结核分枝杆菌传统药敏试验方法培训课件
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结核分枝杆菌ppt课件
22
浓缩集菌
先集菌后检查，可提高检出率。培养与动物试 验也必须经集菌过程以除去杂菌。脑脊液和胸、 腹水无杂菌，可直接离心沉淀集菌。痰、支气 管灌洗液、尿、粪等污染标本需经4% NaOH （痰和碱的比例为1:4,尿、支气管灌洗液和碱 的比例为1:1）处理15min，时间过长易使结核 分枝杆菌L型与非结核分枝杆菌死亡。尿标本 先加5% 鞣酸、5% 乙酸各0.5ml于锥形量筒内 静置，取沉淀物处理。处理后的材料再离心沉 淀。取沉淀物作涂片染色镜检。若需进一步作 培养或动物接种，应先用酸中和后再离心沉淀。
24培养?罗氏培养基一般需26周阳性结果随时报告8周无菌生长报为阴性结果阳性结果按生长菌落占斜面141234和全部划分1到425快速诊断?一般涂片检查菌数需5x1034ml培养需1x102ml标本中菌数少于此数时不易获得阳性结果且培养需时较长
一、 生物学性状
形态与染色 结核分枝杆 菌为细长略带弯曲的杆菌， 大小1～4X0.4m。牛分枝 杆菌则比较粗短。分枝杆 菌属的细菌细胞壁脂质含 量较高，约占干重的60%， 特别是有大量分枝菌酸包 围在肽聚糖层的外面，可 影响染料的穿入。
19
2.试验方法与意义：常规试验分别取2种PPD 5 个单位注射两前臂皮内，48～72h后: 硬结≤4mm者为阴性； 5-9mm为弱阳性； 10-19mm为阳性； ≥20mm或虽＜20mm，但局部出现水泡 和淋巴管炎，为强阳性。 若PPD-C侧红肿大于BCG-PPD侧为感染。反之， BCG-PPD侧大于PPD-C侧，可能系卡介苗接种 所致。
17
近来研究表明结核分枝杆菌诱导机体产生 免疫和超敏反应的物质不同。超敏反应主 要由结核菌素蛋白和蜡质Ｄ共同引起，而 免疫则由结核分枝杆菌核糖体RNA引起。二 种不同抗原成分激活不同的T细胞亚群释放 出不同的淋巴因子所致。
浓缩集菌
先集菌后检查，可提高检出率。培养与动物试 验也必须经集菌过程以除去杂菌。脑脊液和胸、 腹水无杂菌，可直接离心沉淀集菌。痰、支气 管灌洗液、尿、粪等污染标本需经4% NaOH （痰和碱的比例为1:4,尿、支气管灌洗液和碱 的比例为1:1）处理15min，时间过长易使结核 分枝杆菌L型与非结核分枝杆菌死亡。尿标本 先加5% 鞣酸、5% 乙酸各0.5ml于锥形量筒内 静置，取沉淀物处理。处理后的材料再离心沉 淀。取沉淀物作涂片染色镜检。若需进一步作 培养或动物接种，应先用酸中和后再离心沉淀。
24培养?罗氏培养基一般需26周阳性结果随时报告8周无菌生长报为阴性结果阳性结果按生长菌落占斜面141234和全部划分1到425快速诊断?一般涂片检查菌数需5x1034ml培养需1x102ml标本中菌数少于此数时不易获得阳性结果且培养需时较长
一、 生物学性状
形态与染色 结核分枝杆 菌为细长略带弯曲的杆菌， 大小1～4X0.4m。牛分枝 杆菌则比较粗短。分枝杆 菌属的细菌细胞壁脂质含 量较高，约占干重的60%， 特别是有大量分枝菌酸包 围在肽聚糖层的外面，可 影响染料的穿入。
19
2.试验方法与意义：常规试验分别取2种PPD 5 个单位注射两前臂皮内，48～72h后: 硬结≤4mm者为阴性； 5-9mm为弱阳性； 10-19mm为阳性； ≥20mm或虽＜20mm，但局部出现水泡 和淋巴管炎，为强阳性。 若PPD-C侧红肿大于BCG-PPD侧为感染。反之， BCG-PPD侧大于PPD-C侧，可能系卡介苗接种 所致。
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近来研究表明结核分枝杆菌诱导机体产生 免疫和超敏反应的物质不同。超敏反应主 要由结核菌素蛋白和蜡质Ｄ共同引起，而 免疫则由结核分枝杆菌核糖体RNA引起。二 种不同抗原成分激活不同的T细胞亚群释放 出不同的淋巴因子所致。
结核分枝杆菌及其实验室诊断新技术ppt课件
郑州大学第一附属医院 结核病防控的三大手段
结核病
临床诊断常常结合 痰涂片，胸片，症状和体征
世界防治结核病日 3月24日
郑州大学第一附属医院 结核病是由结核分枝杆菌引起的。 。
结核分枝杆菌
