白血病分子生物学分型
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临床上，具有PLZF-RARα或STAT5b-RARα融 合基因患者对ATRA治疗不敏感，其余三种染 色体易位患者经ATRA治疗可获完全缓解
PML-RARα
APL累及的RARα基因及其伙伴基因结构示意图
PML-RARα
由于PML基因断裂点不同产生3种不同的 PML-RARα异构体
约55%的M3患者为L型，40%为S型， 5%为V型，且每位患者只表达一种PMLRARα融合蛋白
该系统可以根据标准品的CT值和拷贝数自动绘 制标准曲线，并计算未知样品中的目的基因拷 贝数。
白血病的分子检测——定量PCR
RQ-PCR方法优点： 灵敏而特异 起点定量 闭管化学（污染的风险低） 没有PCR后处理（无需走胶，拍照等） 高度自动化 定性：单数据点测定 定量：多数据点测定 能做基因分型及SNP鉴定
抑癌基因(tumor suppressor genes)：指一类基因，
其产物对细胞生长增殖起负调控的作用，并能潜在抑 制细胞的恶变。
白血病的分子机制
白血病的分子机制
增殖过度 分化阻断 凋亡受抑
Leabharlann Baidu
“二次打击”学说
D.Gary Gilliland Best Practice & Research Clinical Haematology.2003;16:409-417
PCR方法优点 快速 灵敏 特异
PCR方法缺点 假阳性 假阴性
白血病的分子检测
PCR：仅适用于染色体断裂点丛集于相对小
的范围内（<2kb），如T-ALL中SIL-TAL1。
RT-PCR：可用于染色体断裂点跨越很大的
区域的融合基因。
巢式RT-PCR：可显著提高反应的特异性，
增加扩增效率。
RQ-PCR：可定量扩增产物。 多重PCR：同管扩增多个目的片段。
白血病的分子检测——定量PCR
RQ-PCR（Real-time Quantitative PCR） 荧光标记扩增产物 荧光标记引物 特异性荧光标记探针 TaqMan探针、分子信标、杂交双探针 荧光染料直接结合扩增产物 SYBR Green I与DNA双链结合 动态监测荧光信号变化
TaqMan探针法
白血病的分子检测——定量PCR
RQ-PCR的检测系统： 该系统内置了96孔PCR仪，且在每个反应孔上
均有一个监测探头用于检测PCR反应管中的荧 光强度。平均每8-12秒就检测一次，以达到实 时检测的目的。
系统中的电脑系统同时不断地分析来自检测系 统的信息，不断计算每个反应管中的荧光强度， 并最终得到CT值。
白血病的分子检测
Southern blot Northern blot Western blot FISH PCR 测序 芯片
白血病的分子检测
PCR反应原理
白血病的分子检测
PCR理论方程
N = N0 x (1+E)n
N：扩增子数量 N0：起始模板数量
E：扩增效率 n：循环数
白血病的分子检测
RQ-PCR的操作流程
从细胞或组织中抽提DNA或RNA 用PCR或RT-PCR扩增特异片段 将PCR产物克隆到合适的载体上 体外转录成RNA片段（仅用于RNA样品） 纯化，定量和系列稀释质粒DNA或RNA 构建标准曲线（CT υ lgcopy）
样品的定量检测 校正样品基因拷贝数
白血病分子检测的临床应用
20~40%，在M2b中阳性率为90% 少见于M4和M1，极少见于MDS和骨髓增生综
合症
AML1-ETO+白血病细胞有一定程度的分化能 力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性 粒细胞，且对化疗反应较敏感
AML1-ETO+患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果 好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后 较其他AML亚型（M3除外）好
形态学上S型白血病细胞常为低分化的并 且这些患者可见继发细胞遗传学异常，V 型APL患者的白血病细胞体外对ATRA 的敏感度低
L+ 阴性 S+
PML-RARα
