半抗原免疫分析(全面)
免疫学检验常用的方法有哪些
免疫学检验常用的方法有哪些免疫学是研究身体对致病微生物的防御能力以及防御能力失调的科学。
自从1796年E.詹纳使用疫苗预防天花后，免疫学研究开始全面深入地认识微生物在疾病中的作用，以及抗体和反抗原细胞的形成、动员、作用和相互作用所扮演的角色。
免疫学的范围涵盖了变态反应的治疗、器官移植后的免疫抑制以避免排异反应，以及对自体免疫疾病和免疫缺陷的研究。
免疫学常用检测方法主要包括免疫荧光组织化学法、抗原检测法、抗体检测法、化学发光免疫分析技术和酶联免疫吸附试验法等。
一、免疫荧光组织化学法免疫荧光组织化学法严格遵循免疫荧光组织化学基本原理，从基本定义来讲，免疫荧光组织化学以及免疫荧光细胞化学会以荧光为标记物，属于免疫组织化学技术。
早在1942年，Coons等首次在报道中指出用FITC标记抗体，能检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原，这是免疫荧光组织化学技术的基础。
在免疫学检验工作中，免疫组织化学技术是用免疫荧光技术对组织内抗原、细胞或者半抗原物质实施检测，结合抗原抗体反应原理，首先将已知抗原或者抗体标记荧光素制作成荧光标记物，然后，用荧光标记物充当分子探针与组织细胞的相应抗原或者抗体反应，这种复合物的荧光素会在检测过程中发出不同颜色的荧光，用荧光显微镜实施观察，就能够对组织细胞中的抗原或者抗体定性，做好定位与定量研究工作。
在检测过程中，蛋白质、酶、核酸、激素、多肽、多糖、磷脂、受体与病原体均可以作为抗原或者半抗原物质。
二、抗原检测法抗原是进入机体内能附着于淋巴细胞表面引发特定免疫反应的外来物质，几乎所有的异物大分子皆可作为抗原，如细菌、病毒、原虫、食物、毒液以及包括人类在内的各种生物细胞和组织。
抗原上面存在一个或者数个可与淋巴球表面接受体结合的部位，称之为抗原决定部位，当抗原决定部位与淋巴球表面接受体结合后，可以激活淋巴球，使其开始分裂繁殖或者引发一系列免疫反应，如制造抗体和活化杀手细胞等以对抗抗原侵入。
7.免疫分析1
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免疫应答的动力学
当抗原引入动物的有关组织时最初引起淋巴细胞的分化，
特别是在淋巴结和脾脏中的淋巴细胞。然后，一种称之为浆
细胞的抗体生成细胞便会增加。在注射入抗原和在血清中发
现抗体之间存在一个潜伏期，之后抗体的浓度增加到最大，
而后开始降低。如果抗原对动物是全新的，动物则表现出慢
的响应(初次应答)．但若动物以前遇到过这种抗原，则会出
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五种免疫球蛋白的比较
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抗体的制备
多克隆抗体：从特定的抗原免疫动物中提取的含有抗体的 血清称之为抗血清。在许多分析应用中并不需要把抗体从 血清中分离出来。这种抗血清会因不同动物，甚至是同种 动物的不同的个体由于遗传性的差异，而导致所得抗体并 非均一物质，特别是抗体的特异性及亲和力几乎每批产品 都不相同，通常称这类抗体为多克隆抗体。
除了上述考虑之外，任何一种分离方法都应简单、快速、 耗费低、易于自动化，并且适用于较多的分析对象。
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8.2.2 分离方法的分类
免疫分析中常用的分离方法
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二抗
抗动物种的二抗是在20世纪70年代末80年代初开 始使用的， 二抗是专门针对-球蛋白的一种抗体， 也称为抗抗体。二抗的使用，使免疫分析得到了巨 大的进步。
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(3)抗原的免疫原性还与免疫原的分子表层基团有关， 对蛋白质抗原。它还与氨基酸的组成相关。例如， 多聚赖氨酸无免疫原性，在其外层接上一层丙氨酸 或甘氨酸，它仍无免疫原性，但若外层接的是酪氨 酸，则它会表现出免疫原性．由此可见，带芳香环 氨基酸，或者说结构较为复杂的氨基酸对免疫原性 有重要的贡献。
择哪一种方法与抗体的用途、对抗体纯度的要求、 及抗体的种类和来源有关，如抗体可以来源于血清， 培养上清液或腹水。
(整理)免疫分析法
免疫分析法1,熟悉免疫分析法的基础知识,了解放射免疫分析法,酶免疫分析法,化学发光免疫分析法,荧光免疫分析法第一:概述基本原理基本条件方法分类免疫分析法(Immunoassay,IA):是指以特异性抗原-抗体反应为基础的分析方法.1959年,由美国Yallow和Berson等人将放射性同位素示踪技术的高灵敏性和免疫反应的高特异性结合起来,首先测定了糖尿病人血浆中的胰岛素含量,从而创立了放射免疫分析方法(Radioimmunoassay,RIA).酶免疫分析法,化学发光免疫分析法,荧光免疫分析法,时间分辩免疫分析方法等.一,基本原理(一)竞争抑制原理实质都是抗原一抗体竞争结合反应Ag*:标记抗原 Ag:未标记抗原Ab:特异抗体Ag*-Ab:标记抗原-抗体结合物, Ag-Ab代表未标记抗原一抗体结物K:平衡常数(K=K1/K2).抗原-抗体反应须满足以下条件:Ag*与Ag(待测物)必须是相同的生物活性物质;所加入Ag*和Ab的量应是固定的;Ag*与Ag的量之和应大于Ab的结合位点;Ag*,Ag及Ab须处在同一反应体系中.这种竞争抑制的数量关系成为免疫分析的定量基础(二)竞争抑制曲线(剂量反应曲线)用待测物的标准品配置一系列已知浓度的标准溶液,再加入一定量的标记抗原和抗体,待抗原抗体反应达到平衡后,测定系列标准溶液的Ag*-Ab的结合率.B代表结合的标记抗原;F代表游离的标记抗原;T代表总的标记抗原.B/F-[Ag]B/(B+F)×100%-[Ag](三)抗原一抗体反应的特点1.特异性一种抗原分子只能与由它刺激产生的抗体发生特异性结合反应.抗原的特异性主要取决于抗原决定簇(Cluster)的数量,性质及立体构型.抗体的特异性则取决于抗原结合段(fragment of antigen binding,IgFab)与相应抗原决定簇的结合能力.交叉反应(cross reaction):结构相近似的其它药物或化合物与抗体的结合.2.可逆性抗原与抗体的特异性结合是由于两者的分子结构及立体构型相互吻合,它仅发生在分子的表面,并依靠抗原一抗体分子间的静电力作用,疏水作用,氢键作用及范德华引力等而存在.是可逆反应,改变反应条件可使结合物发生水解.3.最适比例性抗原抗体的结合反应具有一定的量比关系.只有当抗原抗体两者的分子比例合适时,才能发生最强的结合反应.以沉淀免疫反应为例二,基本条件三种基本试剂:标记抗原,未标记抗原和特异抗体(一)抗原及其制备1.全抗原与半抗原抗原(Antigen):能在机体中引起特异性免疫应答反应的物质.物质的抗原性包括免疫原性和抗原特异性.免疫原性(Immunogenicity):抗原注入动物体内后能促使动物产生特异抗体.抗原特异性(Antigenic Specifiety):抗原能与特异抗体相作用的性质.1.全抗原与半抗原全抗原:同时具有免疫原性和抗原特异性的物质.半抗原(Hapten):只能与特异抗体作用但不引起机体免疫应答的物质.人工完全抗原:药物(半抗原) 本身不具免疫原性,只有当它们与某些大分子的载体物质(如蛋白质或多肽)共价结合后,才具有免疫原性.这种小分子半抗原和大分子载体物质结合后所形成的全抗原.2.人工抗原的制备(1) 载体(carrier)的选择:作为载体应考虑药物与载体结合后其免疫活性是否高,溶解度是否大,对化学反应合有机溶剂导致的变形作用有足够的抵抗力,价廉易得载体的本质是蛋白质-动物血清蛋白最常用.牛血清白蛋白(BSA), 兔血清白蛋白(RSA),人血清白蛋白(HSA)(2) 半抗原的选择药物本身必须具有合适的活性官能团,如-COOH,-NH2,-OH,-C=O等.(3)载体与半抗原的结合①碳二亚胺法利用碳二亚胺为缩合剂,将药物分子中的羧基与蛋白质分子中的氨基相连形成肽键②混合酸酐法③戊二醛法④琥珀酸酐法⑤重氮化的对氨基苯甲酸法3.人工抗原的鉴定鉴定的目的:测定人工抗原(药物)与蛋白质的结合比光谱分析法化学分析法放射性同位素法(1)光谱分析法结合物水解后,光谱法测定水解药物和蛋白质的含量,从而推算出它们的分子结合比. (2)化学分析法利用三硝基苯磺酸钠或二硝基酚,测定蛋白质与半抗原结合前后游离氨基数目的差别.反应出蛋白质与药物的结合程度,可求出结合物中药物的含量.(3)放射性同位素标记法在制备人工抗原时,在已知量的药物中加入定量的放射性同位素标记药物,然后通过测定结合物中的放射性强度,便可计算出加入的标记药物的总量中已与蛋白质结合的比例.4.标准抗原(Standard antigen)标准抗原:在免疫测定中用来制作标准曲线或制备标记抗原用的药物标准品,是免疫分析的定量依据.蛋白质,多肽类可使用纯度较低的产品,但一般不应低于90%,尤其是其中不能含有化学结构相类似的干扰杂质,否则会使样品的测定结果偏高.