结核分枝杆菌传统药敏试验方法 共36页
结核分枝杆菌药敏试验结果的判读
12
表型药敏试验
V.S.
V.S.
13
固体罗氏培养基法与液体培养基法DST的比较
不同方法
药物种类
价格 （ＲＭＢ）
从培养到获得DST 结果 2-3个月
罗氏培养基
多种（除PZA外） 15元/药
液体培养基
多种（包括PZA） >100元/药
2-4周
14
微孔板法药敏试验
板式药敏试验的技术特点：
1. 包含的药物种类较多，包括是包括了一些新型的抗结核药 物，如莫西沙星，克拉霉素，阿莫西林/克拉维酸钾、氯 法齐明。 2. 获得耐药浓度，发现中度敏感/低度耐药菌株。 3. 缩短报告结果时间。一般2周，特殊情况下3周报告结果。 4. 提高了标准化程度。药敏培养板的制备实现了标准化，结 果的读取依赖专业设备，有利于质量控制。
8
可能敏感株和可能耐药株的MIC分布情况 （1）
Clinically susceptible strains (PS)
Frequency of strains
Clinically resistant strains (PR)
Break Point MIC
Minimal inhibitory concentrations (MIC)
绝对浓度法
10-3 mg
IHN：1，10μg /ml SM：10，100μg /ml RFP：50，250μg /ml EMB：5，50μg /ml KM: 30μg /ml OFLX: 3μg /ml
报告结果时间
4-6周
4周
6
绝对浓度法和比例法药敏试验出现结果差异
用两种药敏试验方法测定了360株结核分枝杆菌对H、R、S、E的药敏性, 两种方法的符合率： H R S E 81.1% 92.5% 83.6% 98.6%
分枝杆菌分离培养和药敏试验
分枝杆菌分离培养和药敏试验引言分枝杆菌（Branchiobdella）是一类无脊椎动物寄生虫，常见于淡水环境中。
它们具有扁平的身体和分枝状的触手，因此得名。
分枝杆菌对环境条件非常敏感，因此分离培养和药敏试验对其研究具有重要意义。
分枝杆菌分离培养的方法1.样品采集：在淡水环境中选择活跃的分枝杆菌寄生体作为样品。
2.样品处理：将样品置于理化条件适宜的培养基中，如R2A培养基等。
以适宜的温度和光照条件下培养。
3.分离纯培养：利用无菌技术将分枝杆菌从其他微生物分离出来。
常用方法包括稀释涂布法、均匀涂布法等。
4.单菌种培养：将分离得到的单个分枝杆菌菌落接种到新的培养基上进行单菌种培养。
5.培养基优化：根据菌株特性，优化培养基组成、温度、光照和其他环境条件。
通过观察菌落形态、生长速度等指标，选择适宜的培养条件。
分枝杆菌药敏试验的方法1.制备药敏试验板：选择适宜的培养基，如Mueller-Hinton琼脂、肉汤琼脂等。
将药物分别加入琼脂中，并制备成不同浓度的试验板。
2.培养分枝杆菌：将分枝杆菌菌液均匀涂布在药敏试验板上，培养在适宜的温度下。
3.药敏试验观察：观察菌落的生长情况和抑菌效果。
记录最小抑菌浓度（MIC）。
4.药敏结果解读：根据国际标准或相关研究的参考值，判断分枝杆菌对药物的敏感性和抗药性。
可以根据MIC值进行药物分类，如敏感、中度敏感和耐药。
5.药敏结果分析：根据实验结果，分析分枝杆菌的药物抗性特征，为临床治疗提供参考。
结论分枝杆菌分离培养和药敏试验是研究该虫寄生虫的重要手段。
合理的分离培养方法可以得到纯种菌落，为后续研究和药敏试验提供可靠的基础。
药敏试验能够判断分枝杆菌对药物的敏感性，为临床治疗提供重要参考。