RT-PCR检测PML-RARα是敏感且特异的 APL诊断方法，还能用于治疗后MRD监 测。PML-RARα阳性提示的分子复发常 早于临床复发3-6个月，为临床采取进一 步治疗措施提供了保障
PML-RARα
t(15;17)(q22;q21)
98%M3患者 继t(15;17)之后，又先后发现4种M3特异的累及
RARα的变异性染色体易位：t(11;17)(q23;q21)， t(5;17)(q35;q21)，t(11;17)(q13;q21)以及 dup(17)(q21.3;q23)，分别产生PLZF-RARα， NPM-RARα，NuMA-RARα和STAT5b-RARα融 合基因
白血病的分子生物学检查对白血病诊断分 型及预后判断有以下几方面意义： 补充MIC检查的不足 发现新的亚型 监测白血病的微小残留病灶（MRD） 为研究白血病的发病机制打下基础
PCR方法检测MRD常用的分子标志
AML1-ETO
t(8;21)(q22;q22) 6~8%原发性AML，在M2中的阳性率为
白血病分子生物学
白血病的分子机制 白血病的分子检测 白血病分子检测的临床应用
白血病的分子机制
基因(gene)：合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所
必需的全部核酸序列。
癌基因(oncogene)：细胞或病毒中存在的，能诱导
正常细胞转化并使之获得新生物特征的基因。
癌基因活化的方式：
点突变 染色体重排 基因扩增
AML1- 阴性 ETO+
AML1-ETO
对初发患者进行t(8;21)和AML1-ETO融 合基因的检测对其预后判断及治疗方案 的制定相当重要
AML1-ETO定性结果不能用于评价患者 MRD情况
RQ-PCR能实时反映体内AML1-ETO水 平。连续定量AML1-ETO转录本水平可 判定有高复发风险的患者，以便及早治 疗干预以防血液学复发
•特异性高 •多重基因定量 •成本较高
SYBR Green I 法
•成本低 •最适合初步筛查 •熔解曲线功能 •无法多重检测 •无模板特异性 •灵敏度低
白血病的分子检测——定量PCR
白血病的分子检测——定量PCR
CT值：荧光信号有统计学意义显著增长 （穿过阈值线）时的循环次数
CT值与起始模板量成反比
PML-RARα
APL累及的RARα基因及其伙伴基因结构示意图
PML-RARα
由于PML基因断裂点不同产生3种不同的 PML-RARα异构体
约55%的M3患者为L型，40%为S型， 5%为V型，且每位患者只表达一种PMLRARα融合蛋白
该系统可以根据标准品的CT值和拷贝数自动绘 制标准曲线，并计算未知样品中的目的基因拷 贝数。
白血病的分子检测——定量PCR
RQ-PCR方法优点： 灵敏而特异 起点定量 闭管化学（污染的风险低） 没有PCR后处理（无需走胶，拍照等） 高度自动化 定性：单数据点测定 定量：多数据点测定 能做基因分型及SNP鉴定
抑癌基因(tumor suppressor genes)：指一类基因，
其产物对细胞生长增殖起负调控的作用，并能潜在抑 制细胞的恶变。
白血病的分子机制
白血病的分子机制
增殖过度 分化阻断 凋亡受抑
Leabharlann Baidu
“二次打击”学说
D.Gary Gilliland Best Practice & Research Clinical Haematology.2003;16:409-417
PCR方法优点 快速 灵敏 特异
PCR方法缺点 假阳性 假阴性
白血病的分子检测
PCR：仅适用于染色体断裂点丛集于相对小
的范围内（<2kb），如T-ALL中SIL-TAL1。
RT-PCR：可用于染色体断裂点跨越很大的
区域的融合基因。
巢式RT-PCR：可显著提高反应的特异性，
增加扩增效率。
RQ-PCR：可定量扩增产物。 多重PCR：同管扩增多个目的片段。
白血病的分子检测——定量PCR
RQ-PCR（Real-time Quantitative PCR） 荧光标记扩增产物 荧光标记引物 特异性荧光标记探针 TaqMan探针、分子信标、杂交双探针 荧光染料直接结合扩增产物 SYBR Green I与DNA双链结合 动态监测荧光信号变化
TaqMan探针法
