重组蛋白制备
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一个PCR循环(PCR cycle)包括变性—退火—延伸三个步骤； 理论上可使靶序列数量增加一倍。 30个循环后，可获得106个靶分子
PCR循环
PCR反应五要素
DNA聚合酶：影响PCR反应的产量 引物：影响PCR反应特异性的关键因素 dNTP：影响PCR反应扩增效率的关键因素 模板：决定PCR反应成败的关键环节之一 Mg2+：影响PCR反应扩增的特异性和产量
由T7RNA聚合酶结合在T7启动子上，转录合成 目标蛋白的mRNA分子。诱导物为isopropyl-βD-thiogalactoside（IPTG，异丙基-b-D-硫代半 乳糖苷 ），无诱导物时，T7启动子控制的外源 基因的转录受lacI蛋白抑制。
降解RNA模板，使反转录反应失去模板而失败。 与PCR区别：
1）PCR反应为链式反应，产物以指数方式扩增；反转录 为线性扩增，且只能合成一条与RNA互补的DNA链。
2）PCR为热循环反应，DNA聚合酶具有热稳定性；反转 录为常温反应，反转录酶不具有热稳定性，高温使反转 录酶失去酶活性。
二、限制性酶切反应
区、抗性筛选标记、多克隆位点。
pUC18质粒图谱
pUC18多克隆位点
四、DNA连接反应
反应原理：DNA连接酶催化DNA分子3’羟基（3’-OH）与5’ 磷酸基团（5’-P）间形成磷酸二酯键
反应组分：DNA连接酶及相应辅基，DNA分子。
DNA连接种类： 1）ATP作辅基的DNA连接酶，例如T4DNA连接酶，pfu
质粒，若能产生对应大小的DNA片段，重组质粒含有目的 基因；反之不含目的基因，为空质粒。
3）DNA序列测定鉴定 将重组质粒进行DNA序列测定，在碱基序列水平验证插
入片段的存在。
蛋白诱导Байду номын сангаас达
蛋 白 诱 导 表 达
一、重组蛋白表达系统
原核表达系统： 表达载体中的重组蛋白表达元件是原核生物特有
的，表达宿主也是各种原核生物，例如大肠杆菌。 真核表达系统：
DNA转化方法 1）化学转化：用某些二价金属离子，例如50mM CaCl2，处理宿主
细胞，使宿主细胞处于高效吸纳外源DNA的生理状态，称之为感受态。 之后将外源DNA转化进入宿主菌细胞。
2）电转化：高电压瞬时处理（电击）宿主菌，可使宿主菌处于极 高效吸纳外源DNA的生理状态。电转化效率是化学转化效率的10－ 100倍。 主要应用
重组蛋白表达元件是真核生物特异性的，表达宿 主为各种真核生物，例如啤酒酵母、昆虫、哺乳动 物细胞。 无细胞翻译系统：
不需要宿主细胞，只需要把目的蛋白的mRNA加入 无细胞翻译系统，37度保温一段时间即可合成出毫 克级的目标蛋白质。优势主要是目标蛋白纯化简便 。
原核表达系统
根据原核表达载体中用于表达重组蛋白的必需元 件的差异，主要是启动子、识别并结合启动子的 RNA聚合酶、诱导物的差异，常用的原核表达系 统有: T7-lacI表达系统
如何获得重组蛋白？
重组蛋白制备
重组表达载体构建 目标蛋白重组表达 最高效的蛋白分离纯化方法——亲合纯化
重组表达载体构建
基因克隆
基因克隆(Gene Cloning): 亦称分子克隆技术。将某特定基因或DNA 片段插入到载体分子中,并筛选获得纯化 (克隆)重组子的技术。
基因克隆程序
1）目的基因片段获得 2）目的载体的获得 3）目的基因与载体DNA的限制性酶切 4）酶切目的基因与载体DNA片段的连接重组 5）连接重组质粒转化大肠杆菌 6）含目的基因插入片段的重组子鉴定
DNA 连接酶 2）NAD＋作辅基的DNA连接酶，例如大肠杆菌DNA连接酶
应用： 1）DNA重组构建重组质粒 2）DNA连接反应检测单核苷酸多态性
连接反应获取重组环状DNA分子
五、DNA转化反应
DNA转化原理 在某些特殊生理条件下，宿主细胞可以高效吸收外源DNA，从而将外 源DNA转入特定宿主菌。
将可自我复制的外源DNA，如各种质粒，转入宿主菌，并在宿主菌 内繁殖这些质粒，实现相应质粒的大规模制备。
六、重组质粒鉴定方法