(二)特异抗体的制备及鉴定1.特异抗体(Specific Antibody)特异抗体:(高度特异性)是指抗原(免疫原)作用于机体产生免疫反应,在血清中产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白.在免疫球蛋白中,免疫球蛋白G (IgG)含量最高(约占70%),是免疫分析中最常用的抗体.2.抗体的制备单克隆抗体(Monoclonal Antibody,McAb): 将预先免疫过的小鼠脾细胞与体外培养的骨髓瘤细胞,经细胞融合技术而得到的杂交瘤细胞.该瘤细胞通过体外培养,可大量复制,产生出特异的结构相同的均质抗体,此即单克隆抗体.多克隆抗体(Polyclonal Antibody)的制备是将抗原直接免疫动物而得到.抗体:单克隆抗体和多克隆抗体(抗血清)两大类(1)免疫原的制备免疫原(Immunogen):人工将抗原制成能刺激机体引起体液及细胞免疫反应的物质.水剂:抗原中加入一定量的无菌生理盐水所制成的免疫原.福氏完全佐剂(Freund's Complete Adjuvant):其制法是:取羊毛脂一石蜡油(1:3)混合,高压灭菌,等体积地与一定浓度的抗原混合,按3 mg/ml的量加入卡介苗,研磨或于无菌注射器中对拉,使之成为油包水的程度(放入冰水中不扩散)即可.福氏不完全佐剂在福氏完全佐剂中去掉卡介苗.(2)免疫接种动物家兔不仅对抗原的免疫反应较好,而且产生的抗体也较均一,是首选的免疫动物.羊,豚鼠微量免疫法的免疫抗原量在微克级内,常量免疫法的免疫抗原量通常在1～10 mg左右,大量免疫法的免疫抗原量在50～100 mg.(3)抗血清的获得采血时应注意无菌操作,尽可能将血放人面积较大的无菌容器中,先室温凝固30min左右,再放人30℃温箱约2h使凝固,最后放入4℃冰箱过夜.次日吸取血清,将血块用无菌的玻璃棒轻轻拨离并捣碎,在4000-10000 r/min离心20min,即得抗血清.大动物免疫羊部分采血家兔等小动物杀死动物一次性放血.3.抗体的鉴定(1)滴度(Titer)滴度又称效价或工作稀释度.滴度用免疫反应液中抗体(实指抗血清)的稀释度表示,稀释倍数越大,表示滴度越高.测定滴度可采用标记抗原法.RIA法测定抗血清的效价为例首先将抗血清用空白血清按比例稀释,然后精密吸取各稀释抗血清等量,分置若干支试管中,再于各试管中分别加入定量的放射性同位素标记药物(设放射性强度为T),温育.待反应达到平衡后,于反应液中加人分离剂(如沉淀剂),分离与抗体结合的标记药物(沉淀部分),测定各管中沉淀的放射性强度(B),并计算各管中标记药物的结合百分率(B/T%).当抗血清稀释度足够低时,其结合率趋于极值,该值称为"过量抗体结合率"(标记药物全被结合),如图中曲线的AB段,可用来衡量标记药物的质量.自AB段以后,随着抗血清稀释倍数增大,其标记药物的结合率逐渐降低,实际工作中多采用结合率为50%时(C点)的抗血清稀释度(D点).(2)活度(Avidity)活度:抗体与相应抗原的亲和力(Affinity).活度可反映出抗体分子和抗原分子之间的结合能力.活度高,表明形成抗原一抗体结合物的速度快而解离小.抗体活度高低与免疫分析方法的灵敏度密切相关,它主要表现在剂量反应曲线的斜率上,斜率越陡,表明活度越高,测定效果越好.(3)特异性(Specificity)特异性:抗原和抗体的结合能力与其它结构相类似的干扰物的结合能力的比较.如果抗体与抗原的结合能力越强,而与其它类似结构的干扰物结合能力(称为交叉反应)越弱,则说明抗体的特异性越强.三,方法分类1.按标记物的种类分(1)放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)(2)酶免疫分析(enzyme immunoassay,EIA)(3)化学发光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay,CIZIA)(4)荧光免疫分析法(fluorescence immunoassay,FIA)荧光免疫分析法底物标记荧光免疫分析(Substrate labeled fluorescence immunoassay,SLFM)荧光偏振免疫分析(fluorescence polarization immunoassay,FPIA)荧光淬灭免疫分析(Fluorescent Quenching Immunoassay,FQM)荧光增强免疫分析(Fluorescent Enchancement Immunoassay,FEIA)时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluorescence immunoassay,TRFIA)2.按是否加入分离剂分(1)均相免疫分析(Itomogeneous lmmunoassay)在某些免疫分析中,当抗原一抗体反应达到平衡后,反应液中结合的标记药物与游离的标记药物之中有一种不产生信号或信号消失,因此无需将反应液分作两相,即可在均相溶液中进行测定,故称为均相免疫分析.如酶放大免疫测定技术(enzyme multiplied immunoassay technique,EMIT) .(2)非均相免疫分析(heterogeneous immunoassay)在某些免疫分析中,当抗原一抗体反应达到平衡后,只有在反应液中加入分离剂,将游离标记药物和结合标记药物分开之后,才能测出各自部分的标记药物浓度.否则,测定的是两者的总浓度.由于这种信号的测定需将反应液分成液-固两相后,才能分别测定,故称为非均相免疫分析.如放射免疫测定(Radioimmunoassay,RIA)第二放射免疫分析放射性同位素标记抗原F与B的分离技术放射免疫测定仪标准曲线的制备与样品测定步骤方法评价应用举例放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA):利用放射性同位素的测量方法与免疫反应基本原理相结合的一种同位素分析技术.特点:灵敏度高,特异性强,样品用量少,标记物容易制备以及放射性强度容易检测一,放射性同位素标记抗原在体内药物分析中,常采用放射性同位素.放射性同位素是指能自发放射出射线而变成其它元素的不稳定同位素.放射性同位素在发生核衰变时,会发射出α-射线,β-射线及γ-射线.用相关仪器检测产生的射线,即可用于于定量分析.1.放射性强度放射性强度(严格说应为放射性活度):每秒钟放射性同位素的原子核发生的衰变数(desintegration per-second,dps),其单位为贝可(Bq).1贝可相当于每秒1次核衰变,即lBq=1dps.1居里是指每秒钟放射性同位素发生3.7×1010次核衰变.2.放射性比度放射性比度或称比放射性或比活性:放射性同位素单位重量或体积中所含的放射性强度. mci × g-1或mci×ml-13.放射性化学纯度(放化纯度)放化纯度是指供使用的放射性药物中所需要的标记药物的放射性强度占总放射性强度的百分比.一般实验要求放化纯度大于90%.(二)标记抗原(Iabeled Antigen)标记抗原又称放射性标记药物,供标记的药物通常应是待测药物的纯品.标记抗原的纯度决定RIA的特异性,而标记抗原的放射性比度则决定RIA的灵敏度.因此,标记抗原是RIA测定技术中最关键的成分.1.对标记抗原的一般要求①有高的放射性比度;②标记后抗原仍具有原来的抗原性;标记物稳定性要好,不致因辐射引起化合物分解.2.标记放射性同位素的选择125I的特点是:①化学性质活泼,易于标记;②标记物在衰变中放出的γ-射线能量较高,易于测定;③标记物的放射线半衰期相对较短,须经常标记;④碘原子的半径较大,标记后可改变药物的化学结构或掩盖药物分子的特异功能基团,易使药物分子的抗原性受到影响.3H的特点是:①用3H标记后的药物可获得较高的放射性比度;②标记后的药物的抗原性不会受到影响,因为氢原子的半径较小,且3H只是与药物分子的1H发生交换,不涉及化学元素的改变③ 3H的半衰期很长,可达12～16年;④ 3H发射出的β射线能量较低,须采用价格较贵的液体闪烁计数器才能测定其放射性强度.(三)标记方法1.125I标记抗原的制备取代反应将其标记在药物或药物的衍生物上.用碘标记时一般采用氧化法,常用的氧化剂有H2O2及氯胺T等,目前应用最多的是氯胺T.氧化法是指先用氧化剂将放射性碘离子(I-)氧化成游离的放射性碘分子(I2),然后再进行标记.大分子药物可直接采用放射性碘标记.小分子物质一般先将药物制成含酪氨酸,组氨酸或含酚基的衍生物,然后再进行标记,使药物分子中的氢被带正电荷的放射性碘取代.2.3H标记抗原的制备H标记可分为定位标记和非定位标记两种方法.非定位标记通常采用气体曝射法,即将药物与氚(3H)气密封在一起,放置几天或几周,使3H与药物分子的1H发生交换定位标记采用特殊的合成路线,即先将3H引入药物分子结构中的指定位置,制成含有不饱和双键的标记药物前体,然后再对双键部位进行催化加氚.这种制备3H标记物的方法称为定位标记.二,F与B的分离技术游离的标记药物(F)和结合的标记药物(B)1,沉淀法2,吸附法3,固相法4,双抗体法(一)沉淀法用蛋白沉淀剂将抗体沉淀,从而可使与蛋白(抗体)相结合的药物也一起沉淀下来,而游离的药物由于未与蛋白结合,便留在于溶液中.