Robert Koch（1843-1910） 1882年发现结核分枝杆菌， 1905年获得诺贝尔生理或 医学奖。 Ziehl-Neelsen 染色法 （分枝杆菌抗酸染色的基础）
3. 生化反应
不发酵糖类 ，触酶试验阳性，而热触酶试验阴性
郑州大学第一附属医院 4. 抵抗力
结核分枝杆菌
四不怕 四怕 乙醇 干燥 湿热 碱性染料 紫外线 青霉素等抗生素 抗痨药物 对酸或碱有抵抗力 （异烟肼、利福平等） （3% HCl或6% H2SO4、4% NaOH）
5. 变异性
形态结构变异： 结核杆菌的L型：颗粒状、丝状 毒力变异： 卡介苗BCG：Calmette和Gué rin 牛分枝杆菌 13年230次 耐药性变异： 耐异烟肼及其他抗结核药物的结核菌株日益增多
郑州大学第一附属医院
检测过程与结果判断
实验室诊断新技术
空白对照
抗原 A 抗原 B
阳性对照 （PHA）
阴性 结果
阳性 结果
郑州大学第一附属医院
实验室诊断新技术
T.SPOT.TB特点： 特异性好，不受卡介苗（BCG）接种和环境分枝杆菌影响 敏感度高，在免疫力பைடு நூலகம்下/受抑制人群中有很高的检出率 快速，24小时报告结果 T.SPOT.TB 检测的敏感度和特异性 美国FDA认证临床实验数据
郑州大学第一附属医院
实验室诊断新技术
（四）蛋白分子诊断技术-γ-干扰素释放实验
（IGRA，interferon- gamma release assay）
结核培养与药敏试验
结核分枝杆菌固体培养操作流程
1
痰标本中加入 1-2倍体积 4%NaOH
2
涡旋振荡 1分钟
3
室温静置 15分钟
第3天、7天、此后每周 观察一次直至第九周, 记录菌落生长和污染
6
分别接种0.1ml
置37C温
前处理液至2
箱培养 只酸性罗氏培养基斜面
5
4
结核分枝杆菌固体培养操作流程 操作
痰标本
1－2倍 4% NaOH
No. of sputa tested n=41
n=41 n=36
培 100 养 80 阳 性 60 比 40 例
20
0
90
81
100
100
100
90
81 90
73
100
90
100
94
81
63
77
29
4C
10
25C
25
15
25-30C
0
0
3
7
14
21
28
标本保存时间（0,3,7,14,21,28天） Kim SJ, et al, 1986
特点：全自动、全封闭、快速、样本量 大 原理：分枝杆菌对NaOH的耐受性；分 枝杆菌在液体培养基生长更快，添加了 丰富的营养物质；分枝杆菌生长耗氧， 荧光增强，仪器自动探测荧光的变化。 试剂组成：MGIT培养管、MGIT生长 添加剂、PANTA杂菌抑制剂、SIRE药 敏试剂。 标本适用范围：除血液标本以外的所有 标本
结核分枝杆菌药敏试验-比例法
• 抗结核药物效价的计算：
效价 =纯度×活性成分×（1－水份含量） 实例：KM纯度99%，水分3.3%，活性成分69.6%
2024版结核病培训完整ppt课件
疾病的信心。
提高治疗依从性
通过心理干预，患者可以更好 地理解和接受治疗方案，提高
治疗依从性。
改善生活质量
心理干预可以改善患者的生活 质量，减轻疼痛和不适，提高
睡眠质量。
促进社会功能恢复
心理干预可以帮助患者更好地 融入社会，恢复正常的社会功
能。
05
结核病预防控制策略 与实践经验分享
国内外预防控制策略对比分析
03
一线药物
如异烟肼、利福平、吡嗪 酰胺等，疗效好，副作用 小，价格相对较低。
二线药物
如对氨基水杨酸、乙胺丁 醇等，疗效不如一线药物， 副作用较大，价格较高。
新药及新方案
如贝达喹啉、德拉马尼等， 对某些耐药结核菌株有效， 但价格昂贵，使用受限。
耐药结核患者管理策略探讨
01
加强耐药监测，及时发现耐药患者
聚合酶链反应（PCR）
通过体外快速扩增结核分枝杆菌的特异性DNA片段，提高结核分枝杆菌的检出 率。
血清学检测指标及意义
结核抗体检测
采用酶联免疫吸附试验等方法检测患 者血清中的结核抗体，有助于结核病 的辅助诊断。
结核菌素试验
通过皮内注射结核菌素，观察注射部位 的皮肤反应，判断机体是否感染过结核 分枝杆菌。
国际结核病防控策略
介绍世界卫生组织（WHO）等国际 组织推行的结核病防控策略，如 DOTS策略（直接观察治疗+短程化疗） 等。
国内结核病防控政策