1）PCR鉴定 利用目的基因特异性的引物，重组质粒作为模板，利用 PCR进行鉴定。若能扩增出DNA产物，则重组质粒含有目 的基因；反之不含目的基因，为空质粒。
2）限制性酶切鉴定 利用插入目的基因时所用的限制性内切核酸酶消化重组
基因克隆所需通用材料
需要克隆的目的DNA片段。 克隆载体，用于接入目的DNA片段。 限制性内切核酸酶，消化目的DNA片段与克隆载
体，产生连接反应所需要的DNA粘性末端。 DNA连接酶，将目的DNA片段与克隆载体连接在
一起，构建重组载体。 大肠杆菌感受态细胞，用于筛选含有插入目的
DNA片段的阳性克隆。
RT-PCR
以RNA作为模板，反转录酶合成互补DNA （cDNA）
以cDNA作为模板，PCR指数扩增目的基因 片断。与普通PCR相同。
反转录反应
反应原理：反转录酶以RNA为模板指导互补DNA链合成。 反应组分：polyT引物，dNTPs，mRNA模板 反应特点：特异性以mRNA作为模板。 注意事项：防止核酸酶A（RNase A）污染 ，RNase A会
基因克隆流程图
一、目的基因片段获取
1）聚合酶链式反应——PCR 2）反转录-聚合酶链式反应——RT-PCR
PCR
PCR： Polymerase Chain Reaction 多聚酶链式反应
美国Kary B.Mullis1985年建立 (1993诺贝尔化学奖获得者)
PCR反应的三个基本步骤
模板双链DNA的变性：～94℃ 引物与单链模板的退火：～55℃ 引物的延伸：～70℃
质粒的相关概念 可以在宿主细胞内进行复制的环形DNA分子。 不同质粒在宿主细胞内的分子数(拷贝数)不同。 在体外不能复制、传代；但DNA可长期保存生命活
力。微生物基因组DNA不再具有生命活力。 根据宿主细胞差异，质粒分为多种类型。 根据用途差异，质粒分为:克隆载体和表达载体。 人工构造的质粒具有的必需功能元件：复制起始
反应原理 限制性内切核酸酶识别双链DNA的特异性序列，
并在此特异性序列处或附近切断双链DNA。 反应特点
切割位点具有碱基序列特异性，只在特定碱 基序列处切断双链DNA。 注意事项
a 不同限制性内切核酸酶反应缓冲液有很大差别， b 一部分限制性内切核酸酶活性受DNA识别序列甲基化修 饰影响
三、克隆载体－质粒
PCR循环
PCR反应五要素
DNA聚合酶：影响PCR反应的产量 引物：影响PCR反应特异性的关键因素 dNTP：影响PCR反应扩增效率的关键因素 模板：决定PCR反应成败的关键环节之一 Mg2+：影响PCR反应扩增的特异性和产量
由T7RNA聚合酶结合在T7启动子上，转录合成 目标蛋白的mRNA分子。诱导物为isopropyl-βD-thiogalactoside（IPTG，异丙基-b-D-硫代半 乳糖苷 ），无诱导物时，T7启动子控制的外源 基因的转录受lacI蛋白抑制。
降解RNA模板，使反转录反应失去模板而失败。 与PCR区别：
1）PCR反应为链式反应，产物以指数方式扩增；反转录 为线性扩增，且只能合成一条与RNA互补的DNA链。
2）PCR为热循环反应，DNA聚合酶具有热稳定性；反转 录为常温反应，反转录酶不具有热稳定性，高温使反转 录酶失去酶活性。
二、限制性酶切反应
区、抗性筛选标记、多克隆位点。
pUC18质粒图谱
pUC18多克隆位点
四、DNA连接反应
反应原理：DNA连接酶催化DNA分子3’羟基（3’-OH）与5’ 磷酸基团（5’-P）间形成磷酸二酯键
反应组分：DNA连接酶及相应辅基，DNA分子。
DNA连接种类： 1）ATP作辅基的DNA连接酶，例如T4DNA连接酶，pfu
质粒，若能产生对应大小的DNA片段，重组质粒含有目的 基因；反之不含目的基因，为空质粒。
3）DNA序列测定鉴定 将重组质粒进行DNA序列测定，在碱基序列水平验证插
入片段的存在。
蛋白诱导Байду номын сангаас达
蛋 白 诱 导 表 达
一、重组蛋白表达系统
原核表达系统： 表达载体中的重组蛋白表达元件是原核生物特有
的，表达宿主也是各种原核生物，例如大肠杆菌。 真核表达系统：
DNA转化方法 1）化学转化：用某些二价金属离子，例如50mM CaCl2，处理宿主