常用的沉淀剂:硫酸铵,亚硫酸氢钠,乙醇,异丙醇.方法:在免疫反应达到平衡后的反应液中加入一定量的饱和硫酸铵溶液,使最终浓度为1.6-2.0mol/L (约40%-50%的饱和度),立即混匀,在4℃条件下反应20～30min后,离心,分离沉淀物,用40%的硫酸铵饱和溶液洗涤沉淀,然后测定放射性强度.优点:快速,简便,价廉.缺点:不能使F和B完全分离,沉淀物对放射性标记抗原有非特异性吸附,因而空白值较高.(二)吸附法吸附法是利用固体吸附剂能在反应液中吸附游离抗原的原理而使F与B分离.常用的吸附剂:右旋糖酐包裹的活性炭(Dextron Coated Carbon,DCC),纤维素,硅酸盐等.原理:DCC是利用活性炭的强吸附性和右旋糖酐的分子筛作用,使小分子的游离药物能通过分子筛的网眼被内层的活性碳选择性吸附,而与抗体相结合的药物由于分子体积大则不能通过网眼而被留在液相中.方法:当免疫反应达到平衡后,于反应液中加入DCC吸附剂,待吸附达平衡后,离心.离心后的结果正好与沉淀法相反,上清液中是与抗体相结合的标记药物(B),而沉淀中则是游离的标记药物(F).优点:快速,简便缺点:如药物一抗体结合物的离解常数较高时,测定结果不稳定.(三)固相法原理:通过物理涂敷或化学结合方法将抗体结合在不溶性固相载体表面,待抗原与抗体形成结合物(B)后就附在固相物上,而游离的抗原(F)则仍留在反应液中,从而实行分离.该法实质上是一种固相免疫测定法(solid-phase immunoassay),其固相本身就是一些特异的免疫吸附剂.常用的固相载体:葡聚糖凝胶,聚苯乙烯,纤维素,试管等.方法:采用试管固相法,即将抗体直接附着于试管底部的内壁上,测定时于试管中加入样品和试剂,当放射免疫反应达到平衡后,结合物就附在管壁上,游离抗原则留在液相中.通过离心或采用简单倾去法便可将两相分离.优点:简便,快速,实用.缺点:有时难以获得重复的结合率,其次是固相载体本身也有可能吸附游离标记药物,导致结果误差增大.(四)双抗体法分离原理:药物(半抗原)与抗体结合后,虽然分子量增大,但还不足以生成沉淀而处于"溶解"状态,这种抗体通常被称为第一抗体,它可通过将抗原注入家兔,豚鼠等动物体内免疫获得.然后再将第一抗体作为新的抗原注入羊,马,牛等较大动物,则可免疫获得第二抗体(抗一抗体).当往第一抗体的反应液中加入第二抗体后,第一抗体能与第二抗体结合使分子量增大,从而生成沉淀.离心后与抗体结合的标记药物(抗原-第一抗体-第二抗体结合物)处在沉淀中,而游离的标记抗原则留在上清液中.优点:分离效果好,适用范围广.缺点:抗体的制备有一定难度,且操作流程较长.三,放射免疫测定仪一类是γ计数器(γ-Counter),其所用的闪烁体是碘化钠等固态闪烁晶体,为提高其发光效率,还在晶体内加入有0.1%-0.5%的铊作为激活剂,该仪器适合测定125I,131I等同位素发射出的能量较高的β-射线.一类是液体闪烁测量仪(Liquid Scintillation Counter),由于该仪器放出的β射线能量低,射程短,不可能穿人和激发固态闪烁晶体,而只能在特定的闪烁液中进行,由β-射线激发液体闪烁剂而产生闪光现象.该仪器适合测定3H,14c等同位素发射出来的β-射线.(一)测量原理液体闪烁测量仪是利用放射性同位素标记药物所发射出的β-射线能作用于闪烁液而发出荧光(闪光),该荧光与放射性药物在单位时间内的核衰变次数有关,通过检测闪烁次数便可求出待测组分含量.1.溶剂作用:溶解闪烁剂和放射性样品;同时还起着吸收和转移β-射线能量的作用.条件:溶剂分子必须具有高度共轭的双键,只要受到能量低的β-射线的辐射,其π电子就能跃迁至激发态.一类是烷基苯类,甲苯,对-二甲苯,1,2,4-三甲苯等,主要适用于脂溶性药物的测定.另一类是醚类,1,4-二氧六环,适用于水溶性药物的测定.种类2.闪烁剂作用:接受激发态溶剂分子退激时所释放的能量→激发态→基态→发射出闪烁的荧光(光子)→光电倍增管→光电转换测量系统记录.要求:性能稳定,闪烁效率(闪烁剂放出光子的能量)高,淬灭耐受性好,发光衰减时间短.常用的闪烁剂有:对联三苯(TP),2,5-二苯基恶唑(PPO),2-苯基-5-(4-联苯基)-1,3,4-恶-二唑(PBD)等.(二)仪器简介1.计数瓶计数瓶(或称闪烁杯):一个具盖的玻璃或塑料小瓶(10～20m1),用于盛装样品和闪烁液.当放射性药物分子与闪烁液接触时,溶剂吸收放射能量并转给闪烁剂,闪烁剂将吸收的能量转变为光能(荧光),荧光透过计数瓶壁,进入光电倍增管.2.光电倍增管光电倍增管:光阴极,倍增极和阳极构成.进入光电倍增管的荧光(光子)通过光阴极表面的透明面板后,直接撞击光阴极,光阴极吸收光子能量后随即发射出光电子,光电子经数个倍增极依次放大,使电子数剧增.这些电子最后被阳极收集,产生一个电压脉冲,并由记录器记录下来3.记录器用于记录单位时间内所产生的电压脉冲数,该脉冲数反映了单位时间内放射性药物的核衰变次数(闪烁次数).通常采用每分钟计数(counts per minate,cpm),作为放射性同位素药物的放射性强度.四,标准曲线的制备与样品测定步骤(一)标准曲线的绘制取标准抗原,用无放射活性的空白血清或血浆稀释成5-8个系列浓度.加入定量标记抗原,其总放射性(T)应能满足准确测量的需要.加入定量的已稀释好的特异抗体,其抗体的量应满足灵敏度的要求.将标准抗原,标记抗原,特异抗体与缓冲液混匀后,在适当条件下温育,待反应平衡后测定总计数率(T).加入分离剂,使结合部分(B)与游离部分(F)分离.测定各管结合部分或游离部分的计数率.标准曲线通常以标准抗原(待测药物标准品)的浓度为横坐标,以结合率(B%)为纵坐标作图.纵坐标B%的计算有两种方法:一种是将与抗体结合的标记药物的放射性强度(B)与加入的标记药物总放射性强度(T)比较,即B%=(B/T)×100%;另一种是用零标准管(不加药物标准品)的放射性强度B0代替T比较,即B%=(B/B0)×100%.(二)样品测定步骤下述情况样品需进行简单处理:测定方法不够灵敏,可将被测物适当浓集;测定方法不很专属,可将被测物与其它干扰物质分离;待测物以缀合物形式存在,可设法使其游离,然后进行测定.例:125I-RIA(DCC沉淀法)测定血清中地高辛浓度待测血清样品50μl→样品管中;含不同浓度地高辛标准品的血清50μl→标准曲线各管中;50μl 空白人血清→零标准管.各管中依次加入保温液100μl→抗体溶液100μl→125I标记的地高辛(溶液)100μl摇匀→在室温(15～25℃)放置30min→γ-计数器测定各管的总计数T(即加人的协I总放射性剂量)→在电磁搅拌(或手摇)下,迅速向各管内加人1ml工作液(全部加完控制在5min内),摇匀→离心10min(3000r/min)→倾去上清液→γ-计数器测定各管中沉淀的计数F(游离协I地高辛放射性强度)→计算出标准曲线各管和样品各管的结合率.五,方法评价灵敏度高,特异性强,取样量少,适用于大批量样品的测定.需用放射性同位素标记抗原,其放射性对操作人员的健康,对环境的污染都会造成危害,而且还需有专用的同位素实验室及免疫测定仪器,成本较高,因而使其普及受到限制. 六,应用示例固相放射免疫分析试剂盒测定血清中地高辛浓度的方法1.主要试剂2.测定方法3.结果计算(1)标准曲线法以地高辛标准品血清浓度为横坐标,B标/T(%)为纵坐标,在半对数坐标纸上绘出标准曲线..以地高辛标准品血清浓度为横坐标,但用(B标-BNSB)/(B0-BNSB)(%)为纵坐标作标准曲线,当测得血清样品的(B样-BNSB)/(B0-BNSB)(%)值后,也可从标准曲线上得到对应的血清药浓(2)回归方程计算法以logx为自变量(x为血清中地高辛标准品的浓度),以logitY为因变量进行直线回归第三酶免疫分析法酶标记抗原均相酶免疫分析非均相酶免疫分析方法评价应用示例酶免疫分析(Enzyme Immunoassay,EIA)是以酶作为标记物的免疫测定方法.酶免疫分析法是1971年由Engvall等人在RIA的基础上发展产生起来的一种新的免疫分析方法. 一,酶标记抗原(一)标记酶的选择特异性强,酶蛋白分子中应具有足够的活性基团,以便能与药物结合.活性要高,即当底物浓度低时,确有较高的催化反应率.酶的活性不易受样品中其它成分影响,有较好的稳定性.酶的纯度要高,且生物体液中应无标记酶,底物,抑制剂及其它干扰物质存在.酶的活性测量方法应简单,灵敏,精密和快速.酶的来源,纯化,供应等应方便,价廉.最常用的标记酶1.辣根过氧化物酶(HRP):约有50%的EIA使用此酶.2.碱性磷酸酯酶(AP):AP标记的结合物性质稳定,其活性可用分光光度计或荧光计测量.3.6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD): 通常用于均相EIA.4.β-半乳糖苷酶(β-Gal): 适用于均相EIA和非均相EIA.5.苹果酸脱氢酶(MDH): 多用于尿样的均相EIA.(二)底物的选择①无色,无毒能溶水;②化学性质稳定,不受光照的影响;③转化率高,在酶催化下可产生大量的有色物质;④显色产物的量在一定范围内与酶的浓度或活性成正比;⑤应有终止酶反应的试剂.常用酶的底物1,辣根过氧化物酶的底物:邻苯二胺(OPD),5-氨基水杨酸(5-ASA),四甲基联苯胺及其硫酸盐(TMB/TMBS)2,碱性磷酸酶底物:对硝基酚磷酸盐溶液(p-NPP),4-甲基伞酮基-磷酸盐(4-MUP)3,β-D-半乳糖苷酶底物:邻硝基苯-β-D-半乳糖吡喃苷(o-NPG),氯酚红-β-D-半乳糖吡喃苷(CPRG),试卤灵-β-D-半乳糖吡喃苷(RG)4,葡萄糖氧化酶底物:与辣根过氧化物酶底物相同(三):酶标记药物的制备。