概述我国政府在结核病防控方面的政 策措施，如《结核病防治管理办法》 等法规文件，以及国家规划、行动计 划等。
国内外策略差异分析
比较国内外在结核病防控策略上的差 异，分析各自优势与不足，为制定更 加有效的防控措施提供参考。
提高治疗依从性
通过心理干预，患者可以更好 地理解和接受治疗方案，提高
治疗依从性。
改善生活质量
心理干预可以改善患者的生活 质量，减轻疼痛和不适，提高
睡眠质量。
促进社会功能恢复
心理干预可以帮助患者更好地 融入社会，恢复正常的社会功
能。
05
结核病预防控制策略 与实践经验分享
国内外预防控制策略对比分析
03
一线药物
如异烟肼、利福平、吡嗪 酰胺等，疗效好，副作用 小，价格相对较低。
二线药物
如对氨基水杨酸、乙胺丁 醇等，疗效不如一线药物， 副作用较大，价格较高。
新药及新方案
如贝达喹啉、德拉马尼等， 对某些耐药结核菌株有效， 但价格昂贵，使用受限。
耐药结核患者管理策略探讨
01
加强耐药监测，及时发现耐药患者
聚合酶链反应（PCR）
通过体外快速扩增结核分枝杆菌的特异性DNA片段，提高结核分枝杆菌的检出 率。
血清学检测指标及意义
结核抗体检测
采用酶联免疫吸附试验等方法检测患 者血清中的结核抗体，有助于结核病 的辅助诊断。
结核菌素试验
通过皮内注射结核菌素，观察注射部位 的皮肤反应，判断机体是否感染过结核 分枝杆菌。
国际结核病防控策略
介绍世界卫生组织（WHO）等国际 组织推行的结核病防控策略，如 DOTS策略（直接观察治疗+短程化疗） 等。
国内结核病防控政策
概述我国政府在结核病防控方面的政 策措施，如《结核病防治管理办法》 等法规文件，以及国家规划、行动计 划等。
国内外策略差异分析
比较国内外在结核病防控策略上的差 异，分析各自优势与不足，为制定更 加有效的防控措施提供参考。
药敏试验简介ppt课件
– 使用CLSI 方法记录 – 采用其他方法时使用CLSI做参照方
法进行比对
ppt课件
33
CLSI M100 “表格” 内容
更新信息
M100
词汇表 I & II & III
M2 表格 扩散法
M7 表格
附录
•抗生素的测试与报告
MIC法
•S I R 折点 •质控
•抗生素的测试与报告 •S I R 折点
– 见后面的幻灯：
ppt课件
19
常量稀释法
•药敏试验的参考方法： 将标准接种物加入含対倍稀释抗生素的MH肉汤 管中. 过夜培养. MIC 即是能抑制细菌生长的含最低抗生素的浓度的那一 管所标示的浓度值(琼脂稀释法是将対倍稀释后的抗生素加入融化后平衡 到50℃的MHA中再倾制平皿，接种物为一定大小的斑点，浓度也为 104CFU/ml). 解释标准(S or R) 是建立在体内可达到的抗生素浓度水平上
梅里埃产品习惯采用的CLSI以外的标准
• 英国BSAC标准；
欧洲应用比较广泛的标准
• 德国DIN标准 …pp…t课件..
30
CLSI药敏解释标准
• CLSI (Clinical Laboratory standard institution)药敏指南
ppt课件
31
CLSI 药敏文件
• M100-S22 常见菌 (2012)** • M11-A7 厌氧菌 (2007) • M39-A3 积累抗菌谱(2009) • M24-A 分枝杆菌, 奴卡菌, 以及其他需氧放
• 培养时间：18小时
ppt课件
9
测量方法
• 透射光
− 葡萄球菌
利奈唑胺 苯唑西林 万古霉素
法进行比对
ppt课件
33
CLSI M100 “表格” 内容
更新信息
M100
词汇表 I & II & III
M2 表格 扩散法
M7 表格
附录
•抗生素的测试与报告
MIC法
•S I R 折点 •质控
•抗生素的测试与报告 •S I R 折点
– 见后面的幻灯：
ppt课件
19
常量稀释法
•药敏试验的参考方法： 将标准接种物加入含対倍稀释抗生素的MH肉汤 管中. 过夜培养. MIC 即是能抑制细菌生长的含最低抗生素的浓度的那一 管所标示的浓度值(琼脂稀释法是将対倍稀释后的抗生素加入融化后平衡 到50℃的MHA中再倾制平皿，接种物为一定大小的斑点，浓度也为 104CFU/ml). 解释标准(S or R) 是建立在体内可达到的抗生素浓度水平上
梅里埃产品习惯采用的CLSI以外的标准
• 英国BSAC标准；
欧洲应用比较广泛的标准
• 德国DIN标准 …pp…t课件..
