段，微观世界正一层层揭开面纱，让人们可以瞧得越来越“小”,进而可以进行研究。

人得肉眼能分辨0、１毫米尺度得物体，再小，就要借助工具。

1665年，英国科学家罗伯特·虎克制造了第一台用于科学研究得光学显微镜,用它观察薄薄得软木塞切片。

虎克瞧到了残存得植物细胞壁，它们一个个像小房间一样紧挨在一起,这就就是“细胞”一词得由来。

此后，显微镜制造与显微观察技术得迅速发展,帮助科学家第一次发现了细菌与微生物。

那么,光学显微镜就是否可以无止境地“放大"下去，让我们想瞧到多小就能瞧到多小？科学家为成像技术Ｘ-Ｙ平面分辨率(ｎm) Z 轴分辨率(n ｍ) 普通光学显微镜 2０0－30０ 5０0—７0０4Pi 显微镜 1００-15０STED 显微技术 50—70 ST ＥD ＋４技术 50 50 ＰAL Ｍ技术 20 3０ 3D ST ＯＲM 技术 20—3０ 50—6０ｄSTORM 技术 30 50 2D SSI Ｍ技术５0 3Ｄ SSI Ｍ技术 100 2０0 电子显微镜０、０5 X 光衍射仪 0、0３—10此做了很多尝试，最终发现,存在一道法逾越得“墙"—衍射极限.ﻫ 1873年，德国科学家阿贝提出了衍射极限理论：光就是一种电磁波,由于存在衍射，一个被观测得点经过光学系统成像后，不可能得到理想得点，而就是一个衍射像，每个物点就像一个弥散得斑,如果这两个点靠得很近,弥散斑就叠加在一起，我们瞧到得就就是一团模糊得图像。

国外空间对地观测系统最新发展

国外空间对地观测系统最新发展原民辉;刘韬【期刊名称】《国际太空》【年(卷),期】2017(000)001【总页数】8页(P22-29)【作者】原民辉;刘韬【作者单位】北京空间科技信息研究所;北京空间科技信息研究所【正文语种】中文近年来，空间对地观测系统快速发展，系统性能不断提升，遥感应用向深度化、综合化方向发展，产业发展初具规模。

在通信、导航和对地观测三类应用卫星中，对地观测卫星是发射数量最多的卫星，近年发射数量快速跃升，特别是近3年的年发射数量维持在近百颗规模，近3年与前3年的发射数量环比增长近240%，增幅大幅超过其他类型应用卫星。

数量跃升主要源于小型对地观测星座发展成熟并大量应用，特别是低于100kg的微纳卫星。

根据欧洲咨询公司（Euroconsult）报告，2016－2025年，全球预计还将发射419颗对地观测卫星，对地观测卫星规模将保持快速发展势头。

截至2016年底，国外在轨对地观测卫星319颗。

从国别角度看，美国对地观测卫星数量最多，约占48%；从类型角度看，光学成像卫星数量最多，约占53%。

目前，全球超过50个国家拥有对地观测卫星，近20个国家拥有高分辨率对地观测卫星（本文对高分辨率的限定为光学1m、雷达3m）。

国外共计81颗高分辨率卫星在轨运行，其中美国、欧洲数量最多。

全球空间对地观测卫星企业数量呈井喷式增长态势。

在卫星制造和卫星运营服务领域已经发展出数十家全球性企业。

一方面，美国数字地球公司（DigitalGlobe）、欧洲空客防务与航天公司（ADS）、加拿大麦德公司（MDA）和意大利对地观测公司（e-GEOS）等传统大型企业，不断兼并、整合中小型企业，商业对地观测市场份额已占全球份额的87.2%。

另一方面，在数据增值服务、地理信息融合服务等领域发展出的全球性或地区性企业，如雨后春笋般不断涌现。

同时，美国特拉贝拉公司（Terra Bella）、行星公司（Planet）、黑天全球公司（BSG）和加拿大地球直播公司（UrtheCast）等大量初创公司，也开始争相进入对地观测卫星市场，通过创新产品和创新服务，既争夺、也扩大了全球商业对地观测市场。