参考文献： 1. Johnston, D.J. (2000). A new family of Branchiobdellidan (Annelida: Clitellata) ectosymbiontic on freshwater crayfishes: The Evansobdellidae. Proceedings of the Biological Society of Washington, 113(3): 842-850. 2. Erséus, C. (2001). Chapter 25 PhylumAnnelida: Clitellata, Branchiobdellida. In: Animal biodiversity: an outline of higher-level classification and survey of taxonomic richness (ed. by Z.Q. Zhang). pp. 281-282. 3. Erséus, C. (2005). Order Branchiobdellida. In: Annelida: Polychaeta, Myzostomida, Branchiura and Vestimentifera (ed. by J. B. Hutchings, S. P. Nimis, and C. Reish). pp. 97-100.。
结核杆菌药敏试验流程
结核杆菌药敏试验流程下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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结核培养与药敏试验
结核分枝杆菌固体培养操作流程
1
痰标本中加入 1-2倍体积 4%NaOH
2
涡旋振荡 1分钟
3
室温静置 15分钟
第3天、7天、此后每周 观察一次直至第九周, 记录菌落生长和污染
6
分别接种0.1ml
置37C温
前处理液至2
箱培养 只酸性罗氏培养基斜面
5
4
结核分枝杆菌固体培养操作流程 操作
痰标本
1－2倍 4% NaOH
No. of sputa tested n=41
n=41 n=36
培 100 养 80 阳 性 60 比 40 例
20
0
90
81
100
100
100
90
81 90
73
100
90
100
94
81
63
77
29
4C
10
25C
25
15
25-30C
0
0
3
7
14
21
28
标本保存时间（0,3,7,14,21,28天） Kim SJ, et al, 1986
特点：全自动、全封闭、快速、样本量 大 原理：分枝杆菌对NaOH的耐受性；分 枝杆菌在液体培养基生长更快，添加了 丰富的营养物质；分枝杆菌生长耗氧， 荧光增强，仪器自动探测荧光的变化。 试剂组成：MGIT培养管、MGIT生长 添加剂、PANTA杂菌抑制剂、SIRE药 敏试剂。 标本适用范围：除血液标本以外的所有 标本
结核分枝杆菌药敏试验-比例法
• 抗结核药物效价的计算：
效价 =纯度×活性成分×（1－水份含量） 实例：KM纯度99%，水分3.3%，活性成分69.6%
分枝杆菌分离培养、药敏试验及菌种鉴定方法标准化(PPT-80)
分离出具有活力的纯培养物，为进一步试验提 供基础。
分离培养的缺点
需时长，根据接种量的大小，一般2~8周 才能得到肉眼可见菌落。
结果受标本保存运送时间，培养基成分 和质量，前处理方法等影响，操作较直 接涂片法复杂，需经严格培训。
1/4．
分离培养的注意事项
选择痰标本中脓性、血样、干酪样的部分进行 培养阳性率较高。
从加入前处理液到接种的时间不得多于20分钟. 涡旋振荡、离心、倾倒上清液、接种时容易产
生气溶胶，应注意使用安全仪器，正确操作。 发现培养基上菌落生长需经抗酸染色确认后方
可报告阳性。
分离培养的优点
敏感性较直接涂片法高，理论上10~100条菌/ 毫升可检出阳性；
特点：简便、快速，可进行药敏试验及初步菌 种鉴定。连续测定荧光强度，每60分钟自动测 一次，无放射性污染。
分枝杆菌种类