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CLSI药敏解释标准
• CLSI (Clinical Laboratory standard institution)药敏指南
ppt课件
31
CLSI 药敏文件
• M100-S22 常见菌 (2012)** • M11-A7 厌氧菌 (2007) • M39-A3 积累抗菌谱(2009) • M24-A 分枝杆菌, 奴卡菌, 以及其他需氧放
• 培养时间：18小时
ppt课件
9
测量方法
• 透射光
− 葡萄球菌
利奈唑胺 苯唑西林 万古霉素
结核病培训课件PPT课件
结核菌素试验及意义
试验方法
将结核菌素纯蛋白衍生物（PPD） 注射于前臂掌侧皮内，48～72小 时后检查注射部位皮肤硬结直径大 小。
结果判断
硬结直径小于5mm为阴性反应； 5～10mm为一般阳性反应；10～ 19mm为中度阳性反应；大于等于 20mm或不足20mm但有水疱或坏 死为强阳性反应。
免疫学在结核病防治中应用
易感人群
人群普遍易感，但老年人、儿童、 糖尿病患者以及营养不良者等免疫 力较低的人群更易感染。
临床表现与分型
临床表现
结核病的症状因感染部位和严重程度而异，常见症状包括咳嗽、 咳痰、胸痛、发热、盗汗、乏力等。严重者可出现咯血、呼吸 困难甚至呼吸衰竭。
分型
根据感染部位和临床表现的不同，结核病可分为肺结核、淋巴 结核、骨结核、肾结核等多种类型。其中肺结核最为常见，可 分为原发性肺结核、血行播散性肺结核和继发性肺结核等。
肺炎：细菌性肺炎起病急，有高热及明 显疼痛进展很快，所以X线胸片上病变 范围广泛，可累及一叶或一叶的大部分， 密度均匀，磨玻璃样改变，当实变时出 现均匀致密影。病毒性肺炎症状轻，X 线胸片上可见肺纹理增多，小片状浸润 或广泛浸润影，病情严重者显示双肺弥 漫性结节性浸润。支原体肺炎的症状和 X线胸片检查所见与病毒性肺炎相似。 真菌性肺炎在X线胸片上可见肺纹理增 多、紊乱、模糊不清，病变呈弥漫性或 局限性。吸入性肺炎在X线胸片上首先
登记报告制度建立
为确保结核病患者得到及时有效管理，我 国已建立完善的登记报告制度，要求各级 医疗机构对确诊的结核病患者进行登记， 并定期向上级卫生行政部门报告。
VS
执行情况回顾
近年来，随着医疗水平的提高和公众健康 意识的增强，结核病患者登记率逐年上升， 报告制度执行情况良好。但仍存在部分地 区登记不全、报告不及时等问题，需进一 步加强监管和培训。
药敏试验及药敏试验结果介绍培训课件
• 每年修订更改
– 包括质控 – 新药的判定标准 – 特殊耐药性的检测
药敏试验及药敏试验结果介绍
15
NCCLS的法规
• 规定纸片含量、接种浓度、培养基、平 皿厚度、判定标准、质控
• 规定常规测试报告的抗生素 • 不同的药判定标准不同 • 不同的菌判定标准也不同
药敏试验及药敏试验结果介绍
16
常规测试并报告的药物分组(1)
罗红，克拉，阿奇 林可霉素
药敏试验及药敏试验结果介绍
20
预报用药(二)
测试药 菌名 推测其它药物的敏感性 • 氨苄西林 肠球菌 青霉素 • 青霉素G 葡萄球菌 氨苄，美洛，替卡 • 头孢噻吩 肠杆菌科 拉定，头孢氨苄，克罗 • 奈啶酸s 肠杆菌科 所有FQs • 万古霉素s 所有 替考拉宁s
药敏试验及药敏试验结果介绍
Relationship between Time above MIC and
efficacy in animal infection models
100
Penicillins
80
Cephalosporins
Mortality after 4 days of therapy (%)
13
纸片扩散法－影响因素
• MIC • 接种菌量 • 细菌生长率 • 抗生素含量、扩散性 • 平皿厚度 • 温度，预孵育时间
药敏试验及药敏试验结果介绍
14
纸片扩散法－标准化
• NCCLS：美国实验室标准化委员会 (National Committee for Clinical Laboratory Standards)
肠杆菌科
一级
氨苄
唑林，庆大
二级 阿米卡星
氨苄/舒，阿莫/克 南
– 包括质控 – 新药的判定标准 – 特殊耐药性的检测
药敏试验及药敏试验结果介绍
15
NCCLS的法规
• 规定纸片含量、接种浓度、培养基、平 皿厚度、判定标准、质控
• 规定常规测试报告的抗生素 • 不同的药判定标准不同 • 不同的菌判定标准也不同
药敏试验及药敏试验结果介绍
16
常规测试并报告的药物分组(1)
罗红，克拉，阿奇 林可霉素
药敏试验及药敏试验结果介绍
20
预报用药(二)
测试药 菌名 推测其它药物的敏感性 • 氨苄西林 肠球菌 青霉素 • 青霉素G 葡萄球菌 氨苄，美洛，替卡 • 头孢噻吩 肠杆菌科 拉定，头孢氨苄，克罗 • 奈啶酸s 肠杆菌科 所有FQs • 万古霉素s 所有 替考拉宁s
药敏试验及药敏试验结果介绍
Relationship between Time above MIC and
efficacy in animal infection models
100
Penicillins
80
Cephalosporins
Mortality after 4 days of therapy (%)
13
纸片扩散法－影响因素