临床检验技师-临床免疫学和免疫检验(2019)讲义第三章免疫原和抗血清的制备
第三章免疫原和抗血清的制备第一节免疫原的制备免疫原指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。
一、颗粒性抗原的制备细胞、细菌、寄生虫等皆为颗粒性抗原。
细胞抗原（如绵羊红细胞）一般情况下经生理盐水或其他溶液洗净，配制一定浓度即可。
细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。
颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法。
二、可溶性抗原的制备和纯化（一）组织和可溶性抗原的粗提蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好的可溶性抗原。
1组.织匀浆的制备（1）高速组织捣碎机法；（2）研磨法：组织匀浆液要离心沉淀，沉淀物为组织和细胞碎片，上清液为提取可溶性抗原的材料。
2细.胞的破碎（）反复冻融法：℃冷冻，〜7融化。
（2）超声破碎法（3）自溶法（4）酶处理法：胃蛋白酶或胰酶。
（5）表面活性剂处理法：十二烷基硫酸钠。
3免.疫球蛋白片段的制备（）非共价键解离法：改变环境或用变性剂。
（2）共价键解离法：还原法或氧化法解离二硫键。
（3）溴化氰裂解法：溴化氰裂解蛋白质肽链。
（4）酶解法：木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶。
（二）可溶性抗原的提纯和纯化超速离心法：适用于少数大分子抗原或比重较轻的抗原，不适用于大多数中小分子抗原。
选择性沉淀法：（1）核酸去除法：核糖核酸降解法更简便。
（2）盐析法：常采用硫酸铵使蛋白抗原进行粗筛、提取丙种球蛋白及抗原浓缩。
（3）有机溶剂沉淀法：常采用乙醇或丙酮。
（）聚合物沉淀法：常用非离子型聚合物，如聚乙二醇（）G凝胶过滤法：根据分子大小进行分离纯化。
离子交换层析法：利用一些带电离子基团的凝胶或纤维素，吸附带有相反电荷的蛋白质抗原。
5亲.和层析法：与生物分子间不同的亲和性进行分离。
如抗原和抗体、酶和酶抑制物、酶蛋白和辅酶、激素和受体等。
电泳法：蛋白质在同一环境中，分子量和电荷不同，在电场中迁移速率不同进行分离。
（三）纯化抗原的鉴定蛋白质含量测定：常用的是紫外光吸收法，该法测定和的吸光度（）值。
半抗原与蛋白质偶联技术课件
录
• 半抗原的介绍 • 蛋白质偶联技术的介绍 • 半抗原与蛋白质偶联的方法 • 偶联效果的评估 • 实例展示
01
半抗原的介绍
半抗原的定义
半抗原
是指那些能够与抗体结合，但没 有免疫原性的小分子物质。
半抗原的特点
具有反应原性，即能够与抗体结 合的特性，但本身不具有免疫原 性，不能诱导机体产生免疫应答 。
蛋白质偶联技术的应用
蛋白质偶联技术在免疫分析、 生物传感器、抗体药物等领域 具有广泛的应用。
通过将半抗原与蛋白质载体进 行偶联，可以制备出具有特定 功能的免疫分析试剂，用于检 测生物样品中的目标物质。
此外，蛋白质偶联技术还可以 用于制备抗体药物和生物传感 器，以治疗疾病和监测环境中 的有害物质。
03
荧光标记法
利用荧光标记技术检测偶联产物的荧光强度，通过与标准品比较，判断偶联产 物的活性。
偶联产物的稳定性检测
热稳定性检测
通过加热处理偶联产物，观察其稳定性和热失活情况，以评 估偶联产物的热稳定性。
储存稳定性检测
将偶联产物在不同温度和湿度条件下储存，定期检测其活性 变化，以评估偶联产物的储存稳定性。
偶联产物的活性检测
通过生物学实验验证偶联产物是否保 持了原有蛋白质的生物学活性，如细 胞增殖、信号转导等。
实际应用中的实例
肿瘤免疫治疗
利用半抗原与蛋白质的偶联技术制备肿瘤免疫治疗药物，通过激活患者自身的免疫系统 来攻击肿瘤细胞。
疫苗研发
将半抗原与病毒或细菌的蛋白质结合，制备出具有免疫原性的疫苗，用于预防传染病。
碳二亚胺法
总结词
一种高选择性的偶联方法，通过形成稳 定的酰胺键将半抗原偶联到蛋白质上。
VS
免疫分析法
（1）活化蛋白质或多肽的游离羧基形成肽键的结合剂 碳化二亚胺类（EDC） 异唑盐类 烷基氯甲酸类
（一）半抗原和载体结合的化学反应
（2）连接氨基的结合剂 二异腈酸类 二亚胺酯 卤代硝基苯
（一）半抗原和载体结合的化学反应
2、甾体
甾体激素不能直接和载体蛋白形成有效的共 价键，因此需要先制备甾体的衍生物（含游离的 羧基），然后再与载体蛋白连接，制成全抗原。 （1）甾体衍生物的制备 琥珀酸衍生物 肟衍生物 （2）甾体衍生物和蛋白质的结合反应
腹水制备法：常规是先腹腔注射0.5ml 液体石蜡（主要是 为了防止动物的排斥反应）于小鼠，1～2周后腹腔注射 1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水， 密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多， 而小鼠死亡之前，处死小鼠，用滴管或注射器将腹水吸入 试管中，一般一只小鼠可获5～10mL腹水。腹水中单克隆 抗体含量可达到0.5～5mg/mL，这是目前最常用的方法。
去掉福氏完全佐剂中的卡介苗即为不完全佐剂。
一、全抗原和半抗原
3、药物分子的抗原特异性
1）实践中，当药物分子和蛋白质载体结合后，诱导 机体产生的抗体通常为不均一抗体。即：有多个 不同的抗体，各抗体的特异性略不相同；
2）和蛋白质的结合还可能导致药物分子原有抗原特 异性的改变—抗原决定簇改变。
二、人工抗原的合成
抗体分子是一种蛋白质，也具有刺激机体产生免疫应答 的性能。不同的免疫球蛋白分子，各具有不同的抗原性。
四、抗体的制备
免疫分析中，常用到的两类抗体为抗血清 （多克隆抗体）和单克隆抗体。 1、抗血清 抗血清，通常指由抗原直接免疫动物后所制成 的多克隆抗体，它是免疫分析中的重要工具。 抗血清也称免疫血清，要获得一种质量好的抗 血清，主要有免疫原的制备、动物免疫、放血、 抗血清分离及抗血清的分析鉴定等步骤。
临床医学检验临床免疫：免疫标记技术必看题库知识点(强化练习)
临床医学检验临床免疫：免疫标记技术必看题库知识点（强化练习）1、多选电泳技术根据其工作原理可分为OA.移界电泳B.区带电泳C.等速电泳D.等电聚焦电泳E.免疫电泳正确答案：A,B,C,D,E2、单选、（江⅛⅛哥‘）'用E1.lSA抗体夹心法检测抗原A时，固相载体的包被物是（）A.酶标记A抗体B.未标记的抗A抗体C.未标记抗原AD.酶标抗球蛋白抗体E.酶标记的A抗原正确答案：B3、单选电泳分析的血标本，冰箱冷藏保存标本可稳定的时间是OA.1周B.2周C.3周D.4周E.5周正确答案：A4、单选在用RIA检测某种激素在血清中的浓度时，其抗原抗体复合物中的放射性强度越大，表明OA.该激素在血清中的浓度越高B.该激素在血清中的浓度越低C.游离的标记激素的浓度越高D.对这种激素的特异性抗体浓度越高E.游离的标记激素浓度越低正确答案：B参考解析：RIA原理：标记抗原与非标记抗原（待测物）对有限量特异性抗体竞争性结合，Ag—Ab复合物放射性越大，则表示被标记的抗原结合越多，而非标记标原（待测物）浓度越低。
【考点】：放射免疫分析（RlA）5、单选荧光抗体染色技术的检测方法特异性最好，敏感度最差的方法是OA.直接法B.间接法C.补体法D.双标记抗体法E.流式细胞技术正确答案：A6、单选在E1.ISA中，不是E1.lSA的反应过程，但却是决定试验成败的关键的是（）A.温育B,洗涤C.加样D.结果判断E.做阴阳性对照正确答案：B7、单选酶增强免疫测定技术是最早取得实际应用的OA.均相酶免疫测定B.异相酶免疫测定C.固相酶免疫测定D.液相酶免疫测定E,固相一液相酶免疫测定正确答案：A8、单选下列不属于E1.ISA测定方法中所必需的试剂（）A.固相的抗原或抗体B.酶标记的抗原或抗体C.酶作用的底物D.戊二醛交联剂E.稀释的血清正确答案：D参考解析：E1.lSA是在固相载体上包被抗原或抗体后，通过抗原抗体反应使酶标抗体（或酶标抗原）结合到载体上，经洗涤使结合的酶标抗体和游离的酶标抗体分离，洗去游离的酶标抗体（或酶标抗原）。
免疫分析在食品安全检测中的应用
免疫分析在食品安全检测中的应用
贾晓川;安奉凯;潘红青;王硕
【期刊名称】《食品研究与开发》
【年(卷),期】2009(030)004
【摘要】免疫分析利用抗原抗体特异性结合反应为基础,具有特异性强、灵敏度高、方法简捷等优点,被广泛应用于食品安全检测中.本论文综述基于免疫分析原理,包括传统和一些新型的免疫分析技术在食品安全检测中的应用现状.