超高分辨率显微成像技术在生物学中的应用前景

超高分辨率显微成像技术在生物学中的应用前景近年来，随着科技的快速发展，超高分辨率显微成像技术逐渐成为生物学研究中的重要工具。

该技术的出现，突破了传统显微镜的分辨率限制，能够在细胞和分子水平上揭示生物系统的细节。

超高分辨率显微成像技术在生物学中的应用前景广阔，将为我们深入了解生命的奥秘提供强有力的工具。

首先，超高分辨率显微成像技术的应用将加速对细胞结构和功能的理解。

传统显微镜受到衍射极限的制约，分辨率有限。

而超高分辨率显微成像技术利用了新兴的光学原理，能够将细胞内元件的结构和位置展示得更加清晰详细。

通过对细胞内不同蛋白质、细胞器以及细胞基因的研究，我们可以更深入地了解细胞的功能和调控机制，从而有助于研究细胞命运和细胞病理生理学。

其次，超高分辨率显微成像技术在生物医药研究中的应用前景广阔。

生物医药研究致力于探索疾病的发生机制以及开发新的治疗方法和药物。

超高分辨率显微成像技术不仅可以提供细胞水平的病理变化，还可以揭示微观病理结构与功能之间的联系，对于疾病的早期诊断和治疗具有重要意义。

例如，在癌症研究中，超高分辨率显微成像能够准确观察和定位肿瘤细胞的分布和形态变化，从而为肿瘤治疗提供更具针对性的方法。

此外，超高分辨率显微成像技术在神经科学领域的应用也十分重要。

神经科学研究常常需要探索大脑的细胞结构和连接方式，揭示神经系统功能的机制。

而传统显微镜的分辨率限制往往无法满足这些要求。

超高分辨率显微成像技术的应用使得我们可以更清晰地观察神经元之间的相互关系，揭示突触形成和功能变化等重要信息。

这对于研究神经系统疾病如阿尔茨海默病和帕金森病等，以及神经系统发展和学习记忆等基础研究具有重要意义。

除此之外，超高分辨率显微成像技术在细菌学、免疫学等领域也有较大的应用前景。

例如，在细菌学研究中，超高分辨率显微成像技术能够提供细菌细胞的形态、结构和功能信息，帮助了解细菌的生长、分裂和传播等关键过程。

在免疫学研究中，超高分辨率显微成像技术可以揭示免疫细胞相互作用和分子识别过程，有助于研究免疫系统的免疫应答机制、疾病发生等重要问题。

国外光学成像侦察卫星发展研究.

国外光学成像侦察卫星发展研究.夏亚茜【摘要】21世纪是信息化战争时代，光学成像侦察卫星作为最重要的天基信息获取系统，一直以来是各主要航天国家的重点发展对象。

提高空间分辨率、时间分辨率和光谱分辨率是光学成像侦察卫星长期追求的目标；通过扩大幅宽、升高轨道、灵活姿态机动提高驻留时间；发展光学和雷达综合系统；不断提高快速响应能力已成为当前研究的热点。

【期刊名称】《国际太空》【年(卷),期】2012(000)009【总页数】5页(P39-43)【作者】夏亚茜【作者单位】【正文语种】中文21世纪是信息化战争时代，光学成像侦察卫星作为最重要的天基信息获取系统，一直以来是各主要航天国家的重点发展对象。

1 发展现状光学成像侦察卫星已经成为现代战争信息获取系统的重要装备。

在空间分辨率方面，美国光学成像卫星的军用全色分辨率为0.1m、商用分辨率为0.4m；红外分辨率为1m；俄罗斯、法国、以色列卫星的军用全色分辨率优于0.5m。

在光谱分辨率方面，美国战术卫星－3（TacSat－3）的光谱分辨率为5nm。

当前，美国有4颗锁眼－12（KH－12）光学成像侦察卫星在轨运行，卫星发射质量18t，光学口径约3m，焦距27m，寿命8年，采用大型光学系统、自适应光学、大面阵探测器、机动变轨、长寿命、高可靠等技术，全色分辨率达0.1～0.15m，红外分辨率0.6～1m。

另外，美国还有1颗“8X”成像侦察卫星在轨运行，轨道高度2000km，它带有光学和雷达两种有效载荷，具有宽覆盖、快速重访能力。

欧洲光学成像侦察卫星主要使用法国太阳神－2（Helios－2）卫星。

该卫星带有1台全色（具有红外能力）高分辨率相机（HRZ）和1台宽视场相机（HRG）。

高分辨率相机主要采用推扫成像，高分辨率通道分辨率为0.5m，超高分辨率通道分辨率为0.25～0.35m，红外通道可拍摄红外图像，使该卫星具备了夜间光学侦察能力；宽视场相机标称分辨率5m，幅宽60km，主要进行普查与测绘制图。

光学显微镜技术的新发展

光学显微镜技术的新发展在科技的快速发展和不断创新下，光学显微镜技术也在逐渐得到发展。

随着人类对物质世界认知的不断推进，对于光学显微镜在生物学、物理学、化学以及材料学等领域的应用需求日益增长。

本文将介绍光学显微镜技术的新发展。

1. 超分辨显微镜技术随着科技的不断进步，越来越多的科学家迫切需要进一步提高显微镜技术的空间分辨率。

传统的光学显微镜受到衍射极限的限制，无法高清的显示微观物质结构。

长期以来一直被科学家们所关注的问题是如何突破这种限制，实现超分辨率成像。

在这方面，超分辨显微镜技术的出现，给解决这个问题提供了新思路。

超分辨显微镜技术的实现主要是依托于控制和利用荧光标记物的性质。

其中常用的方法包括像STED（Stimulated Emission Depletion）显微镜、SIM（Structured Illumination Microscopy）显微镜、PALM（ Photo-Activated Localization Microscopy）等。

这些技术都利用了成像探针的荧光特性和物质的非线性光学等性质，能够实现超出衍射极限范围的成像分辨率。

例如，近年来越来越受到关注的直接受激发荧光推动的显微镜技术（Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, dSTORM），在弥补传统荧光显微镜分辨率短板的同时，还具有显著的标记荧光标记物无毒与高灵敏度的优点。

