标准全胚胎原位杂交qq方法

标准全胚胎原位杂交方法
Standard Whole-Mount in Situ Hybridization
试剂配制
10×PBS(1L pH 7.4)用MilliQ水稀释10倍后，高压灭菌使用
0.2M NaH2PO4113mL
0.2M Na2HPO4387mL
5M NaCl 200 mL
用MilliQ水定容至1000 mL
PBT：0.1% Tween-20/PBS （室温保存）配制后，不可高压
固定液：4%多聚甲醛（PFA）/PBS （使用时配制）
使用前，用PBS稀释20%的多聚甲醛（4℃保存）至4%，一周内使用
25%，50%，75%乙醇/PBT，室温保存
配制后室温放置一段时间，因该试剂可能有小气泡，最好不要马上使用
100%乙醇，室温保存
20μg/mL Proteinase K/PBT，使用时配制
Proteinase K分装-20℃冷冻保存，使用前，用PBT稀释，解冻后马上使用，冰箱中有1000*的稀释液。

甘氨酸有10*，现用现配。

预杂交液（50mL）
50%甲酰胺
5× SSC(pH7.0)
2%封闭剂
0.1% Tween20
0.1% CHAPS
1μg/mL酵母tRNA
5mM EDTA
50μg/mL肝素
RNA探针
DIG标记
SSCFS(Solution 1)因室温下会产生白色沉淀，须分装保温
50%甲酰胺
5× SSC(pH4.5)
1%SDS
如配制10ml： 5ml甲酰胺，2.5ml 20*sscPH4.5, 1ml 10%SDS, dd水补足。

Solution 25×SSC(pH7.0)/1% tween20
如40ml：10ml 20*SSC, 400ul 10%tween20, dd水补足。

Solution 3 2×SSC (pH7.0)/50% 甲酰胺
如10ml: 1ml 10%SDS, 1ml 20*SSC, 5ml 甲酰胺，dd水补足。

KTBT 40ml
50mM Tris-HCl (pH7.5) 2ml
150mM NaCl 1.2ml 5M NaCl
10mM KCl 400ul 1M KCl
0.1% Tween20 40ul dd水补足
封闭剂
用KTBT溶解1.5% Blocking Reagent
如1ml: KTBT 900ul, 100ul封闭剂。

Anti-DIG
原液用solution和NT buffer稀释5000倍. 冰箱中有直接使用的。

NTMT用时配制 50ml
0.1M NaCl 1ml 5M NaCl
0.1M Tris-HCl (pH9.5) 5ml 1M Tris7.5
50mM MgCl2 2.5ml 1M MgCl
0.1%Tween20 500ul
dd水补足
NTMT-PA(AP Buffer)用时配制此步可省略
0.1M NaCl
0.1M Tris-HCl (pH9.5)
50mM MgCl2
0.1%TritonX-100
5% PVA(70～100kD)
下述溶液用时配制，室温保存
5M NaCl
1M Tris-HCl (pH9.5)
1M MgCl2
10%TritonX-100
AP Buffer配制方法
PVA 2.5g
5M NaCl 1.0mL
1M Tris-HCl (pH9.5) 5.0mL
MilliQ水45 mL
90℃加热溶解PVA，室温下冷却
10% TritonX-100 0.5 mL
1M MgCl2 2.5 mL
缓慢搅拌，MilliQ水定容
染色液（NBT/BCIP）每1 mL AP Buffer中加入8 L NBT/BCIP 可用NTMT配NBT/BCIP溶液（-20℃保存）：NBT 75mg/70% Dimethyl formamide 1 mL
BCIP溶液（-20℃保存）：BCIP 50mg/70%Dimethyl formamide 1 mL
NBT
氯化硝基四氮唑蓝,硝基蓝四氮唑或硝基氯化四氮唑蓝,分子式C40H30Cl2N10O6,分子量817,65 g/mol, BCIP/NBT是碱性磷酸酯酶的常用底物。

在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。

也是一种很好的脂蛋白染色剂
过程
尽量都采用慢摇，小心不要剧烈！适当翻动小胚胎，防止小网印下痕迹，防止网上的脏东西粘在上面。

1、胚胎固定与脱水
a)4℃，2小时至一夜固定
b)弃液体，加入5分钟，重复两次
c)4℃，
25%乙醇/PBT 5分钟
50%乙醇/PBT 5分钟
75%乙醇/PBT 5分钟
100%乙醇/PBT 5分钟（×2）
然后可以-20℃保存
2、水饱和·蛋白酶K处理
a)按以下步骤进行水饱和等小胚胎沉到下面开始计时
75%乙醇/PBT 5分钟
50%乙醇/PBT 5分钟
25%乙醇/PBT 5分钟
PBT 5分钟
PBT 5分钟
b)加入2~20K/PBT，室温5~20分钟处理一般5min
大胚胎，12.5天以上的7min左右小孔中操作没过小胚胎即可作用时间可以镜检看外面的膜有毛刺或小气泡必须停止严格计时
c)立即放入2mg/mL甘氨酸/PBT溶液，5分钟，停止蛋白酶K反应，没过胚胎；
d)PBT洗净（×3次）
此时镜检一下，看看有无脏东西，气泡。

尽量除去，不要损害胚胎，但外层膜可以撕去。

3、杂交
捞出小胚胎，加入0.2mL预杂交液（用量根据胚胎大小而定），用2.0的EP管，68度1h 预杂交。

500 ng/mL65~70℃过夜
4、清洗·抗体反应·染色 5ml平皿操作。

a)回收杂交液（-20℃保存，可再使用）
b)吸出液体，加入保温的Solution 1，70℃，20分钟
c)，70℃，20-30分钟
d)70℃，20-30分钟
e)吸出液体，室温下用漂洗10分钟
f)吸出液体，加入封闭剂，1小时小孔操作
g)吸出液体，加入抗37度，1小时小孔操作
h)吸出液体，室温下用KTBT漂洗0.5小时（×2次）
i)吸出液体，用NTMT15分钟 2次
j)吸出液体，加入NTMT稀释的8ul/ml染色液，室温，遮光
5、停止染色·脱色·透明化
a)染色开始30分钟后，在显微镜下观察染色程度（每10分钟一次，1小时~4小时左
右）看到有的部位颜色特异性变得很深即可。

适当翻动胚胎，防止网格印上痕迹染
色不均匀。

b)PBT，停止染色
c)吸出液体，加入5分钟（×3次）
d)按以下顺序脱色
50%乙醇/PBT 5分钟
100%乙醇5~10分钟（镜下观察脱色情况）
50%乙醇/PBT 5分钟
PBT
e)按以下顺序透明化
25%甘油/PBT 5分钟
50%甘油/PBT 5分钟
(f)4。