【总页数】5页(P152-156)
【作者】贾晓川;安奉凯;潘红青;王硕
【作者单位】天津出入境检验检疫局,天津300457;天津科技大学"食品营养与安全"教育部重点实验室,天津300457;天津出入境检验检疫局,天津300457;天津科技大学"食品营养与安全"教育部重点实验室,天津300457;天津出入境检验检疫局,天津300457;天津科技大学"食品营养与安全"教育部重点实验室,天津300457;天津科技大学"食品营养与安全"教育部重点实验室,天津300457
【正文语种】中文
【中图分类】TS2
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免疫分析法
（1）半抗原和载体结合的化学反应
多肽类激素：活化蛋白质或多肽的游离羧基 形成肽键；与蛋白质或多肽的游离羧基缩合 形成肽键。 甾体：通过含游离羧基的甾体衍生物与载体 蛋白相连。 抗生素：ß-内酰胺环在偏碱性条件下可以与 蛋白质的自由氨基以酰胺键的形式共价结合； 氨基糖苷类抗生素用碳化二亚胺为连接剂实 现药物和载体蛋白的连接。
免疫原的制备
免疫原由质量好的抗原与佐剂制成。通常有 免疫原水剂、福氏完全佐剂和福氏不完全佐 剂。 水剂由无菌生理盐水将抗原制成一定浓度的 免疫原。 弗氏佐剂是由一定量的羊毛脂和石蜡油，以 及一定浓度的分支杆菌混合而成，经研磨达 到油包水的程度。 不完全福氏佐剂即不含有分支杆菌。
动物免疫
通常的免疫动物为家兔和羊。 免疫的部位多采用脚掌、腹股沟淋巴结、大 腿肌肉、皮下多点、静脉。 免疫抗原量通常为1~10mg或50~100mg。
试血及效价测定
家兔的试血通常可由耳缘静脉取血，取血量 0.5ml。 不同稀释度的抗血清和1%的血细胞悬液按 1:1混合，37℃保温2h后观测血细胞的凝聚情 况，即可测得免疫血清的效价。
免疫分析法
一、抗原
1、药物分子的抗原性 大多数的药物分子通常都是半抗原； 一些蛋白类药物、多肽类药物、激素类药物 也是完全抗原。 2、药物分子的抗原特异性 药物分子和蛋白质载体结合后，抗原特异性 可能会发生改变。
一、抗原ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
3、药物分析中，为了得到高效价的抗血清， 通常会与蛋白质载体合成人工抗原进行试验。 常用载体：牛血清白蛋白（BSA）、卵清白 蛋白（OA）、破伤风类毒素（TT）、钥孔蛋 白（KLH）等。
（2）半抗原和载体的选择原则
半抗原：最好含有芳香结构；应考虑抗原抗 体反应的微环境；合理利用分子类似物之间 的交叉反应。 载体：载体对监测系统的影响；载体效应在 免疫过程中的影响。
抗原的免疫原性和反应原性分析
抗原的免疫原性和反应原性分析抗原是指那些能够诱导机体免疫系统产⽣免疫应答，⼜能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内外发⽣特异性反应的物质。
抗原具有两个重要的特征：免疫原性与反应原性。
免疫原性即能够刺激机体即使免疫细胞活化、增殖、分化⽽产⽣特异抗体或致敏淋巴细胞的能⼒。
反应原性是指抗原能与由它刺激所产⽣的抗体或致敏淋巴细胞特异性结合的能⼒，也叫免疫反应性。
我们把同时具有免疫原性和反应原性的物质称为完全抗原，如病原体、微⽣物、异种蛋⽩等；只具有反应原性的物质称为半抗原，多糖、类脂、青霉素、磺胺等。
半抗原没有免疫原性，不会引起免疫反应。
但在某些特殊情况下，如果半抗原和⼤分⼦蛋⽩质结合以后，就获得了免疫原性⽽变成完全抗原，也就可以刺激免疫系统产⽣抗体和效应细胞。
但有些简单半抗原既⽆免疫原性也没有反应原性，但可以阻⽌抗体与相应抗原或者复合半抗原结合。
就⼀般情况⽽⾔，具有免疫原性的物质均具有反应原性。
有许多天然物质可诱导免疫应答，其中⼤分⼦蛋⽩质和多糖具有强免疫原性，⼩分⼦多肽及核酸也具有免疫原性。
⼤分⼦蛋⽩质（M>10000），可含有⼤量不同的抗原决定簇，是最强的免疫原。
如异种⾎清蛋⽩、酶蛋⽩及细菌毒等。
多糖也是重要的天然抗原，纯化多糖或糖蛋⽩、脂蛋⽩以及糖脂蛋⽩等复合物中的糖分⼦部分都具有免疫原性。
并且在⾃然界，许多微⽣物有富含多糖的荚膜或胞壁，细菌内毒素是脂多糖，以及⼀些⾎型抗原也是多糖。
还有就是虽然核酸分⼦多⽆免疫原性，但如与蛋⽩质结合形成为核蛋⽩则有免疫原性。
此外，多肽类激素如胰岛素虽为⼩分⼦量（6000）但也具有免疫原性。
凡具有免疫原性的物质，其分⼦量都较⼤，⼀般在1万以上，⼩于1万者呈弱免疫原性，低于4000者⼀般不具有免疫原性。
许多⼩的免疫性原性分⼦可激发细胞免疫，⽽不产⽣抗体。
亦有⼤分⼦量物质，如明胶分⼦量可达10万，但因其为直链氨基酸结构，易在体内降解为低分⼦物质，所以呈弱免疫原性。
可见免疫原性除与分⼦量有关外，还与其化学结构相关。
免疫放射分析法
免疫放射分析法一、原理免疫放射分析法 (Immunoradiometric assay, IRMA) 是用过量的放射核素标记抗体(*Ab) 和限量的抗原或半抗原(Ag) 结合，形成 Ag*Ab，其放射性和所加 Ag 的量呈正相关。
如以不同量的Ag标准品求出与Ag*Ab放射性的量效关系，即可从待测样品在相同条件下测得的Ag*Ab放射性求出待测样品的量。
[Ag] + [*Ab] [Ag*Ab]抗原过量抗体复合物1.从原理的角度讲，IRMA的主要特点包括以下几方面。
2.属于非竞争性抗原抗体结合反应。
3.抗原抗体复合物的量与所加非标记抗原的量呈正相关。
4.因为不存在竞争结合反应，低剂量区没有不确定因素，因此灵敏度较高。
5.分离步骤的主要目的是把 *Ab和Ag*Ab分开。
由于 *Ab和Ag*Ab都含球蛋白，分子量也比较接近，很多在RIA中常用的分离方法都不能用，需要用特异抗体作分离剂。
这在很大程度上造成了IRMA在方法学上的特殊性，即几乎全部是夹心法，也就是一个IRMA系统中需要两个抗体，都是针对同一个抗原的，但是抗原决定簇不同，一个抗体标记后作为探测抗体，一个抗体用作分离剂。
正是这一特点，使IRMA的测定对象主要限于有两个以上抗原决定簇的肽类或蛋白质。
6.由于Ag越小Ag*Ab放射性越低，所以在IRMA中NSB的高低对低剂量Ag测量的准确性影响大，如何降低NSB对灵敏度很重要。
二、试剂盒基本试剂试剂盒的基本要求和RIA试剂盒相同，由国家批准的生产单位提供，使用者应按说明书的要求合理使用。
如果临床工作需要，使用者可以对试剂稀释度、操作步骤等进行适当改动，但对改变了的方案应作精密度、准确度、灵敏度等考核，并作详细记录。
一般试剂盒都包括三种主要试剂：标记抗体、非标记标准抗原 (标准品)、分离试剂或材料，很多试剂盒还提供缓冲液及质量控制用的样品。
7.标记抗体标记抗体必须亲和力高、特异性高。
通常都由生产厂家精选后用125I标记，可以是多克隆(polyclonal)，也可以是单克隆(monoclonal)抗体。
抗原(4)分析解析
2020/3/23
功能性抗原决定基
位于分子表面的表位易被BCR或抗体结合，称功能性 抗原决定基，其中有个别化学基团起关键作用，称免疫 优势基团。位于分子内部的不能与 BCR或抗体结合的表 位，称隐蔽性抗原决定基，它可因理化因素而暴露在分 子表面成为功能性表位，或因蛋白酶解或修饰（如磷酸
2. 异种抗原(xenogenic antigen) 指来自不同种属的抗原。
3．同种异型抗原（allogenic antigen） 指同一种属不同个 体所具有的特异性抗原。①红细胞血型抗原，包括ABO、 Rh等40余个抗原系统；②人类主要组织相容性抗原，即 人白细胞抗原（HLA）（详见后）。
4．自身抗原(autoantigen) 正常情况下，机体免疫系统对 自身正常组织或细胞处于耐受状态。在某些病理情况下 自身抗原成分可诱导机体产生自身免疫应答。
共同特点：多由蛋白质组成，分子量大，表面决定基种
类多，但每一种决定基的数量不多且分布不均匀。
免疫应答特点：①既引起体液免疫，也引起细胞免疫；
②产生抗体以IgG为主，也可产生其他类型抗体；③可产 生免疫记忆。
2020/3/23
2.非胸腺依赖抗原(thymus independent antigen, TI -Ag) TI抗原亦称T细胞非依赖性抗原， 其刺激
完全抗原与抗原比较
特性
完全抗原
半抗原
免疫原性
+
-
反应原性
+
+
2020/3/23
2020/3/23
•
在某些情况下，抗原可诱导机体产生
免疫耐受，其抗原称耐受原；抗原也可引
起变态反应，称变应原（al1ergen）。
免疫分析
抗原的量
31
8.2 免疫分析中的分离方法
如何建立一个免疫分析方法，质量作用定律是其基础。它 要求： (1) 抗原是单一的化学物质。事实上，一个标记的抗原与 其未标记的抗原就往往有所不同； (2)抗体也应是均一的； (3)抗原和抗体均应是单价的；在一般情况下是做不到的 (4) 抗原与抗体间的反应要达到平衡状态，其微观上是可 逆的； (5) 结合相或游离相的测定必须准确，而且不受分离不完 全或非特异性吸附的影响。 上述条件一般很难都满足
35
固相免疫分离
将抗体固定在固相载体上，使特异性分析对象被抗体吸附 后得到与其他干扰物质分离。
常用固相载体
36
抗原、抗体的固相化 不论是抗原还是抗体均可固相化．并且均已被用于非均相免 疫分析。固相化方法很多，包括简单的非共价吸附和共价偶 联方式。吸附法基于塑料表面对蛋白质的吸附性能。这种方 法的缺点是缺乏重现性。共价偶联才是可靠的固定连接方法。
14
8.1.2 抗体 抗体是一类统称为免疫球蛋白(Immunoglobulin， 简写为 Ig) 的蛋白质。是机体免疫力的一类重要物
质基础，也是医学中用于疾病诊断、治疗、预防和