• MIC • 接种菌量 • 细菌生长率 • 抗生素含量、扩散性 • 平皿厚度 • 温度，预孵育时间
药敏试验及药敏试验结果介绍
14
纸片扩散法－标准化
• NCCLS：美国实验室标准化委员会 (National Committee for Clinical Laboratory Standards)
肠杆菌科
一级
氨苄
唑林，庆大
二级 阿米卡星
氨苄/舒，阿莫/克 南
药敏试验方法简介 ppt课件
2021/3/30
23
5. 35℃孵育16～24小时，量 取抑菌圈直径；
6. 根据抑菌环的直径，按照 CLSI标准判读，报告敏感、 中介、耐药。
2021/3/30
24
CLSI对K-B法的标准化规定 纸片药物含量、细菌接种浓度、培养基、
平皿厚度、孵育时间、环境、判定标准、 质控方法等；常规测试、报告的抗生素。
52
Phoenix工作流程
将肉汤倒入检测板，盖盖子。检测板
已准备好，可以上机检测。
巧 妙 的 重 力 加 样 技 术
2021/3/30
53
Phoenix工作流程
扫描板条，输入资料
2021/3/30
54
Phoenix工作流程
将检测板放入仪器（随意位置）
2021/3/30
55
配套试剂
u 仅需区别革兰氏染色即可选板 u 板条种类齐全：
104 cfu/ml
mg/ml 4 2 1 0.5 0.25 0.12 0
2021/3/30
30
微量肉汤稀释法
2021/3/30
31
2021/3/30
32
2不能有气泡产生
静置培养
培养温度；35℃
气体环境：所有细菌（包括苛养菌）均置大 气环境；厌氧菌置厌氧环境；微需氧菌置微 需氧环境；淋菌琼脂稀释法置CO2 培养时间：18小时
A6 DGUA B6 LPYR C6 LYALD
A7 DMLB B7 LPROB C7 GUGAH
A8 LARA B8 LARGH C8 GLPRB
A9 MBGU B9 FLR_CTL C9 FLR_CTL
A10 NGA B10 LPHET C10 GLYB
结核分枝杆菌传统药敏试验方法PPT学习课件
PS = >100 菌株; PR = >50 菌株
9
Cantti G, et al. Bull WHO 1969; 41:21-43.
可能敏感菌株/（可能无耐药性菌株）在不同药 物浓度下的抑菌分布
Clinically susceptible strains (PS)
1 SD
Break point
Frequency of strains
传统的药敏实验
1
药敏试验的目的
• 耐药监测 - 评估治疗方案 - 选择有效的标准方案
• 病例管理 - 诊断耐药结核病(耐多药/广泛耐药结核病 ） - 为个体病例(耐多药/广泛耐药结核病）选 择有效的方案
2
问题
► 可靠性: 技术重复性/ 临床反应预 测
► 周转时间 ► 操作可行性及可持续性 ► 成本
7
药敏试验的结果可靠性
治疗结果的预测值- 药敏试验的耐药 标准
试验可靠性 - 试验精确度& 可重复性
8
药敏试验的校正
获得最相关的临床耐药标准
▽ 可能的敏感株的敏感级别
▽在治疗反应变化方面测定敏感性水平 ▶从未接受过治疗的患者(PS)与至少接受5/6个月治疗的患
者(PR)的标本菌株的敏感性进行比较
67%
67%
17
INH RMP
ETH OFX CFX EMB
SM PAS KM
CPM
抗结核药物的最低抑菌浓度比平均峰值
18
药物 异烟肼 利福平 乙胺丁醇 链霉素 吡嗪酰胺 卡那霉素 阿米卡星 卷曲霉素 环丙沙星 氧氟沙星 莫西沙星 加替沙星 乙硫异酰胺 丙硫异烟胺
PAS 环丝酰胺 氨苯硫脲 利奈唑酮
*Technical variation (inoculum/ media/ drug concent.)
9
Cantti G, et al. Bull WHO 1969; 41:21-43.
可能敏感菌株/（可能无耐药性菌株）在不同药 物浓度下的抑菌分布
Clinically susceptible strains (PS)
1 SD
Break point
Frequency of strains
传统的药敏实验
1
药敏试验的目的
• 耐药监测 - 评估治疗方案 - 选择有效的标准方案
• 病例管理 - 诊断耐药结核病(耐多药/广泛耐药结核病 ） - 为个体病例(耐多药/广泛耐药结核病）选 择有效的方案
2
问题
► 可靠性: 技术重复性/ 临床反应预 测
► 周转时间 ► 操作可行性及可持续性 ► 成本
7
药敏试验的结果可靠性
治疗结果的预测值- 药敏试验的耐药 标准
试验可靠性 - 试验精确度& 可重复性
8
药敏试验的校正
获得最相关的临床耐药标准
▽ 可能的敏感株的敏感级别
▽在治疗反应变化方面测定敏感性水平 ▶从未接受过治疗的患者(PS)与至少接受5/6个月治疗的患
者(PR)的标本菌株的敏感性进行比较
67%
67%
17
INH RMP
ETH OFX CFX EMB
SM PAS KM
CPM
抗结核药物的最低抑菌浓度比平均峰值
18
药物 异烟肼 利福平 乙胺丁醇 链霉素 吡嗪酰胺 卡那霉素 阿米卡星 卷曲霉素 环丙沙星 氧氟沙星 莫西沙星 加替沙星 乙硫异酰胺 丙硫异烟胺
PAS 环丝酰胺 氨苯硫脲 利奈唑酮
*Technical variation (inoculum/ media/ drug concent.)