分枝杆菌属，除结核分枝杆菌复合群（结核分 枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分 枝杆菌）及麻风分枝杆菌外，余者统称为非结 核分枝杆菌（Nontuberculosis Mycobacteria,NTM）
结核分枝杆菌是引起人类结核病的主要病原菌， 此外，牛分枝杆菌除引起牛结核病外，少数人 类结核病也由其引起。非洲分枝杆菌致病力较 弱，是热带非洲人结核病病原体。田鼠分枝杆 菌对人类无致病性。
在少量二氧化碳的环境中生长的也很好。
结核菌生长的适宜温度和人体相近为 37℃。
结核菌生长所必须的元素有氧、碳、氮、 氢、磷、钾、镁等。
结核分枝杆菌的生长特性
生长适宜温度37℃，PH6.8~7.2，对营养要求 较高专嗜甘油作为碳源，天门冬酰胺是最好氮 源。在常用的罗氏培养基上生长的菌落粗糙、 凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜 花样，乳白色或米色，不透明。
结核病药敏实验
O
2
OOC22COOO2 2O2OO22肉改2 良汤Middlebrook
O2 O2
7H9肉汤
O2 CO2
FFFOOFO2F2FF2OOFFF22OO传22 感器
FFFOFF2FOFF2FF
对氧气高度敏感的钌复合物
无或微弱荧光
强荧光
液体培养对象
• 初诊的肺结核可疑症状者 • 随访的肺结核患者
痰标本采集、保存和运输
• 痰标本采集：即时痰、夜间痰、晨痰 • 痰标本保存：4 ℃保存 • 运输（UN3373类包装）：3天内必须运送到
实验室，7天内必须进行培养
培养标本的选择
诊断病例 － 3涂2培
• 3份痰标本均为阳性：选取阳性级别高的2份痰标本进行培 养；
• 3份痰标本2份阳性：选取2份阳性痰标本进行培养； • 3份痰标本1份阳性：选取阳性标本和1份质量好的阴性标
绝对浓度法
结果解释
• 敏感： 培养基斜面上无菌落
• 低浓度耐药： 培养基斜面上菌落数 （1+）~（4+）不等
• 高浓度耐药：培养基斜面上菌落数 （1+）~（4+）不等
• 实报菌落数： 含药培养基上菌落数< 20个
比例法和绝对浓度法的一致性
• 综合以往国内有关比例法和绝对浓度法的试 验报道，对2种方法研究结果显示,比例法和绝 对浓度法检测结果的一致率4 药均高达96 %以 上,对于结核分支杆菌,二种方法测试H、S、R 和E 的耐药率均无显著性差异。
1ml
混合、摇匀
分装 凝固
含药培养基
接种0.01ml
磨菌
1mg/ml菌悬液
100倍稀释
10-2 mg/ml
ml
结核菌药物敏感性测定
结核菌药物敏感性测定标准化操作及质量保证手册国家结核病参比实验室2010年3月前言结核病细菌学检查是结核病控制规划重要的组成部分，随着现代结核病控制策略（DOTS）在我国的广泛实施，以及结核病控制三大目标的全面实现，结核病防治政策与技术策略有了很大的发展，在继续扩展高质量的DOTS的基础上，积极应对耐多药肺结核（MDR-TB）、结核菌/艾滋病病毒（TB/HIV）和其他挑战。
为满足当前结核病防治工作的需要，结核病实验室的工作任务也从之前的以痰涂片镜检发现传染性肺结核病人为重点，扩展到细菌学诊断、耐药结核病诊断等更加广泛的服务领域。
结核分枝杆菌药物敏感性测定（简称）是耐（多）药结核病防治中必不可少的重要工具，其主要作用是诊断耐药结核病、选择和调整耐药结核病治疗方案、开展耐药监测以了解某一地区结核分枝杆菌的耐药水平。
目前耐多药结核病规划性管理（PMDRTB）已在我国部分地区开展了试点，并将以较快的速度在全国扩展。
但在我国公共卫生领域，分枝杆菌药敏试验开展得并不普遍，大部分结核病防治机构的结核病实验室没有相应的经验和技术，缺乏系统的标准化文件，存在标准不一致、操作不规范、质量良莠不齐的问题。