研究发病机理的极为重要的试剂及制剂。抗体的性
能对免疫分析是至关重要的。
15
IgG 分子的基本结构
16 Porter，1962
38
8.3 酶免疫分析
酶免疫分析(enzyme immunoassay, EIA )代表了这样一类免疫 分析方法，它利用酶催化底物的反应以产生有色的、发光的或 荧光的产物而被检测。是当前应用最广泛的免疫检测方法。 EIA 法 包 括 酶 联 免 疫 吸 附 分 析 法 (Enzyme-Linked
32
临床免疫学检验(名解及答题)
临床免疫学检验【名词解释】1、enzyme immunoassay（EIA）酶免疫分析技术，是以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将酶高效催化反应的专一性和抗原抗体反应的特异性相结合的一种免疫标记检测技术。
2、colloidal gold immunoassay胶体金免疫技术，是以胶体金作为示踪标记物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种标记免疫测定技术。
3、immunoblot test（IBT）免疫印迹试验，是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的技术。
4、precipitation reaction沉淀反应，指可溶性抗原与相应抗体在适当的条件下发生特异性结合而出现可见的沉淀现象。
5、agglutination reaction凝集反应，指细菌和红细胞等颗粒性抗原或表面包被可溶性抗原（或抗体）的颗粒性载体与相应抗体（或抗原）特异性结合后，在适当电解质存在下，出现肉眼可见的凝集现象。
6、immunogen免疫原，指能诱导机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。
7、adjuvant （immunoadjuvant）佐剂（免疫佐剂），指预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质。
8、hapten半抗原，指仅有抗原性而无免疫原性的物质。
如多糖、多肽、类脂和核酸等物质。
9、monoclonal antibody（McAb）单克隆抗体，设法将单个B细胞分离出来加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生出针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，称为单克隆抗体。
10、Polyclonal antibody（PcAb）多克隆抗体，亦称免疫血清，用抗原以不同途径免疫动物，从动物血清中获取抗体，该类含有抗体的血清称为抗血清。
由于免疫动物的抗原往往具有多种抗原表位，可激活体内多个B细胞克隆产生针对抗原多种表位的混合抗体，因而抗血清也称为多克隆抗体。
11、tumor antigen肿瘤抗原，指细胞癌变过程中新出现的或异常表达的抗原物质。
体内药物分析：免疫分析法
④琥珀酸酐法 该法是利用琥珀酸酐在无水吡 啶中与半抗原分子中的羟基反应，首先生成带 有羧基的半抗原琥珀酸衍生物，然后再与蛋白 质的氨基结合，形成肽键。
⑤重氮化的对氨基苯甲酸法 该法是利用重氮 化的对氨基苯甲酸（重氮化合物）先与带酚羟 基的半抗原反应，生成带有羧基的半抗原，然 后再与蛋白质结合
3. 人工抗原的鉴定
三种试剂的作用分别是： 1. 抗体是作为标记药物和非标记药物竞争结合 的蛋白； 2. 标记药物提供可检测的信号（响应值）； 3. 非标记药物在标准曲线制备时是药物标准品， 在样品中则为被测药物。它用于建立被测药物 量（浓度）与响应值之间的函数关系，是样品 中药物浓度计算的依据。
Ag Ab K1 Ag Ab
从图中可见，抗血清A的滴度及它和标记抗 原的亲和力较小，质量最差；B的滴度虽高， 但亲和力不够高；C质量最佳，选其结合率 50%稀释度，建立放射免疫分析方法最适宜。
（2）活度（Avidity）
活度是指抗体与相应抗原的亲和力 （Affinity)。它可反映出抗原与抗体结合的牢 固程度。活度高，表明形成抗原-抗体结合物的 速度快而解离小。抗体活度高低与免疫分析方 法的灵敏度密切相关，它主要表现在剂量反应 曲线的斜率上，斜率越陡，表明活度越高，测 定效果越好。
4. 标准抗原（Standard antigen）
标准抗原是指在免疫测定中用来 制作标准曲线或制备标记抗原用的药 物标准品。标准抗原是免疫分析法的 定量依据。
（二）特异抗体的制备及鉴定
1. 特异抗体（Specific Antibody）
特异抗体是指抗原（免疫原）作用于机体 产生免疫反应，在血清中产生的能与该抗原特 异性结合的免疫球蛋白。抗体具有高度的特异 性，一般只能与相应的抗原起专一的反应。在 免疫球蛋白中，免疫球蛋白G（IgG）含量最高 （约占70％），是免疫分析中最常用的抗体。
免疫学练习题库含答案
免疫学练习题库含答案一、单选题（共59题，每题1分，共59分）1.关于CTL细胞杀伤靶细胞的描述，正确的是（）A、无抗原特异性B、受MHC-Ⅱ类分子限制C、通过分泌IL-10杀伤靶细胞D、杀伤靶细胞受MHC-Ⅰ类分子限制正确答案：D2.B淋巴细胞不具有的表面分子是（）A、mIgMB、mIgDC、CD28D、CD40正确答案：C3.不属于内热性致热源的细胞因子是（）A、TNF-αB、IFN-αC、IL-6D、IL-1正确答案：B4.一般认为分子量在多少以上才具有免疫原性（）A、1kDB、5kDC、10kDD、50kD正确答案：C5.IgM是()聚体。
A、3B、5C、10D、2正确答案：D6.半抗原（）A、无免疫原性，有反应原性B、有免疫原性C、有免疫原性和反应原性D、无免疫原性，无反应原性正确答案：A7.人工主动免疫是用（)接种机体使之产生特异性免疫的方法A、疫苗B、细胞因子C、抗体D、高免血清正确答案：A8.关于干扰素的作用，下列哪项是正确的（)A、由感染机体的病毒合成B、具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用C、由活化的T细胞产生D、以三聚体存在正确答案：B9.可以通过经典途径激活补体的抗体是（）A、IgG、IgAB、IgG、IgMC、IgD、IgED、IgA、IgM正确答案：B10.Th细胞TCR能识别（）A、天然蛋白质抗原决定簇B、抗原肽-MHCII类分子复合物C、外源性抗原D、抗原肽-MHCI类分子复合物正确答案：B11.介导特异性免疫的细胞因子中，起负调解作用的是（）A、IFNB、TNFC、IL-1D、TGF-β正确答案：D12.下列哪项不是MHC基因编码的产物（）A、MHCI类分子α链B、BMHCⅡ类分子α链C、MHCI类分子β链D、MHCⅡ类分子β链正确答案：C13.哪些细胞间相互作用受MHCⅡ类分子限制（)A、NK细胞杀伤肿瘤细胞B、APC呈递抗原给Th细胞C、Mφ吞噬靶细胞D、B淋巴细胞识别外来抗原正确答案：B14.活化的Th细胞活化B细胞时，B细胞表面主要产生第二信号的分子是（）A、CD28B、CD40C、CD40LD、B7正确答案：B15.初次体液免疫应答产生的抗体主要是（）A、IgGB、IgAC、IgED、IgM正确答案：D16.再次应答时，Th活化所需的第一信号是如何产生的（）A、Th的TCR识别巨噬细胞表面的抗原肽-MHCII类分子B、Th的TCR识别Bm细胞表面的抗原肽-MHCII类分子C、Th的TCR识别巨噬细胞表面的抗原肽–MHCI类分子D、Th的TCR识别Bm细胞表面的抗原肽-mIg正确答案：C17.下列哪种免疫分子的作用具有特异性?（）A、AbB、IL-1C、TNFD、IFN正确答案：A18.下列细胞同时表达CD3和CD4分子的是（）A、NK细胞B、Th细胞C、B淋巴细胞D、巨噬细胞正确答案：B19.无抗体参与的作用是()A、ADCCB、调理作用C、中和作用D、T细胞成熟正确答案：D20.T细胞活化时，只有第一信号，缺乏第二信号，其结果是（）A、T淋巴细胞立即死亡B、T淋巴细胞处于克隆无应答状态C、导致T淋巴细胞分裂D、导致T淋巴细胞克隆扩增正确答案：B21.促进造血干细胞增殖分化的细胞因子是（）A、ILB、TNFC、IFND、CSF正确答案：D22.关于MHC限制性的叙述，下列哪项是正确的（）A、是指TCR在识别抗原肽的同时必须识别自身MHC分子B、APC-Th细胞间相互作用受MHCI类分子限制C、APC-Tc细胞间相互作用受MHCⅡ类分子限制D、T淋巴细胞在胸腺内经过阴性选择获得MHC限制性正确答案：A23.初次免疫应答的特点是（）A、抗原呈递细胞是BmB、抗体产生慢，维持时间短C、抗体滴度较高D、所需抗原浓度低正确答案：B24.下列哪项不属于MHC分子的结构（）A、肽结合区B、跨膜区C、铰链区D、胞浆区正确答案：C25.B淋巴细胞作为抗原呈递细胞，其表面主要产生第二信号的分子是（）A、CD28B、CD40C、CD40LD、B7正确答案：D26.免疫中免疫防御功能低下或失调时，会引起（）A、反复感染B、过敏反应C、自身免疫疾病D、肿瘤正确答案：A27.不参与特异性免疫应答的细胞是（）A、T细胞B、B细胞C、APCD、粘膜上皮细胞正确答案：D28.再次体液免疫应答产生的抗体主要是（）A、IgGB、IgAC、IgED、IgME、IgD正确答案：A29.TCR的双识别是指（）A、同时识别MHCI类分子和MHCII类分子B、同时识别抗原分子的T淋巴细胞决定簇和B淋巴细胞决定簇C、同时识别抗原肽和SmIg的复合物D、同时识别抗原肽和MHCI/II类分子正确答案：D30.