分枝杆菌分离培养、药敏试验及菌种鉴定方法标准化(PPT-80)
特异性较直接涂片法高，可以从菌落生长速度， 色素产生初步判断非结核分枝杆菌；
分离出具有活力的纯培养物，为进一步试验提 供基础。
分离培养的缺点
需时长，根据接种量的大小，一般2~8周 才能得到肉眼可见菌落。
结果受标本保存运送时间，培养基成分 和质量，前处理方法等影响，操作较直 接涂片法复杂，需经严格培训。
1/4．
分离培养的注意事项
选择痰标本中脓性、血样、干酪样的部分进行 培养阳性率较高。
从加入前处理液到接种的时间不得多于20分钟. 涡旋振荡、离心、倾倒上清液、接种时容易产
生气溶胶，应注意使用安全仪器，正确操作。 发现培养基上菌落生长需经抗酸染色确认后方
可报告阳性。
分离培养的优点
敏感性较直接涂片法高，理论上10~100条菌/ 毫升可检出阳性；
特点：简便、快速，可进行药敏试验及初步菌 种鉴定。连续测定荧光强度，每60分钟自动测 一次，无放射性污染。
分枝杆菌种类
分枝杆菌属，除结核分枝杆菌复合群（结核分 枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分 枝杆菌）及麻风分枝杆菌外，余者统称为非结 核分枝杆菌（Nontuberculosis Mycobacteria,NTM）
结核分枝杆菌是引起人类结核病的主要病原菌， 此外，牛分枝杆菌除引起牛结核病外，少数人 类结核病也由其引起。非洲分枝杆菌致病力较 弱，是热带非洲人结核病病原体。田鼠分枝杆 菌对人类无致病性。
在少量二氧化碳的环境中生长的也很好。
结核菌生长的适宜温度和人体相近为 37℃。
结核菌生长所必须的元素有氧、碳、氮、 氢、磷、钾、镁等。
结核分枝杆菌的生长特性
生长适宜温度37℃，PH6.8~7.2，对营养要求 较高专嗜甘油作为碳源，天门冬酰胺是最好氮 源。在常用的罗氏培养基上生长的菌落粗糙、 凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜 花样，乳白色或米色，不透明。
分离出具有活力的纯培养物，为进一步试验提 供基础。
分离培养的缺点
需时长，根据接种量的大小，一般2~8周 才能得到肉眼可见菌落。
结果受标本保存运送时间，培养基成分 和质量，前处理方法等影响，操作较直 接涂片法复杂，需经严格培训。
1/4．
分离培养的注意事项
选择痰标本中脓性、血样、干酪样的部分进行 培养阳性率较高。
从加入前处理液到接种的时间不得多于20分钟. 涡旋振荡、离心、倾倒上清液、接种时容易产
生气溶胶，应注意使用安全仪器，正确操作。 发现培养基上菌落生长需经抗酸染色确认后方
可报告阳性。
分离培养的优点
敏感性较直接涂片法高，理论上10~100条菌/ 毫升可检出阳性；
特点：简便、快速，可进行药敏试验及初步菌 种鉴定。连续测定荧光强度，每60分钟自动测 一次，无放射性污染。
分枝杆菌种类
分枝杆菌属，除结核分枝杆菌复合群（结核分 枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分 枝杆菌）及麻风分枝杆菌外，余者统称为非结 核分枝杆菌（Nontuberculosis Mycobacteria,NTM）
结核分枝杆菌是引起人类结核病的主要病原菌， 此外，牛分枝杆菌除引起牛结核病外，少数人 类结核病也由其引起。非洲分枝杆菌致病力较 弱，是热带非洲人结核病病原体。田鼠分枝杆 菌对人类无致病性。
在少量二氧化碳的环境中生长的也很好。
结核菌生长的适宜温度和人体相近为 37℃。
结核菌生长所必须的元素有氧、碳、氮、 氢、磷、钾、镁等。
结核分枝杆菌的生长特性
生长适宜温度37℃，PH6.8~7.2，对营养要求 较高专嗜甘油作为碳源，天门冬酰胺是最好氮 源。在常用的罗氏培养基上生长的菌落粗糙、 凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜 花样，乳白色或米色，不透明。
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采用 L-J 培养基
Байду номын сангаас
(n=81) (n=111)
3/10/2021
Do not quote this data!