为进一步规范药敏试验的操作，保证工作质量和试验人员安全，国家结核病参比实验室与世界卫生组织合作，编制了本册《结核分枝杆菌药物敏感性测定标准化操作手册》，详细描述结核菌药敏试验各个过程的操作程序。
目前世界卫生组织推荐的药敏试验方法包括比例法、绝对浓度法和液体培养法。
其中比例法为目前我国流行病学监测和耐多药结核病规划管理项目所采用的方法，将在本手册中重点介绍。
绝对浓度法是我国三十多年沿用的药敏试验方法，为目前我国大多数结核病专科医院常规使用的用于临床检测的方法，本手册也有独立章节进行描述，方法引自《中国防痨协会结核病诊断实验室检验规程》。
本手册参考世界卫生组织系列的结核病实验室标准化操作程序（SOP）的主要框架和内容，按照我国结核病规划的实际情况和具体要求进行了调整，并通过在部分省份的试点进一步进行了修改和完善，使之更具有可操作性，供开展药敏试验的实验室使用。
结核分枝杆菌PPT课件
1.结核分枝杆菌的致病物质和引起的疾病表现有哪些? 2.简述结核菌素试验的结果、意义及在临床上的应用。
第36页，共36页。
第23页，共36页。
三、免疫性与超敏反应
第24页，共36页。
免疫性（三个“同时”）
结核病病人发病时机体： 同时有结核分枝杆菌的感染
同时有抗结核的细胞免疫 同时有迟发型超敏反应（Ⅳ型变态反应）
第25页，共36页。
有毒TB菌
科
以前感染过或免疫豚鼠
霍
现
象
局部红肿、浅溃疡
不扩散
正常豚鼠
局部红肿、溃疡
➢可借用其测定肿瘤病人的细胞免疫功能。
第30页，共36页。
第31页，共36页。
四、微生物学检查
第32页，共36页。
痰液等 标本处理：浓缩集菌(氢氧化钠处理）
直接镜检：抗酸染色
分离培养：培养基、时间（2~4周后见结果）
动物试验：豚鼠等 快速诊断：PCR等
第33页，共36页。
五、防治原则
第34页，共36页。
袭酶。其毒力可能与下述物质有关：
✓ 脂质 ✓ 蛋白质 ✓ 多糖
第16页，共36页。
脂质：
✓磷脂（形成结核结节，抑制蛋白酶对病变组织的
分解作用，使之形成干样坏死）
✓ 索状因子（破坏细胞线粒体膜，影响细胞呼吸，引起 肉芽肿）
✓硫酸脑苷脂（抑制吞噬体与溶酶体结合，使细菌 胞内感染 ） ✓蜡质D（含有分枝菌酸，引起迟发性过敏反应）
径小于0.5cm。
第28页，共36页。
问题讨论： 如果一个成年人的结核菌素试验阳性
，他一定就是结核病人吗？
结核分枝杆菌实验室检测方法(共30张PPT)
灵 敏：21、0 个菌分/反响枝〔TB杆〕； 菌快速液体培养技术
• BD公司推出的BACTEC—MGIT 960全自动 抗酸染色对分枝杆菌非特异，其他如Nocardia〔奴卡〕、Rhodococcus〔红球菌属〕、Legionella micdadei〔军团菌〕、cryptosporidium〔
呈泡沫状，称麻风细胞。 分枝状，无芽孢和鞭毛，因衰老或抗结核药物的
近年来核酸扩增技术和杂交分析技术的开展，为分枝杆菌的检测、鉴定和药敏实验提供了极大的方便，可将诊断时间从几周降低到几天。 萋尼染色法—红色—普通显微镜〔高倍〕 γ干扰素释放试验能较好地为临床效劳 发光二极管荧光显微镜〔LED〕 灵敏度：103 个菌/反响 荧光染色—黄或橘色—荧光显微镜〔低倍〕
检测范围：结核、胞内、鸟、戈登、堪萨斯、偶然、瘰疬、浅黄、土、龟-脓 肿、草、不产色、海-溃疡、金色、苏尔加、蟾蜍、耻垢。
➢ 高 效： 同时检测 17 种分枝杆菌〔包括TB〕 ➢ 快 速：＞4周〔菌种鉴定〕 6 小时 ➢ 灵 敏： 103 个菌/反响
23
结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒
基于rpoB〔利福平〕和katG/inhA〔异烟肼〕的基因突变，对耐多药结核病做 出快速诊断。
• 敏感性差，一般1mL痰中有5000-10000条菌 时可检出，而培养可检出>10-100条菌.