抗体分子上一个抗原结合部位与相应抗原决定簇之间的结合强度被称为（）A、亲和力B、聚合力C、杀伤力D、吸引力正确答案：A31.T淋巴细胞活化所需的第一信号，由下列哪种分子传入细胞内（）A、CD2B、CD3C、CD4D、Ig、Ig正确答案：B32.TI-Ag得名，是因为（）A、抗原在胸腺中产生B、相应抗体在胸腺中产生C、刺激产生抗体时不需Th细胞辅助D、该抗原不产生体液免疫正确答案：C33.禽类特有的中枢免疫器官是（）A、脾脏B、淋巴结C、腔上囊D、胸腺正确答案：C34.下列哪类细胞不能分泌细胞因子（）A、单核细胞B、浆细胞C、T淋巴细胞D、成纤维细胞正确答案：B35.影响抗原抗体反应的因素有（）A、电解质、pH值和温度、抗原抗体比例B、温度、电解质和反应体积、抗原抗体比例C、电解质、pH值和反应体积、温度D、温度、pH值和反应体积、抗原抗体比例正确答案：A36.免疫球蛋白分为五类，其分类依据是（）A、VH抗原性的不同B、CH抗原性的不同C、VL抗原性的不同D、CL抗原性的不同正确答案：B37.临床上药物过敏性休克，以哪一种药物最常见（）A、链霉素B、先锋霉素C、维生素BlD、青霉素正确答案：D38.免疫系统的组成是（）A、虎克B、贝林C、琴纳D、巴斯德正确答案：D39.抗体介导的超敏反应有（）A、Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型超敏反应B、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型超敏反应C、Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型超敏反应D、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型超敏反应正确答案：D40.NK细胞通过ADCC作用杀伤靶细胞需要（）参与A、细胞因子B、巨噬细胞C、抗体D、补体正确答案：C41.不属于减毒活疫苗特点的是（）A、可诱导体液免疫B、可在体内生长繁殖C、不能诱导局部免疫D、可诱导细胞免疫正确答案：C42.能抵抗蛋白酶水解的Ig是（）A、IgGB、SIgAC、IgMD、IgE正确答案：B43.与蛋白质载体结合后才具有免疫原性的物质是（）A、完全抗原B、TD抗原C、半抗原D、TI抗原正确答案：C44.活化的T淋巴细胞表达哪类MHC分子（）A、只表达MHCⅡ类分子B、只表达MHCI类分子C、同时表达MHCⅠⅡ类分子D、同时表达MHCⅠⅢ类分子正确答案：C45.B淋巴细胞的协同刺激分子是（)A、CD2B、CD40C、CRD、mIg正确答案：B46.免疫相关分子补体、细胞因子属于（）A、分泌型分子B、膜表面分子正确答案：A47.抗原的特异性取决于（）A、表位B、化学组成C、化学结构的复杂性D、分子量的大小正确答案：A48.T细胞在胸腺发育过程中，通过阳性选择获得了（)A、MHC限制性B、自身耐受C、TCR表达D、TCR基因重排正确答案：A49.胸腺中胸腺细胞CD4和CD8表面标记基本变化规律是（）A、单阳性--双阳性--双阴性B、单阳性--双阴性--双阳性C、双阴性--双阳性--单阳性D、双阴性--单阳性--双阳性正确答案：C50.T细胞的特征性表面标记为（）A、CD19B、CD2C、CD3D、CD4正确答案：C51.抗体与抗原结合的部位是（）A、VHB、CHC、CH/CLD、VH/VL正确答案：D52.Ⅲ型超敏反应性炎症以哪种细胞浸润为主（）A、中性粒细胞B、单核细胞C、嗜酸性粒细胞D、肥大细胞正确答案：A53.通过分泌TGF-β对特异性免疫应答发挥负调节的T细胞是（）A、Th1B、Th2C、Th3D、CTL正确答案：C54.下列哪种试验不能用于可溶性抗原的检测?（）A、反向间接凝集试验B、间接凝集抑制试验C、直接凝集试验D、间接凝集试验正确答案：C55.在即刻非特异性免疫应答阶段发挥作用的细胞是（）A、NK细胞B、T细胞C、B细胞D、皮肤粘膜上皮细胞及吞噬细胞正确答案：D56.长期使用免疫抑制剂的不良后果是（）A、易出现感染和肿瘤B、易出现自身免疫病C、易出现感染和自身免疫病D、易出现变态反应正确答案：A57.未成熟B淋巴细胞表达的膜表面免疫球蛋白是（）B、mIgMC、mIgED、mIgD正确答案：B58.外源性抗原是指（）A、来源于细胞外的抗原B、来源于体外的抗原C、由细胞合成的抗原D、细胞合成后分泌出的抗原正确答案：A59.Ⅱ型超敏反应的发生机制之一是（）A、Mφ直接吞噬靶细胞B、CTL特异性杀伤靶细胞C、补体依赖的细胞毒作用D、中性粒细胞释放溶酶体酶正确答案：C二、多选题（共15题，每题1分，共15分）1.下列属于分泌型免疫分子的是（）A、AbB、CKC、补体D、MHC分子正确答案：ABC2.吞噬细胞的主要生物学功能有（）A、吞噬杀伤和清除作用B、分泌细胞因子和其他炎性介质C、加工处理提呈抗原D、产生抗体正确答案：ABC3.细胞因子包括（）A、ILB、IFNC、TNF正确答案：ABC4.专职抗原提呈细胞包括（）A、巨噬细胞B、树突状细胞C、B细胞D、NK细胞正确答案：ABC5.下列分子中属于B细胞的表面膜分子的是()A、CD40B、BCRC、CD4D、CD8正确答案：AB6.能非特异性杀伤靶细胞的细胞有（）A、CTLB、NK细胞C、B淋巴细胞D、巨噬细胞正确答案：BD7.类毒素()A、有毒性B、无毒性C、无免疫原性D、有免疫原性正确答案：BD8.关于序列决定簇，哪项是正确的()A、由BCR识别B、由TCR识别C、位于抗原分子内部D、需经APC加工处理正确答案：BCD9.血清学反应的一般规律包括（）A、反应的二阶段性B、适当的比例C、高度的特异性D、结合的可逆性正确答案：ABCD10.MHCⅡ类分子表达在哪些细胞表面?（）A、CTLB、B淋巴细胞C、巨噬细胞D、树突状细胞正确答案：BCD11.完全抗原()A、无免疫原性B、无反应原性C、有免疫原性D、有反应原性正确答案：CD12.影响血清学反应的类型包括（）A、中和试验B、沉淀反应C、免疫标记技术D、凝集反应正确答案：ABCD13.关于TD-Ag，叙述正确的是()A、诱导体液免疫和细胞免疫B、主要产生IgG，此外还可产生IgM、IgA等C、可产生记忆性B细胞（免疫记忆）D、主要产生IgM正确答案：ABC14.抗原必须具备的基本特性是()A、异源性B、反应原性C、分子量大，化学结构复杂D、免疫原性正确答案：BD15.哺乳类动物的中枢免疫器官是（）A、骨髓B、腔上囊C、胸腺D、脾脏正确答案：AC三、判断题（共44题，每题1分，共44分）1.佐剂可增强机体对抗原的免疫应答能力()A、正确B、错误正确答案：A2.中和反应可用于病毒种型鉴定、病毒抗原分析、中和抗体效价测定等()A、正确B、错误正确答案：A3.T淋巴细胞通过阴性选择获得自身免疫耐受（）A、正确B、错误正确答案：A4.CK具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、刺激造血细胞增殖与分化、促进各种细胞的生长于分化等生物学功能（）A、正确B、错误正确答案：A5.分子量最大的Ig是IgM（）A、正确B、错误正确答案：A6.TNF为具有抗病毒作用的细胞因子（）A、正确B、错误正确答案：B7.CD8分子与MHCI类分子结合（）A、正确B、错误正确答案：A8.T细胞的成熟无抗体参与()A、正确B、错误正确答案：A9.MHC限制性是指B细胞在识别抗原的同时识别MHC分子（）A、正确B、错误正确答案：B10.先天性免疫是种系发育和进化过程中形成的一种天然防御功能（）A、正确B、错误正确答案：A11.迟发型(Ⅳ型)变态反应是以单核细胞、淋巴细胞浸润为主的炎症()A、正确B、错误正确答案：A12.TI抗原能诱导体液及细胞免疫应答()A、正确B、错误正确答案：B13.试管凝集试验常用已知抗原检测待检血清中是否存在相应抗体或抗体的效价()A、正确B、错误正确答案：A14.补体系统各成分中，在血清中含量最高的是C3（）A、正确B、错误正确答案：A15.青霉素可引起多种类型的超敏反应，其具有很好的免疫原性()A、正确B、错误16.血清中含量最高的Ig是IgG（）A、正确B、错误正确答案：A17.通常说的T细胞主要是指γδT细胞，参与细胞免疫，辅助体液免疫（）A、正确B、错误正确答案：B18.内源性抗原结合部分是MHCI类分子α1、α2功能区（）A、正确B、错误正确答案：A19.半抗原具有免疫原性，且能诱导机体产生记忆细胞（）A、正确B、错误正确答案：B20.禽类B细胞分化成熟的场所是法氏囊（）A、正确B、错误正确答案：A21.具有调理作用的是抗体和补体（）A、正确B、错误正确答案：A22.能呈递外源性蛋白质抗原的细胞是表达MHCI类分子的细胞（）A、正确B、错误正确答案：B23.一个T细胞表面的所有TCR完全相同，故一个T细胞只能与一种抗原肽反应（）A、正确B、错误24.M-CSF促进巨噬细胞增殖、分化，增强其吞噬功能（）A、正确B、错误正确答案：A25.CD4分子识别的部位是MHCⅡ类分子β2功能区（）A、正确B、错误正确答案：A26.存在于成熟B细胞膜上的免疫球蛋白是mIgM、mIgD（）A、正确B、错误正确答案：A27.MHC分子是由MHC编码的，根据其结构和生物学功能，将MHC分为Ⅰ类、Ⅱ类分子和III类分子（）A、正确B、错误正确答案：A28.只有抗原与抗体呈适当比例时，才可出现可见的结合反应()A、正确B、错误正确答案：A29.细胞因子的种类包括IL、IFN、TNF、TGF-β、趋化因子等（）A、正确B、错误正确答案：A30.唯一能通过人类胎盘的Ig是IgG()A、正确B、错误正确答案：A31.MHCⅠ类分子肽结合槽可容纳15个氨基酸残基（）A、正确B、错误正确答案：B32.参与非特异性免疫的效应分子有干扰素、抗体、溶菌酶和补体等（）A、正确B、错误正确答案：B33.TD抗原不但能引起体液免疫应答和细胞免疫应答，而且能产生免疫记忆（）A、正确B、错误正确答案：A34.疫苗目前仅可用于预防传染病（）A、正确B、错误正确答案：B35.经加工处理后的外源性抗原被CD8+T细胞识别（）A、正确B、错误正确答案：B36.MHCII类分子2条多肽链均由MHC基因编码（）A、正确B、错误正确答案：A37.Th1可通过活化巨噬细胞及释放多种活性因子而对病原体加以清除（）A、正确B、错误正确答案：A38.MHC分子被TCR识别的部位在肽结合区（）A、正确B、错误正确答案：A39.引起Ⅲ型超敏反应的是中等大小的免疫复合物()A、正确B、错误正确答案：A40.能呈递外源性蛋白质抗原的细胞是表达MHCII类分子的细胞（）A、正确B、错误正确答案：A41.IL、G-CSF、TNF和CR均属于细胞因子（）A、正确B、错误正确答案：B42.MHCI类分子的2条多肽链均由MHC基因编码（）A、正确B、错误正确答案：B43.IgE抗体通过Fc段结合到肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的Fc受体上()A、正确B、错误正确答案：A44.外毒素和抗毒素可进行中和试验，方法与病毒中和试验基本相同()A、正确B、错误正确答案：A。