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
2
3/10/2021
基于标本的药敏检测系统
-直接法
直接涂片法（涂片阳性） 优点: 结果快; 更好的反映耐药情况 缺点: 大多数药敏试验不理想;接种量不容易标化/ 可行性较差
-间接法
对结核分枝杆菌进行培养后进行药敏试验 优点: 更好的控制接种量 缺点: 结果延迟
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
10
3/10/2021
不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药 菌株最低抑菌浓度的分布
Frequency of strains Cumulative percentages
Break
point
PS
PR
100 ISONIAZID
90
80
70
13.1 as “R”
PS(99 strains) PR(117 strains)
3
3/10/2021
以传统的生长检测为基础的药敏试验方法
以传统生长检测为基础的方法
WHO（1963）的标准方法
绝对浓度法- Meissner
- 标化接种量; 药物浓度梯度
抗性比率法- Mitchison
- 克服培养基中药物浓度变化的缺点
比例法- Canetti / Grosset
- 临界浓度比例,更好的控制接种量
噬菌体检测: FASTPlaque; Bonx box (LRP)
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
5
3/10/2021
以检测基因突变为基础的快速药敏试验系统
-扩增目标区的DNA测序 - 聚合酶链反应-单链构象多态性分析技术; - 探针杂交：反向探针线性杂交方法； Hain 分枝杆菌药物抗性pl us -分子灯塔/信标： GeneXpert系统是一个将样品准备、定量扩增 和荧光检集于一身并自动进行核酸检测分析的系统; LAMP (Eiken) 核酸环介导等温扩增技术 -高效液相色谱应用与扩增的DNA 的突变检测
3/10/2021
可能敏感/可能耐药菌株对利福平的最小抑菌 浓度的累积分布（此试验采用 L-J 培养基用绝对浓度法）
85.8
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
12
3/10/2021
不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药 菌株最低抑菌浓度的分布
Break point
*Inoculum variation
Clinically susceptible strains (PS)
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
4
3/10/2021
以快速培养生长检测为基础的药敏试验方法
快培生长系统
观察显微镜下的微小菌落:
- 玻片培养；显微镜观察的药敏试验（MODS）
代谢情况检测:
- CO2 产生量(放射BACTEC 460; 色素变化 MB/Bact 3D) - O2 消耗 (荧光产生 MGIT960) - TREK系统 (ESP 培养系列 II) - 微盘： 阿莫拉蓝试验 (指示管)/TEMA - ATP 产生, 生物荧光试验
[G Canetti/ J Grosset, France; S Froman, USA; P Hauduroy, Switzerland;
M Langerova/ L Sula, Czechoslovakia; HT Mahler (WHO); G Meissner,
Germany; DA Mitchison, England]
60
50
75.8
40
30
20
10
0 2 mcg/ml
Minimal inhibitory concentrations (MIC)
11.1 as “S”
0
0.1
0.2
0.4
0.8
1.6
Minimal inhibitory concentrations (mcg/ml)
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
11
药敏试验的目的
• 耐药监测
- 评估治疗方案
- 选择有效的标准方案
• 病例管理
- 诊断耐药结核病(耐多药/广泛耐药结核病 ）
- 为个体病例(耐多药/广泛耐药结核病）选
择有效的方案
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
1
3/10/2021
问题
► 可靠性: 技术重复性/ 临床反应预
测 ► 周转时间 ► 操作可行性及可持续性 ► 成本
1 SD
Break point
Frequency of strains
3/10/2021
3 SD
Minim结a核l i分n枝h杆ib菌it传o统ry药c敏o试n验c方en法trations (MIC)
9
最小抑菌浓度
不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药 菌株最低抑菌浓度的分布
Frequency of strains
3/10/2021
PS = >100 菌株; PR = >50 菌株
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
8
Cantti G, et al. Bull WHO 1969; 41:21-43.
可能敏感菌株/（可能无耐药性菌株）在不同药 物浓度下的抑菌分布
Clinically susceptible strains (PS)
Clinically susceptible strains (PS)
Break point
Clinically resistant strains (PR)
*Technical variation (inoculum/ media/ drug concent.)