发光二极管荧光显微镜〔LED〕
• 荧光显微镜本钱高、易损坏、耗电量大、光源寿 命短、显微镜价格昂贵且需要在暗室内工作等， 荧光染色法一直没有在结核病痰涂片诊断中得到 广泛的应用。
• 只需将二极管替换普通光学显微镜的目镜就 相当于一台荧光显微镜，组装的“荧光显微 镜〞结合金胺O染色在结核病痰涂片检查中 有一定的应用价值。
比例法检测结核分枝杆菌药物敏感性
比例法检测结核分枝杆菌药物敏感性以下是操作步骤及结果判读标准：将待测菌液制备成10-2g/L和10-4g/L菌悬液，分别用22SWG标准接种环蘸取1环（即0.01ml）的菌液，用划线法均匀接种至对照及含药培养基表面，应注意是菌液尽可能均匀分散于培养基斜面，最终的接种量为10-4mg和10-6mg。
接种后培养基置于37℃培养，4周后读菌落数，计算耐药百分比，≤1%为敏感，＞1%为耐药。
耐药率（%）=含药培养基上菌落数/对照培养基上菌落数×100%解读：将高倍稀释的菌液即10-4g/L菌悬液接种至生长对照管，也就是不含药物的培养管；将低倍稀释的菌液即10-2g/L菌悬液接种至含药管，只接种2管，仅此而已。
不是生长对照管和含药管分别接种两种浓度的菌悬液，估计LZ是这样理解的吧。
因接种的2种不同浓度的菌液在浓度上相差了100倍，最后理论上两种菌的菌落数也应该相差在100倍左右，但因为加入了药物，所以如果菌是对所测药物敏感，那菌落数比例肯定是小于1/100，即耐药率<1%；如果为耐药菌，药物无法抑制菌落生长，相对的菌落数比例会大于1/100，耐药率>1%。
目前结核分枝杆菌复合群的药敏试验一线药物以比例法为金标准，是WHO制定公布的，而二线药物的金标准则以仪器法的MGIT960为金标准。
但目前在国内还都以固体L-J培养基为主，MGIT960的费用高，在县级以下的地区应用显然是不现实的每份标本只接种2只管：生长对照管和含药管，没有必要做双份的。
如果是做了双份的，菌落数也不会相差太大，因为菌液是一样的，除非你的菌长了很长时间，老化或死亡的结核菌多，而活菌的数量过少；还有可能是你的培养基有问题，比如不是同一批号的，药物浓度有差别。
结核菌药敏试验中菌龄是非常重要的，MGIT960的说明书中明确提出菌龄从肉眼在培养基上能观察到算起，生长不能超过14天，否则生长久了再做药敏试验就不准确了，特别是对吡嗪酰胺的药敏结果影响是非常大的。
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可能敏感和可能耐药的结核分枝杆菌临床 分离株对氧氟沙星敏感性分析
采用 L-J 培养基
(n=81) (n=111)
Do not quote this data!
校正的乙胺丁醇的临界浓度
(此试验采用改良罗氏培养基的绝对浓度法)
42%
50%
可能敏感和可能耐药的结核分枝杆菌临 床分离株对卡那霉素敏感性分析
PAS 环丝酰胺 氨苯硫脲 利奈唑酮
WHO推荐药敏试验的临界浓度, 2019
LJ* 0.2 40.0 2.0 4.0 NR 30.0 40.0 40.0 2.0 2.0
以快速培养生长检测为基础的药敏试验方法
快培生长系统
观察显微镜下的微小菌落:
- 玻片培养；显微镜观察的药敏试验（MODS）
代谢情况检测:
- CO2 产生量(放射BACTEC 460; 色素变化 MB/Bact 3D) - O2 消耗 (荧光产生 MGIT960) - TREK系统 (ESP 培养系列 II) - 微盘： 阿莫拉蓝试验 (指示管)/TEMA - ATP 产生, 生物荧光试验
In L-J Medium
In 7H10 Medium
67%
67%
INH RMP
ETH OFX CFX EMB
SM PAS KM
CPM
抗结核药物的最低抑菌浓度比平均峰值
药物 异烟肼 利福平 乙胺丁醇 链霉素 吡嗪酰胺 卡那霉素 阿米卡星 卷曲霉素 环丙沙星 氧氟沙星 莫西沙星 加替沙星 乙硫异酰胺 丙硫异烟胺
Frequency of strains Cumulative percentages
Break
point
PS
PR
100 ISONIAZID
90
80
70
13.1 as “R”
PS(99 strains) PR(117 strains)
60
50
75.8
40
30
20
10
0 2 mcg/ml
Minimal inhibitory concentrations (MIC)
-高效液相色谱应用与扩增的DNA 的突变检测
药敏试验的结果可靠性
治疗结果的预测值- 药敏试验的耐药 标准
试验可靠性 - 试验精确度& 可重复性
药敏试验的校正
获得最相关的临床耐药标准
▽ 可能的敏感株的敏感级别
▽在治疗反应变化方面测定敏感性水平 ▶从未接受过治疗的患者(PS)与至少接受5/6个月治疗的患
Break point
Clinically resistant strains (PR)
*Technical variation (inoculum/ media/ drug concent.)