2. 多光子显微技术除了超分辨显微镜技术外，多光子显微镜技术也成为了目前发展的热点。

这种技术利用激光的非线性效应，对样品进行成像。

在传统的激光荧光显微镜中，样本的激活是通过吸收单一光子而发生的，而多光子显微镜则是通过同时吸收两个光子的能量而激活样品。

多光子显微镜技术的发展使得样品可以通过更高的分辨率进行成像，而且可以实现样品的三维成像。

相较于其他显微镜技术，多光子显微技术有其独特的优点。

它可以在更深的深度范围内进行成像，这使得许多生物实验可以直接在活体中进行。

光学成像技术的研究和发展方向

光学成像技术的研究和发展方向随着科技的不断发展，光学成像技术也在不断地得到改进和完善。

我们生活中常见的数码相机、手机摄像头，甚至是医学影像设备、天文望远镜等等，都是应用了光学成像技术。

那么，光学成像技术的研究和发展方向又是什么呢？本文将从以下几个方面谈谈光学成像技术的发展方向。

一、高分辨率成像在光学成像技术中，高分辨率成像是关键问题之一。

想要获得高清晰度的图像，必须使成像系统的分辨率尽可能高。

高分辨率成像的发展方向主要有以下两种：1、超分辨率成像：在光学成像技术中，分辨率受到光学衍射极限的限制，即不可能获得低于光学衍射极限的分辨率。

但通过信号处理和算法可以超越这一限制，从而实现超分辨率成像。

超分辨率成像的实现对医学、生物科学、安防等领域都有重要的意义。

2、全息成像：全息成像技术是把物体的各个角度的信息都记录下来，然后用显示器显示出来，观察者就像是看到了实物一样，可以看到物体的三维信息。

全息成像在科学研究、机器人视觉等领域有很大的应用潜力。

二、远距离成像在地球上，我们能够看到的距离是有限的，高山、海洋和大草原等景物都有一定的可视距离。

如果能够通过成像技术实现远距离成像，那么将会为科研、军事等领域带来很大的帮助。

远距离成像的发展方向主要有以下两种：1、超远距离成像：超远距离成像是指在超长距离范围内对物体进行成像，例如宇宙远距离拍摄、跨洲际传输影像等。

2、遮挡物透视成像：遮挡物透视成像是指通过遮挡物透视成像技术，能够实现对地面障碍物、墙壁、山体等遮挡物的透视成像。

这一技术在军事和消防领域有重要的应用。

三、新材料应用随着光学材料的研究和发展，人们发现新材料可以在光学成像技术中发挥重要作用。

新材料应用的发展方向主要包括以下几个方面：1、纳米材料应用：纳米材料具有极小的尺寸和尺度效应，可以通过改变所用材料的物理、化学性质，来实现成像过程中光学性能的优化。

2、光学生物材料应用：因为生物体的特殊结构，有很多特殊的光学性能，例如医学显微镜中使用的水浸式镜片，以及一些生物体内部的透明材料等，都具有光学几何相位、消色散、非线性等独具特色的光学性能，在成像技术、医疗、药物研发等领域中具有潜在的应用价值。

光学成像在生命科学中的应用,从2014年诺贝尔奖纳米显微镜技术谈起

400年前，显微镜发明
第一次打开了人类认识微观世界的大门开启了人类生命与生活的重要内容
Robert Hooke
1665
软木的木栓组织上的微小气孔
• 1665 年，Robert Hooke(胡克)：「细胞」名词便是由虎克利用显微镜观察软木的木栓组织上的微小气孔而得来的。 • 1674 年， Leeuwenhoek( 列文虎克 ) ：发现了原生动物，并随后首次发现「细菌」。
三、突破衍射极限成像
阿贝衍射极限
德国科学家阿贝，1873
能看多小？
阿贝衍射极限
显微镜可分辨的最小线度为： L =0.61λ/N.A. N.A.为镜头的数值孔径。可见光：380～780nm 普通显微镜的分辨率一般为 200nm以上。
斯特凡⋅赫尔的受激发射损耗 (STED)
STED 扫描成像过程
• 1930年，Lebedeff(莱比戴卫)：搭建第一架干涉显微镜，同时Zernike(卓尼克) 在1932年发明出相位差显微镜，适用于观察活细胞和未染色标本。
• 1952 年， Nomarski( 诺马斯基 ) ：发明微分干涉相位差光学系统。适用于观察活细胞的种种细节。
• 1988 年， Confocal 扫描显微镜被广为使用。既可以用于观察细胞形态，也可以用于进行细胞内生化成分的定量分析、和实现长时间活细胞动态观察。 • 1990年，发展了非线性光学多光子显微成像技术。适用于生物细胞、活组织的长时间动态三维成像。
射频波段核磁共振谱学及成像 —— 波谱学技术的代表之一
Isidor Isaac Rabi
Felix Bloch
Edward Mills Purcell
气态原子磁共振 1944年诺贝尔物理学奖