Minimal inhibitory concentrations (MIC)
Clinically resistant strains (PR)
Frequency of strains
Minimal inhibitory concentrations (MIC)
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
13
3/10/2021
可能敏感和可能耐药的结核分枝杆菌临床 分离株对氧氟沙星敏感性分析
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
6
3/10/2021
药敏试验的结果可靠性
治疗结果的预测值- 药敏试验的耐药 标准
试验可靠性 - 试验精确度& 可重复性
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
7
3/10/2021
药敏试验的校正
获得最相关的临床耐药标准
▽ 可能的敏感株的敏感级别
▽在治疗反应变化方面测定敏感性水平
▶从未接受过治疗的患者(PS)与至少接受5/6个月治疗的患 者(PR)的标本菌株的敏感性进行比较
Байду номын сангаас
(n=81) (n=111)
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基于标本的药敏检测系统
-直接法
直接涂片法（涂片阳性） 优点: 结果快; 更好的反映耐药情况 缺点: 大多数药敏试验不理想;接种量不容易标化/ 可行性较差
-间接法
对结核分枝杆菌进行培养后进行药敏试验 优点: 更好的控制接种量 缺点: 结果延迟
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
10
3/10/2021
不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药 菌株最低抑菌浓度的分布
Frequency of strains Cumulative percentages
Break
point
PS
PR
100 ISONIAZID
90
80
70
13.1 as “R”
PS(99 strains) PR(117 strains)
3
3/10/2021
以传统的生长检测为基础的药敏试验方法
以传统生长检测为基础的方法
WHO（1963）的标准方法
绝对浓度法- Meissner
- 标化接种量; 药物浓度梯度
抗性比率法- Mitchison
- 克服培养基中药物浓度变化的缺点
比例法- Canetti / Grosset
- 临界浓度比例,更好的控制接种量
噬菌体检测: FASTPlaque; Bonx box (LRP)
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
5
3/10/2021
以检测基因突变为基础的快速药敏试验系统
-扩增目标区的DNA测序 - 聚合酶链反应-单链构象多态性分析技术; - 探针杂交：反向探针线性杂交方法； Hain 分枝杆菌药物抗性pl us -分子灯塔/信标： GeneXpert系统是一个将样品准备、定量扩增 和荧光检集于一身并自动进行核酸检测分析的系统; LAMP (Eiken) 核酸环介导等温扩增技术 -高效液相色谱应用与扩增的DNA 的突变检测
3/10/2021
可能敏感/可能耐药菌株对利福平的最小抑菌 浓度的累积分布（此试验采用 L-J 培养基用绝对浓度法）
85.8
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
12
3/10/2021
不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药 菌株最低抑菌浓度的分布
Break point
*Inoculum variation
Clinically susceptible strains (PS)
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
4
3/10/2021
以快速培养生长检测为基础的药敏试验方法
快培生长系统
观察显微镜下的微小菌落:
- 玻片培养；显微镜观察的药敏试验（MODS）
代谢情况检测:
- CO2 产生量(放射BACTEC 460; 色素变化 MB/Bact 3D) - O2 消耗 (荧光产生 MGIT960) - TREK系统 (ESP 培养系列 II) - 微盘： 阿莫拉蓝试验 (指示管)/TEMA - ATP 产生, 生物荧光试验
[G Canetti/ J Grosset, France; S Froman, USA; P Hauduroy, Switzerland;
M Langerova/ L Sula, Czechoslovakia; HT Mahler (WHO); G Meissner,
Germany; DA Mitchison, England]
60
50
75.8
40
30
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10
0 2 mcg/ml
Minimal inhibitory concentrations (MIC)
11.1 as “S”
0
0.1
0.2
0.4
0.8
1.6
Minimal inhibitory concentrations (mcg/ml)
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
11
药敏试验的目的
• 耐药监测
- 评估治疗方案
- 选择有效的标准方案
• 病例管理
- 诊断耐药结核病(耐多药/广泛耐药结核病 ）
- 为个体病例(耐多药/广泛耐药结核病）选
择有效的方案
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
1
3/10/2021
问题
► 可靠性: 技术重复性/ 临床反应预
测 ► 周转时间 ► 操作可行性及可持续性 ► 成本
1 SD
Break point
Frequency of strains
3/10/2021
3 SD
Minim结a核l i分n枝h杆ib菌it传o统ry药c敏o试n验c方en法trations (MIC)
9
最小抑菌浓度
不同药物浓度下可能敏感菌株和可能耐药 菌株最低抑菌浓度的分布
Frequency of strains
3/10/2021
PS = >100 菌株; PR = >50 菌株
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
8
Cantti G, et al. Bull WHO 1969; 41:21-43.
可能敏感菌株/（可能无耐药性菌株）在不同药 物浓度下的抑菌分布
Clinically susceptible strains (PS)
Clinically susceptible strains (PS)
Break point
Clinically resistant strains (PR)
*Technical variation (inoculum/ media/ drug concent.)
Minimal inhibitory concentrations (MIC)
Clinically resistant strains (PR)
Frequency of strains
Minimal inhibitory concentrations (MIC)
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
13
3/10/2021
可能敏感和可能耐药的结核分枝杆菌临床 分离株对氧氟沙星敏感性分析
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
6
3/10/2021
药敏试验的结果可靠性
治疗结果的预测值- 药敏试验的耐药 标准
试验可靠性 - 试验精确度& 可重复性
结核分枝杆菌传统药敏试验方法
7
3/10/2021
药敏试验的校正
获得最相关的临床耐药标准
▽ 可能的敏感株的敏感级别
▽在治疗反应变化方面测定敏感性水平
▶从未接受过治疗的患者(PS)与至少接受5/6个月治疗的患 者(PR)的标本菌株的敏感性进行比较