细胞，使宿主细胞处于高效吸纳外源DNA的生理状态，称之为感受态。 之后将外源DNA转化进入宿主菌细胞。
2）电转化：高电压瞬时处理（电击）宿主菌，可使宿主菌处于极 高效吸纳外源DNA的生理状态。电转化效率是化学转化效率的10－ 100倍。 主要应用
重组蛋白表达元件是真核生物特异性的，表达宿 主为各种真核生物，例如啤酒酵母、昆虫、哺乳动 物细胞。 无细胞翻译系统：
不需要宿主细胞，只需要把目的蛋白的mRNA加入 无细胞翻译系统，37度保温一段时间即可合成出毫 克级的目标蛋白质。优势主要是目标蛋白纯化简便 。
原核表达系统
根据原核表达载体中用于表达重组蛋白的必需元 件的差异，主要是启动子、识别并结合启动子的 RNA聚合酶、诱导物的差异，常用的原核表达系 统有: T7-lacI表达系统
如何获得重组蛋白？
重组蛋白制备
重组表达载体构建 目标蛋白重组表达 最高效的蛋白分离纯化方法——亲合纯化
重组表达载体构建
基因克隆
基因克隆(Gene Cloning): 亦称分子克隆技术。将某特定基因或DNA 片段插入到载体分子中,并筛选获得纯化 (克隆)重组子的技术。
基因克隆程序
1）目的基因片段获得 2）目的载体的获得 3）目的基因与载体DNA的限制性酶切 4）酶切目的基因与载体DNA片段的连接重组 5）连接重组质粒转化大肠杆菌 6）含目的基因插入片段的重组子鉴定
DNA 连接酶 2）NAD＋作辅基的DNA连接酶，例如大肠杆菌DNA连接酶
应用： 1）DNA重组构建重组质粒 2）DNA连接反应检测单核苷酸多态性
连接反应获取重组环状DNA分子
五、DNA转化反应
DNA转化原理 在某些特殊生理条件下，宿主细胞可以高效吸收外源DNA，从而将外 源DNA转入特定宿主菌。
将可自我复制的外源DNA，如各种质粒，转入宿主菌，并在宿主菌 内繁殖这些质粒，实现相应质粒的大规模制备。
六、重组质粒鉴定方法
1）PCR鉴定 利用目的基因特异性的引物，重组质粒作为模板，利用 PCR进行鉴定。若能扩增出DNA产物，则重组质粒含有目 的基因；反之不含目的基因，为空质粒。
2）限制性酶切鉴定 利用插入目的基因时所用的限制性内切核酸酶消化重组
基因克隆所需通用材料
需要克隆的目的DNA片段。 克隆载体，用于接入目的DNA片段。 限制性内切核酸酶，消化目的DNA片段与克隆载
体，产生连接反应所需要的DNA粘性末端。 DNA连接酶，将目的DNA片段与克隆载体连接在
一起，构建重组载体。 大肠杆菌感受态细胞，用于筛选含有插入目的
DNA片段的阳性克隆。
RT-PCR
以RNA作为模板，反转录酶合成互补DNA （cDNA）
以cDNA作为模板，PCR指数扩增目的基因 片断。与普通PCR相同。
反转录反应
反应原理：反转录酶以RNA为模板指导互补DNA链合成。 反应组分：polyT引物，dNTPs，mRNA模板 反应特点：特异性以mRNA作为模板。 注意事项：防止核酸酶A（RNase A）污染 ，RNase A会
基因克隆流程图
一、目的基因片段获取
1）聚合酶链式反应——PCR 2）反转录-聚合酶链式反应——RT-PCR
PCR
PCR： Polymerase Chain Reaction 多聚酶链式反应
美国Kary B.Mullis1985年建立 (1993诺贝尔化学奖获得者)
PCR反应的三个基本步骤
模板双链DNA的变性：～94℃ 引物与单链模板的退火：～55℃ 引物的延伸：～70℃
质粒的相关概念 可以在宿主细胞内进行复制的环形DNA分子。 不同质粒在宿主细胞内的分子数(拷贝数)不同。 在体外不能复制、传代；但DNA可长期保存生命活
力。微生物基因组DNA不再具有生命活力。 根据宿主细胞差异，质粒分为多种类型。 根据用途差异，质粒分为:克隆载体和表达载体。 人工构造的质粒具有的必需功能元件：复制起始
反应原理 限制性内切核酸酶识别双链DNA的特异性序列，
并在此特异性序列处或附近切断双链DNA。 反应特点
切割位点具有碱基序列特异性，只在特定碱 基序列处切断双链DNA。 注意事项
a 不同限制性内切核酸酶反应缓冲液有很大差别， b 一部分限制性内切核酸酶活性受DNA识别序列甲基化修 饰影响
三、克隆载体－质粒