Minimal inhibitory concentrations (MIC)
不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药 菌株最低抑菌浓度的分布
WHO（1963）的标准方法
绝对浓度法- Meissner
- 标化接种量; 药物浓度梯度
抗性比率法- Mitchison
- 克服培养基中药物浓度变化的缺点
比例法- Canetti / Grosset
- 临界浓度比例,更好的控制接种量
[G Canetti/ J Grosset, France; S Froman, USA; P Hauduroy, Switzerland; M Langerova/ L Sula, Czechoslovakia; HT Mahler (WHO); G Meissner, Germany; DA Mitchison, England]
传统的药敏实验
S J Kim, The Union
药敏试验的目的
• 耐药监测 - 评估治疗方案 - 选择有效的标准方案
• 病例管理 - 诊断耐药结核病(耐多药/广泛耐药结核病 ） - 为个体病例(耐多药/广泛耐药结核病）选 择有效的方案
问题
► 可靠性: 技术重复性/ 临床反应预 测
► 周转时间 ► 操作可行性及可持续性 ► 成本
Break point
*Inoculum variation
Clinically susceptible strains (PS)
Clinically resistant strains (PR)
Frequency of strains
Minimal inhibitory concentrations (MIC)
噬菌体检测: FASTPlaque; Bonx box (LRP)
以检测基因突变为基础的快速药敏试验系统
-扩增目标区的DNA测序
- 聚合酶链反应-单链构象多态性分析技术;
- 探针杂交：反向探针线性杂交方法； Hain 分枝杆菌药物抗性pl us
-分子灯塔/信标： GeneXpert系统是一个将样品准备、定量扩增 和荧光检集于一身并自动进行核酸检测分析的系统; LAMP (Eiken) 核酸环介导等温扩增技术
1 SD
Break point
Frequency of strains
3 SD
Minimal inhibitory concentrations (MIC) 最小抑菌浓度
不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药 菌株最低抑菌浓度的分布
Frequency of strains
Clinically susceptible strains (PS)
者(PR)的标本菌株的敏感性进行比较
PS = >100 菌株; PR = >50 菌株
Cantti G, et al. Bull WHO 1969; 41:21-43.
可能敏感菌株/（可能无耐药性菌株）在不同药 物浓度下的抑菌分布
Clinically susceptible strains (PS)
11.1 as “S”
0
0.1
0.2
0.4
0ry concentrations (mcg/ml)
可能敏感/可能耐药菌株对利福平的最小抑菌 浓度的累积分布（此试验采用 L-J 培养基用绝对浓度法）
85.8
不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药 菌株最低抑菌浓度的分布
基于标本的药敏检测系统
-直接法
直接涂片法（涂片阳性） 优点: 结果快; 更好的反映耐药情况 缺点: 大多数药敏试验不理想;接种量不容易标化/ 可行性较差
-间接法
对结核分枝杆菌进行培养后进行药敏试验 优点: 更好的控制接种量 缺点: 结果延迟
以传统的生长检测为基础的药敏试验方法
以传统生长检测为基础的方法