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（2）分两型： 根据轻链氨基酸组成、序列及结构的差异，可将轻 链分为两型：κ和λ型
每一Ig单体分子两条重链必须同类，两条轻链必须 同型。
抗体的制备方法
3.基因工程抗体(GeAb):
第三代抗体
由基因重组技术制备的抗体,称为基因工程抗 体。 嵌合抗体 (chimeric Ab) 人源抗体（humanized Ab) 双特异性抗体（bispecific Ab) Fab/ScFV（single chain
2、最常用的标记酶
1．辣根过氧化物酶(HRP):约有50％的EIA使用此酶。 2．碱性磷酸酯酶(AP):AP标记的结合物性质稳定，其 活性可用分光光度计或荧光计测量。 3．6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD): 通常用于均相EIA。 4．β-半乳糖苷酶(β-Gal): 适用于均相EIA和非均相 EIA。 5．苹果酸脱氢酶(MDH): 多用于尿样的均相EIA。
FV fragment) 单域抗体（single chain Ab)
抗体的结构与功能的关系，
所展现出的生物学功能是其结构的 完美表演者。
免疫分析技术
内容
分析方法分类 几种常用免疫分析技术
ELISA 侧流免疫层析
分析方法的建立 分析数据的拟合
常用的免疫标记物质
类别
标记物
荧光素
FITC、RB200、TRITC
linked 2021/4/19 immunosorbent immunoassay)
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ELISA简介
（一） ELISA技术的原理
间接法 夹心法 竞争法
夹心法 Sandwich
竞争法
（二） ELISA所用试剂材料
1、固相 2、酶 3、底物 4、缓冲液 5、仪器
1、固定相
聚次亚乙烯
镧系元素螯合物
放射性核素 3H、14C、32P、57Gr
125I、131I
酶
HRP、AP
化学发光物 Luminol、lucigenin 金属颗粒 胶体金、铁蛋白
用途 免疫组化 免疫分析测定 免疫分析测定
免疫组化 免疫分析测定 免疫分析测定 免疫组化 免疫分析测定
一、标记免疫方法分类
1．按标记物的种类分
农药、兽药、生物毒素、重金属、维生素、防 腐剂、植物激素等半抗原
在食品安全、植物学、环境检测 等领域，主要是半抗原类物质。
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抗体
antibody,Ab
抗原与抗体是天生的一对，谁也离不了谁； 两者既是好朋友，又是一对冤家。
一、基本概念
1. 抗体（Antibody，Ab）
指B淋巴细胞受抗原刺激后活化、增殖、分 化成为浆细胞，产生的能与相应抗原发生特异 性结合的免疫球蛋白。
4
(二)完全抗原与半抗原
1.完全抗原（complex antigen): 既具免疫原性又有免疫反应性的物质. 如:大多数蛋白质.
2.半抗原(hapten): 仅有免疫反应性而无免疫原性的物质. 如:大多数多糖、类脂、某些药物. 半抗原+载体(蛋白质) 完全抗原
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6
共同抗原与交叉反应
共同抗原与交叉反应
存在形式： 膜型（membrane immunoglobulin, mIg）
— B细胞膜上的抗原受体； 分泌型(secreted immunoglobulin, sIg)
— 分泌进入体液, 介导体液免疫应答。
二、免疫球蛋白的分子结构
（一）免疫球蛋白的基本结构：
由四条多肽链组成，呈“Y”或“T”型 1.组成： 2条长链，又称重链（Heavy chain，H链）：
Step 2: characterization of conjugate
Step 3: chessboard tiatrion and calibration curve
Step 4: optimization— nonessential
例1、标记抗原浓度对检测的影响
43
例，pH影响
Step 5: sample analysis
(1)放射免疫分析
(radioimmunoassay，RIA)
(2)酶免疫分析
(enzyme immunoassay，EIA)
(3)化学发光酶免疫分析
(chemiluminescent enzyme immunoassay，CIZIA)
(4)荧光免疫分析法
(fluorescence immunoassay，FIA)
1.共同抗原(Common antigens)： 存在于两种不同的抗原之间的相同或相似的抗 原决定簇，称为共同抗原。
2.交叉反应(Cross-reaction)： 由于存在共同抗原造成抗体对具有相同或相似 决定簇的不同抗原发生反应，此称为交叉反应。 检测意义：假阳性（避免） 多残留检测（利用）
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Step 6: validation
一个难点：基质效应
基质效应
基质：样品中除了目标分析物外还含有其他的 物质，这些物质可能会对检测结果造成干扰， 这些干扰成分称为基质，其干扰称为基质效应 (matrix effect)
（1）基质来源
水、土壤的腐殖质 食品中的蛋白、脂肪等 溶液中作为促溶的有机溶剂等
例1：环境水样的基质效应
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（2）基质干扰的消除
掩蔽剂（缓冲液调整） 样品稀释 样品前处理：净化
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2021/4/19
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3、最常用的底物
邻苯二酚(OPC) 四甲基联苯胺(TMB)
4、缓冲液
PBS(T) Tris-HCl
Na3N是HRP（辣根过氧化物酶）的抑制剂
4、仪器 酶标仪
酶标仪
（三） 免疫分析方法建立 ——苏丹红为例
Step 1: Hapten and conjugate
半抗原免疫分抗原 抗体
二、免疫分析方法
分类 ELISA原理与方法 方法建立-苏丹红为例
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抗原 antigen,Ag
3
(一)抗原的概念
抗原(Antigen,Ag) 是一类能刺激机体免疫系 统产生特异性免疫应答,并能与相应的免疫应答 产物在体内或体外发生特异性结合的物质.
。。。。。 2021/4/19
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2．按是否加入分离剂分
(1)均相免疫分析(homogeneous lmmunoassay)
在某些免疫分析中，当抗原一抗体反应达到平衡后，反应液中 结合的标记药物与游离的标记药物之中有一种不产生信号或信 号消失，因此无需将反应液分作两相，即可在均相溶液中进行 测定，故称为均相免疫分析。如酶放大免疫测定技术(enzyme multiplied immunoassay technique，EMIT) 。
(2)非均相免疫分析(heterogeneous immunoassay)
在某些免疫分析中，当抗原一抗体反应达到平衡后，只有在
反应液中加入分离剂，将游离标记药物和结合标记药物分开之
后，才能测出各自部分的标记药物浓度。否则，测定的是两者
的总浓度。由于这种信号的测定需将反应液分成液-固两相后，
才能分别测定，故称为非均相免疫分析。如ELISA(Enzyme
含450-550aa，分子量为55-75KD。
2条短链，又称轻链（Light chain，L链）： 含214aa，分子量为25KD。
2.分类、分型：
（1）根据重链氨基酸组成、序列及结构的差异，将Ig 分为五类：
IgM (µ) 、IgG(γ)、IgA(α)、IgD(δ)、 IgE(ε) 亚类：IgG：IgG1, IgG2, IgG3, IgG4