白血病的分子检测——定量PCR
RQ-PCR的检测系统： 该系统内置了96孔PCR仪，且在每个反应孔上
均有一个监测探头用于检测PCR反应管中的荧 光强度。平均每8-12秒就检测一次，以达到实 时检测的目的。
系统中的电脑系统同时不断地分析来自检测系 统的信息，不断计算每个反应管中的荧光强度， 并最终得到CT值。
白血病的分子检测
Southern blot Northern blot Western blot FISH PCR 测序 芯片
白血病的分子检测
PCR反应原理
白血病的分子检测
PCR理论方程
N = N0 x (1+E)n
N：扩增子数量 N0：起始模板数量
E：扩增效率 n：循环数
白血病的分子检测
RQ-PCR的操作流程
从细胞或组织中抽提DNA或RNA 用PCR或RT-PCR扩增特异片段 将PCR产物克隆到合适的载体上 体外转录成RNA片段（仅用于RNA样品） 纯化，定量和系列稀释质粒DNA或RNA 构建标准曲线（CT υ lgcopy）
样品的定量检测 校正样品基因拷贝数
白血病分子检测的临床应用
20~40%，在M2b中阳性率为90% 少见于M4和M1，极少见于MDS和骨髓增生综
合症
AML1-ETO+白血病细胞有一定程度的分化能 力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性 粒细胞，且对化疗反应较敏感
AML1-ETO+患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果 好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后 较其他AML亚型（M3除外）好
形态学上S型白血病细胞常为低分化的并 且这些患者可见继发细胞遗传学异常，V 型APL患者的白血病细胞体外对ATRA 的敏感度低
L+ 阴性 S+
PML-RARα
RT-PCR检测PML-RARα是敏感且特异的 APL诊断方法，还能用于治疗后MRD监 测。PML-RARα阳性提示的分子复发常 早于临床复发3-6个月，为临床采取进一 步治疗措施提供了保障
PML-RARα
t(15;17)(q22;q21)
98%M3患者 继t(15;17)之后，又先后发现4种M3特异的累及
RARα的变异性染色体易位：t(11;17)(q23;q21)， t(5;17)(q35;q21)，t(11;17)(q13;q21)以及 dup(17)(q21.3;q23)，分别产生PLZF-RARα， NPM-RARα，NuMA-RARα和STAT5b-RARα融 合基因
白血病的分子生物学检查对白血病诊断分 型及预后判断有以下几方面意义： 补充MIC检查的不足 发现新的亚型 监测白血病的微小残留病灶（MRD） 为研究白血病的发病机制打下基础
PCR方法检测MRD常用的分子标志
AML1-ETO
t(8;21)(q22;q22) 6~8%原发性AML，在M2中的阳性率为
白血病分子生物学
白血病的分子机制 白血病的分子检测 白血病分子检测的临床应用
白血病的分子机制
基因(gene)：合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所
必需的全部核酸序列。
癌基因(oncogene)：细胞或病毒中存在的，能诱导
正常细胞转化并使之获得新生物特征的基因。
癌基因活化的方式：
点突变 染色体重排 基因扩增
AML1- 阴性 ETO+
AML1-ETO
对初发患者进行t(8;21)和AML1-ETO融 合基因的检测对其预后判断及治疗方案 的制定相当重要
AML1-ETO定性结果不能用于评价患者 MRD情况
RQ-PCR能实时反映体内AML1-ETO水 平。连续定量AML1-ETO转录本水平可 判定有高复发风险的患者，以便及早治 疗干预以防血液学复发
•特异性高 •多重基因定量 •成本较高
SYBR Green I 法
•成本低 •最适合初步筛查 •熔解曲线功能 •无法多重检测 •无模板特异性 •灵敏度低
白血病的分子检测——定量PCR
白血病的分子检测——定量PCR
CT值：荧光信号有统计学意义显著增长 （穿过阈值线）时的循环次数
CT值与起始模板量成反比